2. Specii de drojdii utilizate în procesele biotehnologice

Densitatea celulară finală a fost exprimată prin numărul de celule/ml (×10⁸), obţinută după 48 de ore de cultivare în flacoane. Rata de dezvoltare pe lactoză este destul de înaltă, substraturile respiratorii fiind o excelentă sursă de carbon pentru dezvoltare..

Pentru studiile de rutină din laboratoare, condiţiile de cultură de bază sunt aceleaşi, în general ca cele utilizate pentru Saccharomyces cerevisiae. Mediul complet conţine 1% extract de drojdie, 1% peptonă suplimentată cu o sursă de carbon (2% glucoză). Mediul minimal de bază este compus din 0,67% azot provenit din aminoacizi de drojdie, suplimentat cu surse de carbon. Substraturile respiratorii utilizate cuprind glicerol, DL – lactat, etanol sau succinat. Mediul specific ME agar (5% extract de malţ cu 3% agar) este utilizat pentru sporulare.
2.3.2. Metabolismul lactozei şi galactozei

Una din propietăţile care distinge tulpinile de Kluyveromyces lactis de Saccharomyces cerevisiae este abilitatea de a utiliza lactoza ca singură sursă de carbon şi energie. Degradarea lactozei de către celule sau de către enzimele purificate. Din acestea şi-au găsit un mare număr de aplicaţii industriale. Metabolismul lactozei este controlat de două gene linkate LAC4 şi LAC12, care codifică  - galactozidază şi lactoză – permează. Aceste gene transferate în Saccharomyces cerevisiae sunt suficiente pentru a asigura dezvoltarea pe lactoză.

Controlul principal al metabolismului lactozei care se produce la nivel transcripţional, implică multe gene în acest proces. Aceste gene includ LAC4, LAC8, LAC9, LAC10 şi LAC11. LAC5, LAC8 şi LAC11 codifică enzime din calea Leloir a metabolismului galactozei şi pot fi renotate GAL7, GAL10 şi respectiv GAL1 în concordanţă cu genele homoloage din Saccharomyces cerevisiae. Aceste gene sunt coreglate cu LAC4 şi LAC12 la nivel transcripţional, prin genele reglatoare LAC9 şi KIGAL80. LAC9 sau KIGAL4 codifică un activator transcripţional, care la Kluyveromyces lactis este echivalentul lui GOL4p. Funcţia Lac9p este reglată printr-un reglator negativ Gal80p, în esenţă acelaşi ca Gal4p. Mutanţii fenotipici sugerează că KIGAL80 ar putea fi identic cu gena reglatoare LAC10.[2, 8]
2.3.3. Represia glucozei în metabolismul lactozei şi galactozei

Represia glucozei prin sistemul lactoză/galactoză este bine cunoscută la Kluyveromyces lactis. Prezenţa simultană a glucozei şi galactozei în mediul de cultură poate inhiba inducţia galactozei, însă preferinţa de a utiliza glucoza mai mult decât galactoza depinde de variatele condiţii dintre tulpini. În Saccharomyces cerevisiae acest fenomen al represiei glucozei este sub controlul mai multor procese metabolice şi este în mod particular pronunţat. Experimentele care se adresează bazelor moleculare a represiei glucozei de către expresia genei SAL în Saccharomyces cerevisiae, sugerează o reglare complexă în care este implicată suprapunerea mecanismelor Gal4p – mediat şi Gal4p – independent. În Kluyveromyces lactis expresia genei LAC9 este controlată prin autoreglare şi represia glucozei şi astfel mecanismele Lac9p – dependent şi independent se suprapun deja, în nivelul de expresie a genei LAC9 [2, 9].

2.3.4. Aplicaţii biotehnologice

Kluyveromyces lactis este cunoscută ca o sursă de  - galactozidază, dar utilizarea la scară largă pentru producţia de proteină este de dată recentă. Această drojdie este prezentă în variate produse lactate şi este receptată şi general recunoscută ca unică (GRAS), pentru uzual industrial. Pentru a se dezvolta la concentraţii celulare înalte, s-a utilizat un mediu pe bază de glucoză din cereale, într-un fermentator feed – batch, în care s-a obţinut o concentraţie de 100g de biomasă uscată la litru.[10]

Interesul recent pentru Kluyveromyces lactis, pare a fi legat de capacitatea drojdiei de a secreta proteine cu greutate moleculară mare. Faptul că o plasmidă lineară codifică o toxină ce este secretată în mediul de cultură, sugerează că Kluyveromyces lactis este capabilă să secrete o largă gamă de proteine. De aceea obţinerea de randamente ridicate în producţia de proteine heteroloage secretate, cum ar fi proteinele umane, a determinat unele firme industriale să utilizeze drojdiile în locul bacteriilor, drojdiile Kluyveromyces lactis şi Saccharomyces cerevisiae fiind considerate o alternativă pentru obţinerea de proteine secretate. În Tabelul 3 sunt prezentate exemple de proteine heteroloage produse de Saccharomyces cerevisiae şi Kluyveromyces lactis [11].

Tabelul 3. Proteine heteroloage produse de Saccharomyces cerevisiae şi

Kluyveromyces lactis.

Proteina	Vector	Promotor	Semnalul de secreţie	Randament/l Flacon/fermentator
Saccharomyces cerevisiae
GRF umană	2	MFa	MFa	30mg/-
apoE umană	2	PHO5	MFa	40mg/-
IL – 6 umană	2	SAL1	MFa	30mg/-
IL - 1 umană	2	SPD	Amilază	20mg/-
PTH umană	2	Mfa	MFQ	100mg/-
Serumalbumină umană	2	Diverse	Diverse	40-150mg/-
Amilază murină	2	GAL7	-	60mg^a/370mg^a
Factor anticoagulant	2	GAL10	MFa	250mg/-
Toxină tetanică C	2	GAL/ADH	-	90mg^a/1g^a
Kluyveromyces lactis
IL - 1 umană	pKD1	PHO5/PGK	Killer	80mg
Serumalbumină umană	pKD1	LAC4/PGK	Nativă	400mg/câteva grame
HbsAg	Integ.	LAC4	-	12mg^a/-
Prochimozină bovină	Integ.	LAC4	MFa	-/câteva grame