FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

VERİLER

1. 
   Sonuçların uygulanması
   

Hayvanlarla ilgili veriler ayrı ayrı çizelge halinde sunulmalıdır. Deneysel birim hayvandır. Sayılan olgunlaşmamış eritrosit sayısı, mikroçekirdekli olgunlaşmamış eritrosit sayısı, ve toplam eritrositler arasından olgunlaşmamış olanların sayısı analiz edilen her bir hayvan için ayrı olarak listelenmelidir. Hayvanlar 4 hafta veya daha uzun süre süreki olarak muamele edildiklerinde eğer toplanmışsa, olgunlaşmış eritrosit verileri de ayrıca verilmelidir.Olgunlaşmamış eritrositlerin toplam eritrositlere oranı ve eğer uygulanabilir olduğu düşünülürse mikroçekirdekli eritrosit yüzdesi her bir hayvan için verilir. Eğer cinsiyetler arasında farklı cevaplar olduğuna dair hiç kanıt yoksa istatiksel analiz için her iki cinsiyetten elde edilen veriler birleştirilebilir.

2. 
   Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumlanması
   

Pozitif sonuç tayin etmek için artış mikroçekirdekli hücrelerin sayısındaki doza bağlı artış veya tek bir doz grubunda, tek bir örnek alma zamanında mikroçekirdekli hücrelerin sayısındaki net artış gibi bazı ölçütler vardır. Sonuçlar ilk önce biyolojik açıdan değerlendirilmelidir. İstatistiksel yöntemler, test sonuçlarını değerlendirirken yardımcı olarak kullanılabilir (8)(19). İstatiksel anlamlılık pozitif bir cevap için tek belirleyici etken olmamalıdır. Şüpheli sonuçlar ilave testlerle, tercihen deney koşullarının düzeltilmesiyle netleştirilmelidir.

Sonuçları yukarıdaki ölçütleri karşılamayan bir test maddesinin bu sistemde mutajenik olmadığı düşünülür.
Her ne kadar pek çok deney açıkça pozitif ya da negatif sonuçlar verecekse de, nadir durumlarda veri kümeleri test maddesinin aktifliği hakkında net bir karar verilmesine engel olacaktır. Sonuçlar deneyin tekrarlanma sayısından bağımsız olarak şüpheli ve belirsiz olabilir.
Mikroçekirdek testindeki pozitif sonuçlar maddenin kromozomal hasar veya test türünün eritroblastlarındaki mitotik aygıttaki hasarlar sonucu meydana gelen mikroçekirdekleri uyardığına işaret eder. Negatif sonuçlar, test koşulları içinde, test maddesinin test türünün olgunlaşmamış eritrositlerindeki mikroçekirdekler oluşturmadığına işaret eder. Test maddesinin veya metabolitinin genel dolaşıma veya belirli biçimde hedef dokuya (örneğin, sistemik toksisite) ulaşma olasılığı tartışılmalıdır.

3. 
   RAPORLAMA
   

1. 
   Test raporu
   

Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir:

Çözücü/Taşıyıcı

• 
  taşıyıcı seçimi için gerekçe;
  
• 
  eğer biliniyorsa, test maddesinin çözücü/taşıyıcı içindeki çözünürlüğü ve kararlılığı;
  

Test hayvanları:

• 
  kullanılan tür/ırk;
  
• 
  hayvanların sayısı, yaşı ve cinsiyeti;
  
• 
  kaynak, barınma koşulları, diyet. vs.;
  
• 
  testin başında her bir hayvanın ayrı ayrı ağırlığı, her bir grup için vücut ağırlığı aralığı, ortalama ve standart sapma dahildir;
  

Test koşulları:

• 
  pozitif ve negatif (taşıyıcı/çözücü) kontrolleri;
  
• 
  eğer yapıldıysa, aralık-bulma çalışmaları verileri;
  
• 
  doz seçimi için gerekçe;
  
• 
  test maddesi hazırlanmasıyla ilgili detaylar;
  
• 
  test maddesi uygulanmasıyla ilgili detaylar;
  
• 
  uygulama yolu için gerekçe;
  
• 
  eğer uygulanabiliyorsa, genel dolaşıma veya hedef dokuya ulaşan maddelerin doğruluğunu kanıtlamak için kullanılan yöntemler;
  
• 
  eğer uygulanabiliyorsa, diyet/içme suyu test maddesi konsantrasyonun (ppm) mevcut doza (mg/kg vücut ağırlığı/gün) çevrilmesi;
  
• 
  gıda ve su kalitesiyle ilgili detaylar;
  
• 
  muamele ve örnek alma planıyla ilgili detaylı tanım;
  
• 
  lam hazırlama yöntemleri;
  
• 
  toksisite ölçümü yöntemleri;
  
• 
  mikroçekirdekli olgunlaşmamış eritrosit sayma ölçütleri;
  
• 
  hayvan başına analiz edilen hücre sayısı;
  
• 
  çalışmaları pozitif, negatif ve belirsiz olarak ayırma ölçütleri.
  

Sonuçlar:

• 
  toksisite belirtileri;
  
• 
  olgunlaşmamış eritrositlerin toplam eritrosit sayısına oranı;
  
• 
  her bir hayvan için ayrı ayrı verilen mikroçekirdekli olgunlaşmamış eritrosit sayısı;
  
• 
  grup başına düşen mikroçekirdekli olgunlaşmamış eritrosit ortalama standart sapması;
  
• 
  uygun yerlerde, doz cevap ilişkisi;
  
• 
  istatistiksel analizler ve uygulanan yöntemler;
  
• 
  eş zamanlı ve geçmişe yönelik negatif kontrol verileri,
  
• 
  eş zamanlı pozitif kontrol verileri.
  

Sonuçların tartışılması.

Sonuçlar.

4. 
   KAYNAKLAR
   

1. 
   Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, 187-190.
   
2. 
   Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 9-15.
   
3. 
   Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123: 61-118.
   
4. 
   Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S.Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, 29-80.
   
5. 
   MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Eritrosit: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: “Developments in Science and Practice of Toxicology“, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, 555-558.
   
6. 
   MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res. 189: 103-112.
   
7. 
   MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E. (1990). The in vivo erythrocyte micronucleustest: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14: 513-522.
   
8. 
   Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, 245-249.
   
9. 
   The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Eritrosit by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, 83-98.
   
10. 
    The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Memeli Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan)(1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, 153-159.
    
11. 
    Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocytes Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, 293-304.
    
12. 
    Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalized sampling time of 30 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, 313-319.
    
13. 
    Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson- Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.
    
14. 
    Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the micronucleus Test. Mutation Res., 120, 241-247.
    
15. 
    MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Eritrosit Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, 269-275.
    
16. 
    Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989). The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, 91-104.
    
17. 
    Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocytes ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, 97-99.
    
18. 
    Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures.UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. CambridgeUniversity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
    
19. 
    Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
    

B. 13/14. MUTAJENİTE: BAKTERİ KULLANARAK TERS MUTASYON TESTİ

1. 
   YÖNTEM
   

Bu yöntem, OECD TG 471, Bakteriyel Ters Mutasyon Testi’ne (1997) eşdeğerdir.

1. 
   Giriş
   

Bakteriyel ters mutasyon testinde, bir ya da bir miktar DNA baz çiftinin yer değiştirmesi, eklenmesi ve silinmesi (delesyonu) gibi nokta mutasyonlarını tespit etmek için Salmonella typhimurium ve Escherichia coli’nin aminoasite ihtiyaç duyan suşları kullanılır. (1)(2)(3). Bakteriyel ters mutasyon testinin ilkesi, test suşlarındaki mutasyonları tersine çeviren mutasyonları tespit etmek ve bakterinin vücutta sentezlenemeyen amino asit sentezleme kabiliyetini geri kazandırmaktır. Başlangıçtaki hallerine dönen bakteriler, ebeveyn test suşları için gerekli olan amino asitin yokluğunda yetişebilme kabiliyetleriyle tespit edilirler.

Nokta mutasyonları, insanda pek çok genetik hastalığın nedenidir ve onkogenlerdeki (hücrelerin kanser hücresine dönüşmesine neden olan gen) ve somatik (bedensel) hücrelerin tümör baskılayıcı genlerindeki nokta mutasyonların, insanda ve deney hayvanlarındaki tümör oluşumlarında yer aldığına dair önemli kanıtlar vardır. Bakteriyel ters mutasyon testi hızlı, ucuz ve uygulama açısından kolaydır. Testte kullanılan suşların çoğunun çeşitli özellikleri vardır. Bu özellikler onları, başlangıç hallerine dönme yerlerindeki duyarlı DNA dizileri, büyük moleküllere karşı hücre geçirgenliğinin artması ve DNA onarım sistemlerinin uzaklaştırılması veya hataya eğilimli DNA onarım sisteminin geliştirilmesi dâhil, mutasyonları belirlemeleri için daha duyarlı kılar. Testte kullanılan suşların özgünlükleri, genotoksik maddelerle uyarılan mutasyon türleri hakkında faydalı bilgi sağlayabilir. Bakteriyal ters mutasyon testlerinde çok geniş bir çeşitlilikteki yapılar için sonuçlarına ait büyük bir veri tabanı mevcuttur ve uçucu bileşikler de dâhil farklı fizikokimyasal özelliklere sahip kimyasalları test etmek için iyice oturtulmuş yöntembilimler geliştirilmiştir.
Ayrıca bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

Ters mutasyon testi: Salmonella typhimurium ya da Escherichia coli’deki ters mutasyon testi aminoasidin dışardan alınmasına bağımlı olmayan suşlar üretmek için amino asite ihtiyaç duyan suşlarda (sırasıyla, histidin veya tritopan) mutasyonu belirler.

Baz çifti yer değiştirme mutajenleri, DNA’da baz değişikliklerine neden olan ajanlardır. Eski haline dönme (reversiyon) testinde bu değişiklik orijinal mutasyonun olduğu yerde veya bakteriyel genomdaki ikinci bir yerde meydana gelebilir.
Çerçeve kayması tipi (frameshift) mutajenleri: DNA’daki bir veya daha fazla baz çiftinin eklenmesine ya da kopmasına neden olarak RNA’da okunan yapıyı değiştiren ajanlardır.

3. 
   Başlangıç varsayımları
   

Bakteriyel ters mutasyon testinde prokaryotik hücreler kullanılır ki bu alım, metabolizma, kromozom yapısı ve DNA onarım mekanizması gibi etkenlerle memeli hücrelerinden farklılık gösterir. Yapay ortamda (in vitro) yürütülen testlerde genellikle dış kaynaklı metabolik aktivasyon kullanımı gereklidir. Yapay ortamda (In vitro) metabolik aktivasyon sistemleri canlı organizmada (in vivo) memeli koşullarına tamamen benzemez. Bu yüzden test, maddenin memelilerdeki mutajenik ve kanserojenik potansiyeli hakkında doğrudan bilgi sağlamaz.

Bakteriyel ters mutasyon testi yaygın olarak genotoksik (genetik olarak toksik) aktivitenin başlangıç taramalarında ve özellikle de nokta mutasyonları tetikleyen aktivitelerde uygulanır. Kapsamlı veri tabanı göstermiştir ki bu testte pozitif olan pek çok kimyasal ayrıca diğer testlerde de mutajenik aktivite gösterir. Bu testle tespit edilemeyen mutajenik ajanlarda vardır; bu eksiklik için sebepler metabolik aktivitedeki farklılıklar veya biyoyararlanım farklılıkları ve tayin edilen son noktanın özel doğasına atfedilebilir. Diğer taraftan bakteriyel ters mutasyon testinin duyarlılığını geliştiren etmenler mutajenik aktivite ön görülmesinde öncülük edebilirler.
Bakteriyel ters mutasyon testi, belli sınıftaki kimyasalların örneğin oldukça bakterisidal bileşiklerin (ör. Belli antibiyotikler) ve memeli hücresi replikasyon sistemiyle belirli olarak etkileştiği düşünülen veya bilinen maddelerin (ör. Bazı topoizomeraz inhibitörleri ve nükleozid eşleri) değerlendirilmesi için uygun olmayabilir. Böyle durumlarda memeli mutasyon testleri daha uygun olabilir.
Her ne kadar bu testte pozitif sonuç veren pek çok bileşik memelilerde kanserojense de ilişki kesin değildir. Bu, kimyasal sınıfa bağlıdır ve genotoksik olmayan veya bakteri hücrelerinde bulunmayan mekanizma(lar) gösterdikleri için bu test yöntemiyle tespit edilemeyen kanserojenler bulunmaktadır.

4. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Bakteriyal hücrelerin süspansiyonları dış metabolik aktivite sisteminin varlığında ve yokluğunda test maddesine maruz kalırlar. Plaka birleşmesi yönteminde bu süspansiyonlar, kaplayıcı agarla karıştırılır ve minimal ortama plakalanır. Ön inkübasyon yönteminde, muamele gören (jelatimsi bir madde) karışım inkübe edilir ve daha sonra minimal bir ortama plakalanmadan önce kaplayıcı bir agarla karıştırılır. Her iki teknik için de, inkübasyondan iki veya üç gün sonra, başlangıçtaki hallerine dönen koloniler sayılır ve çözücü kontrol plakalarındaki kendi kendine başlangıçtaki hallerine dönen koloni sayısıyla karşılaştırılır.

Bakteriyal ters mutasyon testini uygulamak için çeşitli prosedürler tanımlanmıştır. Bunların arasında en yaygın olarak kullanılanlar tabaka birleşme yöntemi (1)(2)(3)(4), ön inkübasyon yöntemi (2)(3)(5)(6)(7)(8), dalgalanma yöntemi (9)(10) ve süspansiyon yöntemidir (11). Gazların ve buharların test edilmesi için değişiklikler tanımlanmıştır (12).
Yöntemde tanımlanan işlemler öncelikle tabaka birleşme ve ön inkübasyon yöntemlerine uygundur. Metabolik aktivasyonla veya metabolik aktivasyonsuz yürütülen deneylerde, ikisi de kabul edilebilirdir. Bazı maddeler ön inkübasyon yöntemi kullanılarak, daha verimli şekilde belirlenebilirler. Bu maddeler, kısa zincirli alifatik nitrozaminler, iki değerlikli metaller, aldehitler, azo-boyaları ve diazo bileşikleri, pirolizidin alkoloidleri, allil bileşikleri ve nitro bileşiklerini içeren kimyasal sınıflara aittir (3).Ayrıca belli sınıflardaki mutajenlerin plaka birleşme yöntemi ve ön inkübasyon yöntemi gibi standart yöntemler kullanılarak her zaman tespit edilmediği bilinmektedir. Bunlar ‘özel durumlar’ olarak ele alınmalıdır ve böyle maddelerin tespit edilmesi için değişik yöntemlerin kullanılması şiddetle tavsiye edilmektedir. Bu ‘özel durumlar’ maddelerin tespit edilmesinde kullanılabilecek işlemlerin örnekleriyle birlikte şu şekilde tanımlanabilir: azo-boyaları ve diazo bileşikleri (3)(5)(6)(13), gazlar ve uçucu bileşikler (12)(14)(15)(16) ve glikozitler (17)(18). Standart yöntemden sapma olursa bilimsel olarak gerekçelendirilmelidir.

5. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

1. 
   Hazırlıklar
   

1. 
   Bakteri
   

Taze bakteri kültürleri sürekli artışın son evresine veya durağan evrenin başına kadar çoğaltılmalıdırlar (ml başına yaklaşık 10⁹ hücre). Durağan evrenin sonundaki kültürler kullanılmamalıdır. Deneyde kullanılan kültürlerin yüksek içerikte (titre) canlı bakteri içermesi esastır. Yüksek sayıda, gerek geçmişe dayalı büyüme eğrisi verileriyle gerek her bir yöntemde plakalama yöntemiyle tespit edilen yaşayabilir hücre sayısı tespit edilerek gösterilebilir.
Tavsiye edilen inkübasyon sıcaklığı 37°C’dir.
En az beş bakteri ırkı kullanılmalıdır. Bunlar S. Typhimurium’un, laboratuvarlar arasında güvenilir ve tekrar üretilebilir cevaplarının olduğu gösterilen dört ırkını kapsar (TA 1535; TA 1537 veya TA97a or TA97; TA98 ve TA100). Bu dört S. typhimurium ırkının, birincil başlangıç hallerine dönme yerinde GS(Guanin-Sitozin) baz çifti vardır ve belli yükseltgen mutajenleri, çapraz-bağlayıcı ajanları ve hidrazinleri tespit edemediği bilinmektedir. Böyle maddeler, birincil başlangıç hallerine dönme yerinde AT baz çifti bulunan E. coli WP2 veya S. typhimurium TA102 (19) suşlarıyla tespit edilebilir. Bu sebeple tavsiye edilen suşların kombinasyonları aşağıdaki gibidir:

• 
  S. typhimurium TA1535, ve
  

• 
  S. typhimurium TA1537 veya TA97 veya TA97a, ve
  

• 
  S. typhimurium TA98, ve
  

• 
  S. typhimurium TA100, ve
  

• 
  E. coli WP2 uvrA, veya E. coli WP2 uvrA (pKM101), veya S. typhimurium TA102.
  

Çapraz bağlı mutajenleri tespit etmek için, E. coli'nin TA102 ırkının dahil edilmesi veya DNA onarma yetkinliği olan suşlarının eklenmesi [ör. E. coli WP2 veya E. coli WP2 (pKM101)] tercih edilebilir.

Stok kültür karışımı, işaretleyici doğrulama ve saklama için yerleşik işlemler kullanılmalıdır. Büyüme için amino asit gereksinimi her bir donmuş kültür karışımı (S. typhimurium suşları için histidin ve E. coli suşları için triptofan) için belirtilmelidir. Diğer fenotipik karakteristikler benzer olarak kontrol edilmelidir, şöyle ki: Uygun yerlerde R-faktör plasmidlerinin [ör. ampisilline dirençli suşlar TA98, TA100 ve TA97a veya TA97, WP2 uvrA ve WP2 uvrA (pKM101) ve TA102 ırkında ampisillin + tetrasiklin direnci] varlığı ya da yokluğu; karakteristik mutasyonların varlığı (ör. kristal menekşeye hassasiyet nedeniyle S.typhimurium’da rfa mutasyonu ve E. Coli’de uvrA mutasyonu veya morötesi ışığa duyarlılık nedeniyle S.typhimurium’da uvrB mutasyonu) (2)(3). Suşlar ayrıca laboratuvardan elde edilmiş geçmişe dayalı verilerlerden beklenen frekans aralığındaki veya tercihen literatürde rapor edilen aralıktaki kendi kendine olan başlangıçtaki hallerine dönen koloni plaka sayımlarını sağlamalıdır.

2. 
   Ortam
   

Az miktarda uygun bir agar (Vogel-Bonner minimal ortam E and glukoz içeren) ve hücrenin ölmesini sağlayan, histidin ve biyotin veya triptofan içeren bir kaplayıcı agar kullanılır (1)(2)(9).

3. 
   Metabolik aktivasyon
   

Bakteri test maddesine metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda maruz kalmalıdırlar. En yaygın kullanılan sistem, Aroclor 1254 (1)(2) veya fenobarbitonla ß–naftoflavon karışımı (18)(20)(21) enzim uyarıcı maddelerle muamele edilen kemirgenlerin karaciğerlerinden elde edilen kofaktör-destekli post-mitokondriyal kısmıdır (S9). Post-mitokondriyal kısım, S9 karışımında genellikle nihai test ortamının %5–30 v/v, konsantrasyon aralığında kullanılır. Metabolik aktivasyon sisteminin koşulları test edilen kimyasalın sınıfına bağlı olabilir. Bazı durumlarda post-mitokondriyal kısmın birden fazla konsantrasyonunun kullanılması uygun olabilir. Azo-boyaları ve diazo-bileşikleri için, indirgen bir metabolik aktivasyon sisteminin kullanılması daha uygun olabilir (6)(13).

4. 
   Test maddesi/Hazırlık
   

Bakteri muamele edilmeden önce uygunsa, katı test maddeleri uygun çözüler veya taşıyıcılar içinde çözünmeli veya askıda kalmalı ve seyreltilmelidir. Sıvı test maddeleri muamele edilmeden önce test sistemine doğrudan eklenebilirler veya seyreltilebilirler. Kararlılığıyla ilgili veriler test maddesinin saklanmasının uygun olduğunu göstermedikçe taze hazırlanmış olanları uygulanmalıdır.

Çözücü/taşıyıcı, test maddesiyle kimyasal reaksiyona girmemeli ve bakterilerin hayatta kalmalarıyla ve S9 aktivitesiyle uyumlu olmalıdır (22). Eğer çok iyi bilinen çözücüler/taşıyıcılar dışındakiler kullanılırsa, içerikleri uyumlu olduklarını gösteren verilerle desteklenmelidir. Mümkün olan yerlerde, sulu çözelti/taşıyıcı kullanımının ilk önce göz önünde bulundurulması tavsiye edilir. Suda kararsız olan maddeler test edilirken, kullanılan organik çözeltilerde su olmamalıdır.

2. 
   Test koşulları
   

1. 
   Test suşları (Bakınız 1.5.1.1)
   

2. 
   Maruz kalma konsantrasyonu
   

Kullanılacak test maddesinin en yüksek miktarını belirlerken dikkate alınması gereken konsantrasyon faktörleri arasında sitotoksisite ve son muamele karışımının çözünürlüğü vardır.

Toksisite ve çözünmezliğin bir ön deneyle belirlenmesi faydalı olabilir. Sitotoksisite (hücreler için toksik olan madde) başlangıçtaki hallerine dönen koloni sayısındaki düşüş , temel düzeyde temizleme veya azalma veya muamele edilen kültürlerin hayatta kalma yüzdesi ile belirlenebilir. Bir maddenin sitotoksisitesi metabolik aktivasyon sistemlerinin varlığında değişebilir. Maddenin çözünmezliği mevcut test koşulları altında ve çıplak gözle görünür şekilde, son karışımdaki çökelti olarak değerlendirilmelidir.
Çözünebilen sitotoksik olmayan maddeler için tavsiye edilen maksimum test konsantrasyonu 5 mg/ veya 5 µl/plaka’dır. 5 mg/ plaka veya 5 µl/plaka’da çözünemeyen sitotoksik olmayan maddeler için, test edilen bir veya daha fazla konsantrasyon son muamele karışımında çözünebilir olmamalıdır. 5 µl/plaka veya 5 mg/ plaka değerlerinin altında zaten sitotoksik olan test maddeleri sitotoksik konsantrasyona kadar test edilmelidir. Çökelti, skorlamaya mani olmamalıdır.
Test maddesine ait en az beş farklı analiz edilebilir konsantrasyon, bir başlangıç deneyi için test noktaları arasında yaklaşık yarım log (ör. 10) aralıklarla kullanılmalıdır. Konsantrasyon-etki ilişkisi araştırılırken daha küçük aralıklar kullanılması daha uygun olabilir. Önemli miktarda mutajenik safsızlık içeren maddeler değerlendirilirken, 5 mg/plaka veya 5 μl/plaka üzerindeki konsantrasyonlarda test uygulamasının yapılması üzerinde durulabilir.

3. 
   Negatif ve pozitif kontroller
   

Eş zamanlı, ırka-özgü, pozitif ve negatif (çözücü veya taşıyıcı) kontroller, metabolik aktivasyonun hem varlığında hem de yokluğunda her bir deneyde de yer almalıdır. Her bir yöntemin etkili şekilde yürütülmesini sağlayan pozitif kontrol konsantrasyonları seçilmelidir. Metabolik aktivasyon sisteminin uygulandığı yöntemler için pozitif konrol referans maddesi/maddeleri kullanılan bakteri suşlarının türüne dayanarak seçilmelidir.

Aşağıdaki maddeler metabolik aktivasyonla yürütülen yöntem için uygun olan pozitif kontrol maddelerine örneklerdir:

CAS Numarası	EINECS Numarası	İsimler
781-43-1	212-308-4	9,10-dimetilantrasen
57-97-6	200-359-5	7,12-dimetilbenz[a]antrasen
50-32-8	200-028-5	Benzo[a]piren
613-13-8	210-330-9	2-aminoantrasen
50-18-0		siklofosfamid
6055-19-2	200-015-4	siklofosfamidmonohidrat

Aşağıdaki madde indirgeyici metabolik aktivasyon metodu için uygun olan pozitif kontroldur.

CAS Numarası	EINECS Numarası	İsimler
573-58-0	209-358-4	Kongo kırmızısı

2–Aminoantrasen, S9 karışımı etkisinin tek başına belirteci olarak kullanılmamalıdır. 2-aminoantrasen kullanılırsa, her bir S9 serisi ayrıca mikrozomal enzimlerle sağlanan metabolik aktivasyona ihtiyaç duyan bir mutajenle (örn. benzo[a]piren, dimethilbenzantrasen) karakterize edilmelidir.

Aşağıdaki maddeler, dış metabolik aktivasyon sistemi olmadan yürütülen analizler için kullanabilecek ırka özgü pozitif kontrollere örnektir:

CAS numarası	EINECS numarası	İsim	Suş
26628-22-8	247-852-1	sodyum azid	TA 1535 ve TA 100
607-57-8	210-138-5	2-nitrofloren	TA 98
90-45-9	201-995-6	9-aminoakridin	TA 1537, TA 97 ve TA 97a
17070-45-0	241-129-4	ICR 191	TA 1537, TA 97 ve TA 97a
80-15-9	201-254-7	kümen hidroperoksit	TA 102
50-07-7	200-008-6	mitomisin C	WP2 uvrA ve TA102
70-25-7	200-730-1	N-etil-N-nitro-N-nitrozoguanidin	WP2, WP2uvrA ve WP2uvrA(pKM101)
56-57-5	200-281-1	4-nitrokinolin-1-oksit	WP2, WP2uvrA ve WP2uvrA(pKM101)
3688-53-7		furilfuramid (AF2)	Plazmid içeren suşlar

Diğer uygun pozitif kontrol referans maddeleri kullanılabilir. Mevcut olduğu durumlarda, kimyasal sınıfla ilişkili pozitif kontrol kimyasallarının kullanımı düşünülmelidir.

Test maddesi olmadan, sadece çözücü veya taşıyıcı içeren farklı işlem gruplarıyla aynı şekilde muamele edilecek olan negatif kontroller yer almalıdır.Ek olarak, geçmişe yönelik kontrol verileri seçilen çözücüyle sağlığa zararlı veya mutajenik etkilerin uyarıldığını göstermediği sürece muamele edilmemiş kontroller de kullanılmalıdır.

3. 
   İşlem
   

Tabaka birleşme yöntemi için (1)(2)(3)(4), metabolik aktivasyonsuz genellikle 0.05 ml veya 0.1 ml test çözeltileri, 0.1 ml taze bakteri kültürü ((yaklaşık 10⁸ yaşayabilir hücre içerir) ve 0.5 ml steril tampon 2.0 ml kaplayıcı agarla karıştırılır. Metabolik aktivasyonlu yöntem için, genellikle uygun miktarda post-mitokondriyel fraksiyon içeren (metabolik aktivasyon karışımında %5-30 v/v aralığında) 0.5 ml’lik metabolik aktivasyon karışımı kaplayıcı agarla(2.0 ml), bakteri ve test maddesi/test çözeltisiyle karıştırılır. Her bir tüpün içeriği karıştırılır ve minimal agar plakasının üzerine dökülür. Kaplayıcı agarın inkübasyondan önce katılaşması sağlanır.

Ön inkübasyon yöntemi için (2)(3)(5)(6), test maddesi/test çözeltisi test ırkıyla (yaklaşık 10⁸ yaşayabilir hücre içerir) ve steril tampon veya metabolik aktivasyon sistemiyle (0.5 ml) kaplayıcı agarla karıştırılmadan ve minimal agar, plakaya dökülmeden önce genelde 20 veya daha fazla dakika 30-37°C’de ön inkübasyona tabi tutulur. Genellikle, 0.05 veya 0.1 ml test maddesi/test çözeltisi, 0.1 ml bakteri ve 0.5 ml S9-karışım veya steril tampon, 2.0 ml kaplayıcı agarla karıştırılır. Atüpler preinkübasyon sırasında çalkalayıcı kullanılarak havalandırılmalıdır.
Uygun bir değişim tahmini için her dozda üçlü plakalama kullanılmalıdır. Bilimsel gerekçe mevcutsa ikili plaka da kabul edilebilir. Arasıra meydana gelen plaka kaybı yöntemi geçersiz kılmaz.
Gazlar veya uçucu maddeler, kapaklı kaplardaki uygun yöntemlerle test edilmelidir (12)(14)(15)(16).

4. 
   İnkübasyon
   

Yöntemde kullanılacak tüm plakalar 37°C’de 48-72 saat inkübe edilmelidir. İnkübasyon süresi sonunda plaka başına başlangıçtaki hallerine dönen koloni sayılır.

2.