FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

BÖLÜM C

EKOTOKSİKOLOJİK VE ÇEVREYE ZARARLI ETKİLERİN TAYİNİ İÇİN YÖNTEMLER

C.1	BALIK İÇİN AKUT TOKSİSİTE
C.2	DAPHNIA SP. AKUT HAREKETSİZLEŞTİRME TESTİ
C.3	TATLI SU YOSUNLARI VE SİYANOBAKTERİ BÜYÜME ENGELLEME TESTİ
C.4	“KOLAY” BİYOBOZUNABİLİRLİK TESPİTİ
	BÖLÜM I. GENEL DEĞERLENDİRMELER
	BÖLÜM II. DOC DIE-AWAY (Kaybolum) TESTİ (Yöntem C.4-A)
	BÖLÜM III. DEĞİŞTİRİLMİŞ OECD TARAMA TESTİ (Yöntem C.4-B)
	BÖLÜM IV. CO2 DEĞİŞİM TESTİ (Yöntem C.4-C) BÖLÜM V. MANOMETRİK RESPİROMETRE TESTİ (Yöntem C.4-D)
	BÖLÜM VI. KAPALI ŞİŞE TESTİ ( Yöntem C.4-E)
	BÖLÜM VII. M.I.T.I TESTİ (Yöntem C.4-F)
C.5	BOZUNMA- BİYOKİMYASAL OKSİJEN İHTİYACI
C.6	BOZUNMA- KİMYASAL OKSİJEN İHTİYACI
C.7	BOZUNMA- pH’NIN FONKSİYONU OLARAK ABİYOTİK BOZUNMA HİDROLİZİ
C.8	TOPRAK SOLUCANLARININ TOKSİSİTESİ
C.9	BİYOBOZUNMA - ZAHN-WELLENS TESTİ
C.10	BİYOBOZUNMA - AKTİF ÇAMUR BENZETİM TESTİ
C.11	BİYOBOZUNMA - AKTİF ÇAMUR SOLUNUM İNHİBİSYON TESTİ
C.12	BİYOBOZUNMA - DEĞİŞTİRİLMİŞ SCAS TESTİ
C.13	BİYOKONSANTRASYON - İÇ-AKIŞ BALIK TESTİ
C.14	YAVRU BALIK BÜYÜME TESTİ
C.15	BALIK, EMBRİYO ÜZERİNDE KISA DÖNEMLİ TOKSİSİTE VE YAVRU BALIK EVRELERİ
C.16	BAL ARILARI-AKUT ORAL TOKSİSİTE TESTİ
C.17	BAL ARILARI-AKUT TEMAS TOKSİSİTE TESTİ
C.18	KESİKLİ DENGE YÖNTEMİ KULLANARAK ADSORPSİYON/DESORPSİYON
C.19	YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC) KULLANARAK TOPRAKTA VE KANALİZASYON ÇAMURUNDA ADSORPSİYON KATSAYISI (Koc) HESAPLANMASI
C.20	DAPHNIA MAGNA ÜREME TESTİ
C.21	TOPRAK MİKROORGANİZMALARI: AZOT DÖNÜŞÜM TESTİ
C.22	TOPRAK MİKROORGANİZMALARI: KARBON DÖNÜŞÜM TESTİ
C.23	TOPRAK İÇİNDE AEROBİK VE ANAEROBİK DÖNÜŞÜM
C.24	SULU TORTU SİSTEMLERİNDE AEROBİK VE ANAEROBİK DÖNÜŞÜM
C.25	YÜZEY SULARINDA AEROBİK MİNERALİZASYON — BİYOBOZUNMA TESTİ SİMÜLASYONU
C.26	LEMNA SP. BÜYÜME YAVAŞLATMA TESTİ

C.1 BALIK İÇİN AKUT TOKSİSİTE

1. 
   YÖNTEM
   

1. 
   Giriş
   

Bu testin amacı temiz sulardaki balıklara geçebilecek maddelerin akut (ani) ölümcül toksisitesini belirlemektir. Test süresince test maddesikonsantrasyondeğerlerinin tatmin edici ölçüde sabit olmasını güvence altına almak için, en uygun test yönteminin (statik, yarı statik veya akıcı) seçilmesine yardımcı olmak amacıyla maddenin suda çözünürlüğü, buhar basıncı, kimyasal kararlılığı, bozunma sabitleri ve biyolojik olarak bozunabilirliği ile ilgili bilgilere mümkün olduğunca sahip olunması arzu edilir.

Testin planlanmasında ve elde edilen sonuçların yorumlanmasında ek bilgilerde (örneğin; yapısal formül, saflık derecesi, doğası ve belirli safsızlıkların yüzdesi, katkı maddeleri miktarları, n-oktanol/su dağılım katsayısı) göz önünde bulundurulmalıdır.

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

Akut toksisite maddeye maruz kaldıktan çok kısa zaman sonra ortaya çıkan organizmadaki fark edilirolumsuz etkilerdir. Mevcut testte, akut toksisite ortanca ölümcül toksisite(LC₅₀)şeklinde ifade edilmektedir. Bu konsantrasyon değeri maruz kalma süresi boyunca, su içinde yani test ortamında bulunan balıkların %50 sini öldürebilecek olan konsantrasyondur.

Tüm test maddelerin konsantrasyonları hacimde ağırlık cinsinden (Litre başına düşen miligram) verilmelidir. Bu konsantrasyonlar ağırlıktaki ağırlık (mg. kg^–1) cinsinden de verilebilir.

3. 
   Referans maddeler
   

Laboratuar test koşulları altında test edilen türlerin tepkilerininbelirgin birşekilde değişmediğinin gösterilmesi anlamındareferans madde ile test yapılabilir.

Bu test için herhangi bir madde belirtilmemiştir.

4. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Litre başına 100 mg’da, LC₅₀ ‘nin bu konsantrasyondan daha büyük olduğunu göstermek için bir sınır testi yapılabilir.

Balıklar, çeşitli konsantrasyonlarda suya eklenen test maddesine 96 saat boyunca maruz bırakılır. Ölü sayıları en az 24 saat aralıklarla kaydedilir ve balıkların % 50 ‘sini öldüren konsantrasyon (LC₅₀) her bir gözlem zamanında hesaplanır(mümkünse).

5. 
   Kalite kriterleri
   

Kalite ölçütü, hem tüm test yöntemine hem de kadar sınır testine uygulanmalıdır.

Kontrollerdeki ölü sayısı test sonu itibariyle % 10’u (veya, eğer 10’dan az balık kullanıldıysa, 1 balık) aşmamalıdır.
Çözünmüş oksijen konsantrasyonu, baştan sona kadar hava-doygunluk değerinin% 60 ‘ından daha fazla olmalıdır.
Test maddesi konsantrasyonları test süresi boyunca başlangıç konsantrasyonlarının %80'i oranındakorunmalıdır.

Test ortamında kolayca çözünenve kararlı çözeltiler oluşturan, örneğin belirgin miktarda buharlaşmayan, bozunmayan, hidroliz olmayan veya adsorplanmayan maddelerin başlangıç konsantrasyonları tanımlanmış (nominal) konsantrasyonlara eşitalınabilir.Konsantrasyonların, test boyunca korunduğunu ve kalite kriterinin sağlandığını gösteren kanıtlar sunulmalıdır.

Bu maddeler için:

1. 
   Test ortamında az çözünürlüğü olanlar, veya
   
2. 
   Kararlı emülsüyon ve dağılım oluşturma yeteneğine sahip olanlar, veya
   
3. 
   Sulu çözeltilerde kararlı olmayanlar,
   

Başlangıç konsantrasyonları testin başındaki çözeltide ölçülen( ya da bu teknik olarak mümkün değil ise, su kolonunda ölçülen) konsantrasyonları olarak alınmalıdır. Konsantrasyon, dengeleme periyodundan sonra ancak balık testinin başlangıcından önce belirlenmelidir.
Bu koşulların herhangi birinde, test süresince maruz kalınan gerçek konsantrasyonları ya da karşılaşılan kalite kriterini teyit etmek için ilave ölçümler yapılmalıdır.
pH bir birimden fazla değişmemelidir.

6. 
   Test yöntemlerinin tanımlanması
   

Üç çeşit işlem kullanılabilir:

Statik test:

Test çözeltisi akışının meydana gelmediği toksisite testi. (çözeltiler test süresi boyunca değiştirilmeden kalır)

Yarı-Statik test:

Test çözeltisi akışının olmadığı fakat test çözeltisinin uzun zaman aralıklarında (örneğin 24 saatte bir) düzenli olarak kısım kısım yenilendiği testtir.

Akış yollu test:

Test odalarında suyun devamlı yenilendiği testtir. Test edilen kimyasal, yenilenen su ile birlikte test ortamına aktarılır.

1. 
   Reaktifler
   

1. 
   Test maddelerinin çözeltileri
   

İstenen konsantrasyonda stok çözeltiler, maddelerin, 1.6.1.2’ de açıklanan su ya da iyonlardan arındırılmış su içerisinde çözülmesi ile hazırlanılır.

Seçilen test konsantrasyonları stok çözeltilerin seyreltilmesiyle hazırlanılır. Eğer yüksek konsantrasyonlertest edilirse, madde doğrudan seyreltme suyu içerisinde çözülebilir.
Genellikle maddeler sadece çözünürlük sınırına kadar test edilmelidir. Bazı maddeler için (örneğin suda düşük çözünebilme yeteneğine, yüksek P_OW değerine, ya da sudaki doğru çözeltiden ziyade kararlı dispersiyon biçimine sahip), maksimum çözülebilir ya da kararlı konsantrasyonun elde edilmesini sağlamak için maddenin çözünürlük sınırlarının üzerinde bir konsantrasyonda test yürütmek kabul edilebilir. Bununla birlikte, aksi olmadıkça bu konsantrasyonun test sistemine zarar vermeyeceği hususu önemlidir. (örneğin maddenin su yüzeyindekifilminin suyun oksijenlenmesini önlemesi vs.)
Ultrasonik dağılma, organik çözücüler, emülsiyon yapıcılar veya dağıtıcılar suda az çözünürlüğe sahip maddelerin stok çözeltilerinin hazırlanmasında ya da test ortamında bu maddelerin dağılmasına yardımcı olmak için, birer yardımcı olarak kullanılabilirler. Bu tip yardımcı maddeler kullanıldığı zaman, tüm test konsantrasyonları aynı miktarda yardımcı madde içermeli ve ek olarak kontrol balığı test serilerinde kullanıldığı gibi yardımcı maddenin benzerkonsantrasyonuna maruz bırakılmalıdır. Bu tip yardımcıların konsantrasyonları olabildiğince azaltılmalıdır ama test ortamında hiçbir durumda litre başına 100 mg’ı aşmamalıdır.
Test, pH ayarlaması yapılmadan yürütülmelidir. Eğer pH da belirgin birdeğişimin kanıtı var ise, pH ayarlaması ile testin tekrar edilmesi ve sonuçların rapor edilmesi önerilir. Bu durumda, stok çözeltinin pH değeri, çok özel bir neden olmadıkça seyreltme suyunun pH değerine göre ayarlanmalıdır. Bu amaç için HCl ve NaOH tercih edilmelidir. Bu pH ayarlaması, stok çözeltide bulunan test maddesinin konsantrasyonunda belirgin bir değişiklik olmayacak şekilde yapılmalıdır. Eğer ayarlama ile test maddesinin herhangi bir kimyasal reaksiyonuna veya fiziksel olarak çökelmesine sebep olunuyorsa bu rapor edilmelidir.

2. 
   Suyun kullanım süresi ve seyreltilmesi
   

Sukaynağı(potansiyel olarak zararlı konsantrasyonlardaki klor, ağır metaller ve diğer maddeler tarafından kirletilmemiş) olarak, iyi-kalitede doğal su ya da yeniden oluşturulmuş (Bakınız EK-I) su kullanılabilir. Toplam sertliği litre başına (CaCO₃ olarak) 10 ve 250 mg arasında olan ve pH’ sı 6,0 dan 8,5 a kadar olan sular tercih edilir.

2. 
   Düzenek
   

Tüm düzenek kimyasal olarak tepkimeye girmeyen(inert)maddelerden yapılmalıdır.

• 
  otomatik seyreltme sistemi (akış testi için),
  
• 
  oksijen metre,
  
• 
  suyun sertliğinin belirlenmesi için araç ve gereçler,
  
• 
  pH metre,
  
• 
  sıcaklık kontrolü için uygun düzenek.
  

3. 
   Test balığı
   

Balık sağlıklı olmalı ve gözle görülebilir herhangi bir kusuru olmamalıdır.

Kullanılan türler, bütün bir yıl boyunca bulunabilme, bakım kolaylığı, teste uygunluk, kimyasallara olan bağıl duyarlılık, herhangi bir ekonomik, biyolojik veya ekolojik faktör taşıma, gibi pratik kriterler temeline göre seçilmelidir. Elde edilen verilerin mevcut uluslararası uyumlu vekarşılaştırılabilir olması gibigereksinimlerde balık türlerini seçerken akıldan çıkarılmamalıdır.
Testin yürütülmesi için tavsiye edilen balık türlerinin listesi EK-II’ de verilmektedir; Zebra balığı ve Gökkuşağı alabalığı tercih edilen türlerdir.

1. 
   Barındırma
   

Test balığı birbirine yakın boy ve yaşa sahip mevcut balık stokundan seçilmelidir. Balık en az 12 gün aşağıda belirtilen koşullarda tutulmuş olmalıdır:

Yükleme:

Sisteme (yeniden sirkülasyonlu veya akış yollu) ve balık türlerine uygun,

Su:

Bakınız 1.6.1.2,

Işık:

Günlük olarak 12 ila 16 saat arası aydınlatma,

Çözünmüş oksijen konsantrasyonu:

Hava-doygunluk değerinin en az % 80’ i,

Besleme:

Teste başlamadan 24 saat önce durdurulmak suretiyle haftada üç kez veya günlük,

2. 
   Ölüm oranı
   

İşlemin başlatılmasını takiben 48 saat sonra ölümler kayıt edilir ve şu ölçütler uygulanır:

• 
  yedi günde toplam sayının(populasyonun) % 10 ‘undan fazlası:
  

Serinin reddedilmesi

• 
  toplam sayının (populasyonun) % 5 ve 10’u arası:
  

çalışma süresi fazladan 7 gün daha devam ettirilir, eğer daha fazla ölüm gerçekleşmezse çalışma gurubu kabul edilebilirdir, aksi takdirde reddedilmelidir.

• 
  toplam sayının(populasyonun) % 5’ inden az:
  

Seri kabul edilir.

4. 
   Alıştırma
   

Bütün balıklar kullanılmadan en az 7 gün önce başlayarak testte kullanılacak aynı kalite ve sıcaklıktaki suya maruz bırakılmalıdır.

5. 
   Testin performansı
   

Ana testte kullanılacak konsantrasyon aralığı ile ilgili bilgi elde etmek amacıylanihai testten öncebir aralık belirleme testi yapılabilir.

Test serisine ek olarak kontrollerden biri test maddesi olmadan yürütülür, yardımcı test maddesi kullanılması durumunda bir diğer kontrolde yardımcı test maddesi ile yürütülür.
Test bileşiğinin fiziksel ve kimyasal özelliklerine bağlı olarak, kalite ölçütlerini yerine getirmek için uygun statik, yarı-statik veya akış-yollu test yöntemi seçilmelidir.
Balıklar aşağıda belirtildiği şekilde maddeye maruz bırakılmalıdır:

• 
  süre: 96 saat
  
• 
  hayvan sayısı: konsantrasyon başına en az 7
  
• 
  tanklar: yükleme gereksinimlerine bağlı olarak uygun kapasitede
  
• 
  yükleme: statik ve yarı-statik testler için litre başına en fazla 1 gtavsiye edilir. Akış-yollu sistemler için daha yüksek yüklemeler kabul edilebilirdir
  
• 
  test konsantrasyonu: 2,2 yi geçmeyecek sabit bir faktör ile değişen en az 5 farklı konsantrasyonla ve mümkün olduğu kadar %100 -0 ölüm oranı aralığını kapsayacak şekilde.
  
• 
  su: Bakınız 1.6.1.2,
  
• 
  ışık: günlük olarak 12 ile 16 saat arası aydınlatma,
  
• 
  sıcaklık: türlere uygun biçimde (EK-II) fakat herbir test için ±1 °C olacak şekilde,
  
• 
  çözünmüş oksijen konsantrasyonu: seçilen sıcaklık değeri için hava-doygunluk değerinin % 60 ‘ından az olmayacak şekilde,
  
• 
  besleme: yok.
  

Balıklar ilk 2 ile 4 saat arası geçtikten sonra ve en az 24 saatlik aralarda incelenir. Kuyruk saplarına dokunulduğunda herhangi bir reaksiyon yoksa ve hiçbir solungaç hareketi görülmüyorsa balıkların öldüğüne kanaat getirilir.

Ölümler kaydedildiğinde ve gözlendiğinde ölü balıklar dışarı çıkarılır. Kayıtlar görünür anomalileri (örneğin, dengenin kaybolması, yüzme davranışındaki değişiklikler, solunumsal fonksiyonlar, pigmentleşme vs.) içerecek şekilde tutulmalıdır.
pH, çözünmüş oksijen miktarı ve sıcaklık ölçümleri günlük olarak yapılmalıdır.
Sınır testi
LC_5o ‘nin bu konsantrasyondan yüksek olduğunu göstermek için, bu test yönteminda tanımlanan işlem kullanarak litre başına 100 mg dasınır testi yapılabilir.

Eğer maddenin doğasına bağlı olarak test suyunda litre başına 100 mg konsantrasyona ulaşılamazsa limit testi kullanılan ortam (1.6.1.1 bölümüne bakınız) içindeki maddenin (veya kararlı bir dağılım oluşturacak maksimum çöznürlükte) çözünürlüğüne eşit konsantrasyonda gerçekleştirilmelidir.

Sınır değer testi kontrol veya kontrollerdeki sayı ile eşit olacak şekilde 7-10 balık kullanılarak yapılmalıdır. (Binom teorisine göre sıfır ölümle 10balık kullanıldığında, %99,9 güvenilirlikle LC₅₀ sınır testinde kullanılan konsantrasyondan daha büyüktür. 7,8 veya 9 balık ve ölüm olmadığında LC₅₀nin kullanılan konsantrasyondan fazla olduğu en az %99 güvenilirlikle sağlanır.) Eğer ölümler olursa, tam bir çalışma gerçekleştirilmelidir. Eğer öldürücü yan etkenler gözlemlenirse bunlar kaydedilmelidir.

2. 
   VERİLER VE DEĞERLENDİRME
   

Gözlemlerin kaydedildiği her süre için (24, 48, 72 ve 96 saat), konsantrasyone karşı her bir maruz kalma zamanındaki ölüm yüzdeleri, logaritmik-olasılık kağıdına çizilir.

Mümkün oldukça her gözlem zamanı için, LC₅₀ ve güven sınırları (p= 0,05) standard yöntemler kullanılarak hesaplanmalıdır; bu değerler 1 veya en fazla iki anlamlı rakama kadar yuvarlanmalıdır. (iki anlamlı rakama yuvarlama örneği: 173,5 için 170, 0,127 için 0,13, 1,21 için 1,2).
Konsantrasyon/yüzde tepki eğrisinin eğiminin LC₅₀’ nin hesaplanmasına izin vermeyecek şekilde dik olması durumunda, grafikten tahmini bir değer bulunması yeterlidir.
Oranları 2,2 olan iki ardışık konsantrasyonda, sırasıyla % 0 ve 100 ölüm oranı varsa; bu ikikonsantrasyon değerleri arasındaki aralık LC₅₀aralığını belirlemek için yeterlidir.
Test maddesinin kararlılığının ve homojenliğinin korunamadığı gözlemlenirse, bu rapor edilmeli ve sonuçlar yorumlanırken dikkatli olunmalıdır.

3. 
   RAPORLAMA
   

Test raporu mümkünse aşağıdaki bilgileri içermelidir:

• 
  test balığı hakkında bilgi (bilimsel ismi, ırkı, tedarikçisi, herhangi bir ön işlem, her test konsantrasyonunda kullanılan büyüklük ve sayı);
  
• 
  seyreltme suyu kaynağı, ana karakteristik kimyasal parametreler (pH, sertlik, sıcaklık);
  
• 
  su çözünürlüğü düşük olan maddelerin varlığı durumunda, stok ve test çözeltilerinin hazırlanış yöntemi;
  
• 
  herhangi bir şekilde yardımcı maddeler varsa konsantrasyonları;
  
• 
  kullanılan konsantrasyonların listesi ve test çözeltisi içinde test edilen kimyasalların konsantrasyonlarının kararlığı hakkında mümkün olan herhangi bir bilgi;
  
• 
  eğer kimyasal bir analiz gerçekleştirilmişse, kullanılan yöntemler ve elde edilen sonuçlar;
  
• 
  yapılmışsa sınır test sonuçları;
  
• 
  kullanılan test işleminin (statik, yarı-statik, dozlama oranı, akış-yollu hız, havalandırılıp havalandırılmadığı, balık yüklemesi vs.) seçimi ve detayları ile ilgili gerekçeler;
  
• 
  test gereçlerinin tanımlanması;
  
• 
  aydınlatma düzeni;
  
• 
  her 24 saat için test çözeltisinin çözünmüş oksijen konsantrasyoni, pH’ı ve sıcaklığı;
  
• 
  yerine getirilen kalite ölçütlerinin kanıtları;
  
• 
  tavsiye edilen her gözlem zamanında her konsantrasyonun ve kontrolun (ve eğer gerekiyorsa yardımcı madde ile kontrol) toplam ölüm oranını gösteren tablo;
  
• 
  test sonunda konsantrasyon/yüzde tepki eğrisi grafiği;
  
• 
  eğer mümkünse, tavsiye edilen her gözlem zamanlarında LC₅₀ değerleri;
  
• 
  LC50 değerlerinin bulunmasında kullanılan istatistiksel yöntemler;
  
• 
  eğer bir referans maddesi kullanılmışsa, elde edilen sonuçlar;
  
• 
  test süresi boyunca ölüme yol açmayan en yüksek test konsantrasyoni değerleri;
  
• 
  test süresi boyunca ölüme yol açan en düşük test konsantrasyonu.
  

4. 
   KAYNAKLAR
   

1. 
   OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of theCouncil C(81) 30 final andupdates.
   
2. 
   AFNOR -Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydaniorerio – Static and Flow Through methods -NFT 90-303 June 1985.
   
3. 
   AFNOR- Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri –Static and Flow -Through methods -NFT 90-305 June 1985.
   
4. 
   TS 6020 ISO 7346/1, /2 and /3 -Su Kalitesi- Maddelerin Tatlı Su Balığı [BrachydanioRerio Hamilton- Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] Üzerindeki Anlık Öldürücü Zehirliliğinin (Toksisitesinin) Tayini - Bölüm 1: Statik Metot, Bölüm 2: Yarı Statik Metot, ürekli Akış Metodu 
   
5. 
   Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien fur Probe nahme und Normung von Wasseruntersuchungs methoden -Part II 1974.
   
6. 
   DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (11) und 1 (15).
   
7. 
   JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.
   
8. 
   NEN 6506- Water –Bepalingvan de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.
   
9. 
   Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macro invertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.
   
10. 
    Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4 -78-012, January 1978.
    
11. 
    Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.
    
12. 
    Standard methods for the examination of water and wastewater, fourteen edition, APHA-AWWAWPCF,1975.
    
13. 
    Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March1979.
    
14. 
    Verfahrensvorschlag des Umwelt bundesamtes zum akutenFisch-Test. Rudolph, P. UndBoje, R. Okotoxikologie, Grundlagen fur die okotoxikologische Bewertungvon Umwelt chemikalien nach dem Chemikalien gesetz, ecomed 1986.
    
15. 
    Litchfield, J. T .andWilcoxon, F., A simplified methodfor evaluating doseeffects experiments, J.Pharm, tExp. Therap., 19 49, vol. 96,99.
    
16. 
    Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.
    
17. 
    Sprague, J .B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity.WaterRes., 1969, vol. 3,793-821.
    
18. 
    Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results.WaterRes. 1970, vol. 4, 3-32.
    
19. 
    Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation(editedby F.I. Mayerand J.L. Hamelink). American Society forTestingandMaterials, ASTMSTP 634,1977, 65-84.
    
20. 
    Stephan, C.E.,Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. And Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.