2. Specii de drojdii utilizate în procesele biotehnologice
Yüklə 216,1 Kb.
|
|
a – acumulare intracelulară Pentru producţia de nivel înalt al proteinelor heteroloage, au fost luate în considerare două strategii: una este bazată pe expresia cromozomală a genelor proteinelor externe integrate (care au o stabilitate ridicată în mitoză), şi alta care se bazează pe vectorii plasmidiali multicopii care poartă genele străine. De exemplu, prochimozina este produsă de genele integrate cromozomal, iar serumalbumina umană, de plasmida pKD – plasată pe vectori [12]. 2.4. Pichia pastoris (Guilliermond) PHAFF Crescute pe extract de malţ, timp de 2 zile, celulele sunt sferice până la uşor ovale, izolate sau dispuse în pereche, cu dimensiuni de 2,5 – 5×3,2 – 6 m. Celulele ovale pot măsura 5×6,5 m. După menţinerea timp de 3 zile la 250C celulele sunt mici (2 – 4×2,2 – 5,3 m) şi ovale; dar se întâlnesc şi celule mai mari, ovale (5×6,5 m). După o lună la 170C, cultura devine crem, moale, catifelată şi lucioasă. Conjugarea între celula mamă şi mugurele său poate preceda formarea ascei. În fiecare ască se formează 1 – 4 spori, în formă de pălărie care se eliberează uşor. Prezenţa multor spori dă culturii culoarea maro. Fermentează glucoza, trehaloza, L-ramnoza, etanolul, glicerolul, D-manitolul, acidul succinic şi acidul DL – lactic. Creşte la 370C [1]. Interesul în studiul drojdiilor nonconvenţionale (altele decât Saccharomyces cerevisiae şi Schizosaccharomyces pombe) a fost foarte mare în ultimii ani. În această categorie intră drojdiile metilotrofe Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida boidinii. Drojdiile metilotrofe au capacitatea de a utiliza metanolul ca singură sursă de carbon şi energie. Adaptarea la dezvoltarea pe metanol este asociată cu inducţia metanol oxidazei (MOX) sau alcooloxidazei (AOX), dihidroxi – aceton – sintazei (DAS) şi a altor enzime implicate în metabolismul metanolului. O caracteristică importantă este aceea că alcooloxidaza este absentă în celulele care se dezvoltă pe glucoză, dar în celulele care se dezvoltă pe metanol reprezintă aproximativ 30% din proteina celulară. Proliferarea intensivă a peroxizomilor atinge cca 80% din volumul celulelor dezvoltate pe metanol. Iniţial drojdia Pichia pastoris a fost utilizată de Compania Philips Petroleum pentru producţia de proteină celulară la densităţi foarte mari, > 130 g/l. Din cauza costurilor economice, compania a făcut cercetări pentru dezvoltarea la această drojdie, a unui sistem de expresie pentru producerea de proteine recombinate. În acest sens, câteva companii farmaceutice şi biotehnologice au patentat, tehnologia de expresie în Pichia pastoris. Cu acestă tehnologie s-au realizat trei produse şi anume: antigenul de suprafaţă al Hepatitei B, serumalbumina umană şi factorul 1 de dezvoltare a insulinei, care au fost comercializate [13]. Pe lângă utilizarea intensivă pentru expresia proteinelor heterogene, Pichia pastoris a fost folosită şi pentru dezvoltarea unui model de organism, pentru analiza moleculară a biogenezei peroxizomale.[14] În continuare va fi prezentat un proces biotehnologic cu utilizarea drojdiei Pichia pastoris pentru obţinerea proteinelor heterogene. 2.4.1. Medii de cultură 2.4.1.1. Soluţii stoc Pentru filtrarea sterilizantă a variatelor soluţii şi lichide se utilizează filtre echipate cu membrane de acetat de celuloză sau nitrat de celuloză (porii sunt de 0,2 - 0,22 m). Pentru metanol se utilizează membrane de acetat de celuloză [2]. Exemple de soluţii: 10XYNB: se dizolvă 13,4 g azot de drojdie pe bază de aminoacizi (Difco) în 100 ml apă şi se filtrează în condiţii sterile. Soluţia poate fi stocată mai mulţi ani la 40C; 500XB: se dizolvă 20 mg de D – biotină în 100 ml apă şi se filtrează steril; 100XH: se dizolvă 20g D – glucoză în 100 ml apă. Se autoclavează 15 minute sau se sterilizează prin filtrare. Se poate stoca mai mult timp la temperatura camerei; 10XGY: se amestecă 10 ml glicerol cu 90 ml apă. Se sterilizează prin filtrare. Se păstrează mai mult timp la temperatura camerei; 10XM: se amestecă 5 ml metanol (100%) cu 95 ml apă. Se sterilizează prin filtrare şi se conservă la 40C; 100% metanol se sterilizează prin filtrare. 2.4.1.2. Compoziţia mediilor de cultură minimale MD: se amestecă 100 ml de 10XYNB, 2 ml de 500XB, 2 ml de 500XB şi 100 ml deXD cu 800 ml apă autoclavată (include 15g agar Bacto pentru plăci); MM: se amestecă 100 ml de 10XYNB, 2 ml de 500XB şi 100 ml de 10XM cu 800 ml apă autoclavată (include 15g agar Bacto pentru plăci); MGY: se amestecă 100 ml de 10XYNB, 2 ml de 500XB şi 100 ml de 10XGY, cu 800 ml apă autoclavată (include 15g agar Bacto pentru plăci). Mediul minimal cu alte surse de carbon (ca D – sorbitol, D, L – alanină) se prepară prin utilizarea sursei, de 10 g/l în locul glucozei din MD.
Mediul minimal este suplimentat cu nutrieţi necesari cum ar fi aminoacizii, în funcţie de necesităţile specifice de dezvoltare a tulpinilor respective. De exemplu, tulpinile GS115 şi KM75 de Pichia pastoris, care sunt utilizate în manipulările genetice, sunt auxotrofe faţă de histidină. Aceste tulpini se vor dezvolta în mediu minimal numai dacă este suplimentat cu histidină. Orice transferare cu HIS4 (gena histidinol-dehidrogenazei) impune dezvoltarea în absenţa histidinei. Alte medii suplimentate depind de cerinţele particulare ale tulpinii utilizate. MDH: se amestecă 100 ml de 10XYNB, 2 ml de 500XB, 100 ml de 10XD şi 10 ml de 100XH cu 790 ml apă autoclavată (include 15g agar pentru plăci); MMH: se amestecă 100 ml de 10XYNB, 2 ml de 500XB, 100 ml de 10XM şi 10 ml de 100XH cu 790 ml de apă autoclavată (include 15g agar pentru plăci); MGyH: se amestecă 100 ml de ZNB, 2 ml de 500XB, 100 ml de 10XGY, 10 ml de 100XH cu 790 ml apă autoclavată (include 15g agar pentru plăci).
YPD: se dizolvă 10 g extract de drojdie Bacto, 20g peptonă şi 20g glucoză în 1000 ml apă (include 15g agar Bacto pentru plăci) şi se autoclavează 20 minute. 2.4.1.5. Conservare Pentru conservare, Pichia pastoris este păstrată la 40C în mediul complex (YPD) lichid sau YPD agar înclinat. Celulele care iniţial au fost cultivate pe mediul dorit (metanol minimal selectiv, dextroză sau glicerol de tip MM, MD sau MGV pentru transformanţi) au fost transferate pe YPD. Cele mai multe tulpini sunt stocate pe aceste medii 1 an la 40C. Pentru conservarea de lungă durată, celulele sunt suspendate la densitatea optică (600 nm) de 50 – 100 în YPD conţinând 50% glicerol. Celulele sunt îngheţate la – 800C, de preferinţă în azot lichid.
Pentru obţinerea de biomasă de Pichia pastoris, producătoare de proteine heteroloage s-au utilizat celule Mut+ şi Mut- cultivate împreună în sistem batch de fermentaţie. Acest proces a fost ridicat la scară pentru 1000 l, de la 0,2 l. Fermentaţia a fost condusă la un pH cuprins între 3 şi 5,9 şi la temperatura de 300C. Dezvoltarea la pH scăzut (cu reducerea riscului de contaminare microbiană) este considerată unul din avantajele utilizării acestei drojdii în producţia de proteină microbiană. Acest lucru este de interes în optimizarea parametrilor de fermentaţie pentru producţia de proteine recombinante. De exemplu, randamentul de secreţie a serumalbuminei umane (HSA) este înbunătăţit, dacă se menţine tot timpul pH 5,85, în comparaţie cu pH 5, utilizat în mod curent. Randamentul de secreţie a factorului de dezvoltare a epidermei umane şi a factorului 1 de dezvoltare a insulinei – like, este optim la pH 3 [15]. Alte caracteristici ale mediului şi condiţiilor de dezvoltare influenţează producţia de proteine specifice. Adăugarea de extract de drojdie şi peptonă, creşte nivelul de secreţie de HSA şi de activator tisular de plasminogen (TPA). În cazul producţiei intracelulare a antigenului de suprafaţă al hepatitei B, adaosul de urme de metal (KI, NaMoO4×2H2O, CoCl2×6H2O) în cantitate de 0,8, 0,2 şi respectiv 0,5g la litru, creşte randamentul în particule antigenice. 2.4.2.1. Cultivarea continuă a tulpinilor Mut+ şi Mut- pe metanol Fermentaţia este condusă în două stadii. Primul este sistemul de fermentaţie batch pe glicerol sau glucoză ca sursă de carbon, urmată de cultivarea în sistem continuu pe mediu cu metanol. Acest proces este tipic pentru celulele recombinate unde este preferabilă utilizarea glicerolului în locul glucozei [2]. 2.4.2.1.1. Inoculul pentru fermentator Dezvoltarea celulelor la o D.O.600 nm de 2 – 10 s-a realizat într-un flacon de 2 litri, care conţine 1l din unul din următoarele medii de dezvoltare: MD, MGY, YPD, YMPD, YMPGy sau MGyB. Acest volum de inocul este adecvat pentru inocularea unui fermentator de 20l cu un volum de operare de 10l. 2.4.2.1.2. Medii de cultură YMPD: se dizolvă 3g de extract de drojdie, 3g de extract de malţ, 5g de peptonă şi 10g de glucoză în 1l apă şi se autoclavează; YMPGy: acelaşi ca yMPD cu excepţia a 10 ml glicerol 100%, în locul a 10g de glucoză; MGyB: se dizolvă 11,5g KH2PO4, 2,66g K2HPO4, 6,7g YNB, pH 6 şi 20 ml glicerol în 1l de apă, apoi se autoclavează: FM21 – mediu bazal de săruri. Compoziţia este pentru un volum final de 1l de apă: acid fosforic85% 3,5ml, sulfat de Ca 0,15g, sulfat bipotasic 2,4g, sulfat de Mg 1,95g, hidroxid de potasiu 0,65g, soluţie stoc de biotină 0,2g/l; PTM – microelemente. Compoziţia este pentru un volum final de 1l de apă: sulfat de Cu 6g, sulfat de Mn 3g, sulfat feros 65g, sulfat de Zn 20g, acid sulfuric 5ml, clorură de Co 0,5g, acid boric 0,02g, molibdat de Na 0,2g, KI 0,1g; BSM – compoziţia mediului este pentru 1 l volum final de apă: acid fosforic 26ml, sulfat de Ca 0,9g, sulfat de K 18g, sulfat de Mg 14g, hidroxid de potasiu 4g.
Se sterilizează un fermentator de 20 l încărcat cu 9 l de mediu bazal de săruri FM21, ce conţine 5% v/v glicerol (o cantitate mai mare poate fi toxică pentru celule) sau 5 – 10% glucoză. Cu ajutorul unui sistem de răcire temperatura se menţine la 300C. pH mediului va fi mai mare de 2 şi se ajustează la 5 cu NH3 gazos sau cu soluţie NH4OH 50%. Se adaugă 4ml soluţie stoc de biotină şi 11 ml amestec de microelemente PTM1. Se inoculează fermentatorul cu 1 l de cultură din flaconul de 2 l. Fermentaţia este condusă până când sursa de carbon (glicerolul sau glucoza) este complet consumată. Oxigenul dizolvat este menţinut la > 20% cu ajutorul unui agitator cu viteza de 500 până la 1500 rpm şi la o presiune în vas de 2 – 3 psi. Spumarea este controlată prin adaosul de 5% Struktol Y673. Randamentul celulelor este estimat pentru faza de batch pe mediu cu 5% glicerol la 20 – 25g masă celulară uscată la litru. 2.4.2.1.4. Faza continuă Mediul de alimentare pentru faza continuă este FM21 cu metanol (15% v/v) pentru celulele Mut+, sau FM21 cu metanol (1% v/v) plus 15% glicerol, sorbitol sau alanină, pentru celulele Mut-. Alimentarea continuă este, de asemenea, suplimentată cu PTM1 (1,1ml din soluţia stoc/l) şi biotină (0,4ml din soluţia stoc/l). Mediul de alimentare este sterilizat prin filtrare şi introdus în bioreactor cu ajutorul unei pompe. Cultura continuă este performantă în condiţiile de cultivare chemostat, unde rata de diluţie D este egală cu rata de creştere a microorganismelor (max). Valorile lui D sunt cuprinse între 45 – 75%, prin variaţia ratei de aeraţie, presiunii şi vitezei agitatorului. În aceste condiţii maximum de masă celulară obţinută este de 10g/l×h-1. Pentru realizarea acestui proces biotehnologic s-a utilizat un fermentator cu capacităţi de 2 – 20 l şi 1 – 10 l volum de operare, echipat cu monitoare şi sisteme de control pentru pH, oxigen dizolvat (D.O.), viteză agitator, temperatură, rată de aerare, presiune, antispumare, greutate coloană de lichid. 2.4.2.2. Metode de monitorizare a fermentaţiei Pentru monitorizarea fermentaţiei s-a utilizat un analizor Bio – Rad, pentru analize HPLC a concentraţiei metanolului, glicerolului, etanolului, glucozei, acidului acetic, acidului lactic, fructozei şi maltotriozei şi maltozei. Biomasa umedă a fost determinată prin prelevarea a 1 ml de cultură din fermentator, care a fost centrifugată 4 minute, pentru separarea supernatantului şi apoi cântărită. Biomasa uscată a fost determinată asemănător, prin centrifugare la 3000 rpm, timp de 10 minute a unui volum de mediu de cultură de 10 până la 50 ml. Biomasa umedă obţinută a fost spălată cu 10 – 50 ml de apă şi apoi uscată la 1000C [2]. Transferul de masă a fost determinat prin măsurarea ratei de aerare în fermentator şi a compoziţiei aerului de intrare şi ieşire cu ajutorul unui analizor de gaz Perkin – Elmer. Rata de transfer a O2 (OTR) a fost calculată astfel: OTR = unde f este debitul, l/h, cin şi cies reprezintă concentraţia în mmol a oxigenului din aerul de intrare şi respectiv ieşire din fermentator, iar V este volumul de mediu de cultură. OTR poate fi de asemenea estimat din randament după ecuaţia: OTR = unde este rata de creştere specifică sau rata de diluţie (h-1), X este densitatea celulară (g/l), iar YXO2 este randamentul oxigenului (g celule/mmol O2). Rata de transfer a căldurii şi cantitatea de căldură transferată au fost determinate prin măsurarea temperaturii apei de răcire la ieşirea din schimbătorul de căldură a fermentatorului. Productivitatea P pentru cultivarea continuă a fost calculată utilizând ecuaţia: P = D × X, unde D este rata de diluţie (h-1) şi X densitatea celulară. O creştere a lui D şi/sau a lui X este rezultatul unei productivităţi înalte. Dacă D este egală cu rata de creştere specifică , rata de diluţie poate fi limitată de caracteristicile intrinseci ale microorganismelor. Concentraţia de proteine extracelulare (proteine de secreţie), poate fi estimată prin utilizarea metodei Lowry sau a metodelor imunologice. Parametrii determinaţi pentru un proces biotehnologic de înaltă productivitate cu Pichia pastoris cultivată pe metanol, într-un bioreactor de 1500l sunt următorii:
2.4.2.3. Fermentaţia fed – batch cu tulpinile Mut+ şi Mut- pe metanol 2.4.2.3.1. Inoculul pentru fermentator Inoculul (1 l) este preparat după protocolul descris pentru fermentaţia continuă. 2.4.2.3.2. Faza de batch Se sterilizează fermentatorul de 20 l încărcat cu 5 l de mediu bazal de săruri BSM, care conţine 5% glicerol sau 5 – 10% glucoză şi se menţine temperatura la 300C. pH acestui mediu este < 2 şi se corectează la 5 cu NH3 gaz, sau cu soluţie de NH4OH 50%. Se adaugă 40 ml soluţie stoc de biotină şi 40 ml PTM1. Se inoculează fermentatorul cu 1 l de inocul de la flacoane. Fermentaţia este condusă până când sursa de carbon (glucoza sau glicerolul) este complet consumată. Această fază durează 18 – 24 de ore. 2.4.2.3.3. Faza fed – batch pe glicerol Iniţial se porneşte alimentarea cu glicerol 50% w/v (500 ml glicerol 100% + 480 ml apă); se autoclavează şi se filtrează amestecul de 10 ml PTM1 şi soluţie stoc de biotină, rata de alimentare fiind de 18 ml/h/l, la volumul iniţial de fermentaţie. Alimentarea se realizează cu o pompă peristaltică. Alimentarea cu glicerol nu trebuie să fie mai mare de 4 ore. Randamentul celular în acest punct este cuprins între 180 – 220 g/l, biomasă umedă, echivalentă cu 30 – 55 g/l biomasă uscată. Această fază poate fi manipulată prin varierea concentraţiei de glicerol şi/sau a duratei fermentaţiei, pentru a se obţine un randament optim în proteine heteroloage în faza fed – batch pe metanol. Aceasta sugerează că se pot testa diferite tipuri de randamente celulare după cum urmează: Mut- (expresie intracelulară): 50 – 100g/l substanţă uscată sau 200 – 400 g/l substanţă umedă; Mut+ (expresie intracelulară): 30 – 80g/l substanţă uscată sau 140 – 320 g/l substanţă umedă; Mut- (secreţie): 20 – 40g/l substanţă uscată sau 80 – 160 g/l substanţă umedă; Mut+ (secreţie): 12 – 80g/l substanţă uscată sau 50 – 300 g/l substanţă umedă.
La început alimentarea metanolului (908 ml metanol 100% + 10 ml de PTM1 + 10 ml soluţie stoc de biotină sterilizată prin filtru) se face la o rată de 6 – 24 ml/h, faţă de volumul iniţial de cultură cu o pompă peristaltică cu viteză variabilă. Rata de alimentare cu metanol este ajustabilă aşa încât pentru tulpinile Mut- concentraţia metanolului în fermentator să fie între 0,2 – 0,5% v/v, faţă de tulpinile Mut+ la care nivelul metanolului în fermentator trebuie să fie aproape zero. Oxigenul dizolvat este menţinut între 20 – 70%. Dacă scade sub 20%, se stopează alimentarea metanolului, până când se ajustează nivelul D.O. peste 20%, prin creşterea vitezei agitatorului, mărirea presiunii şi a ratei de aerare. Menţinerea ratei oxigenului dizolvat mai mare de 20% este dificilă şi depinde de rata de transfer a oxigenului (OTR) în fermentator. În fermentatoarele de oţet, sistemul poate fi presurizat până la 15 – 30 psi pentru creşterea OTR. Alimentarea cu oxigen (amestec de aer + oxigen) de 0,1 – 0,3 v/v/m poate fi utilizată pentru menţinerea unui nivel adecvat de oxigen dizolvat. Faza fed – batch pe metanol durează cca 70 ore şi se poate prelungi până la 200 ore, dacă se poate asigura nivelul optim de oxigen dizolvat. Mărirea duratei de fermentaţie poate fi necesară pentru a se atinge niveluri înalte de acumulare şi de secreţie a proteinelor recombinante în mediul de cultură.[2, 15] 2.4.3. Tehnologii de perspectivă O limitare majoră a drojdiei Pichia pastoris şi a altor tulpini în sistemul de expresie al producţiei de proteine terapeutice este incapacitatea de a purta câteva modificări proteice posttranslaţionale cum ar fi cele ale proteinelor mamiferelor. Acestea includ glicozilarea proteinelor specifice mamiferelor, vitamina K dependentă de carboxilarea acidului glutamic, amidarea COOH – terminal. Se speră că prin eforturile ce se vor depune în viitor pentru utilizarea genelor mamiferelor în ingineria drojdiilor, să se obţină câteva performanţe în domeniul acestor modificări post – translaţionale. 2.5. Pichia quilliermondii Wickerham Celulele de Pichia quilliermondii sunt heterogene, mai mult elongate, de dimensiuni cuprinse între 2 - 10, adesea formând pseudomiceliu. Se cunosc tulpini care nu utilizează lactoza, amidonul şi inozitolul, dar acestea diferă în privinţa posibilităţii de a utiliza D-riboza, d-arabinoza, D-celobioza, d-melibioza, L-ramnoza, L-sorboza. Se cunosc tulpini care utilizează hidrocarburi (amestecuri naturale sau n – hexadecan), ca singură sursă de carbon şi energie. Dezvoltarea pe alte substraturi respiratorii, ca etanol, glicerol, succinat sau citrat este satisfăcătoare. Pichia quilliermondii este reprezentantul tipic pentru drojdiile aerobe. Dezvoltarea standard pentru Pichia quilliermondii este la 300C. Limita superioară a temperaturii este de 420C. Mediul standard pentru cultivarea drojdiei în laboratoare este YEPD sau YEPS în care glucoza este substituită de sucroză şi care este considerat un mediu complet. Mediul minimal este mediul Burkholder modificat [16]. Cea mai importantă caracteristică a tulpinilor de Pichia quilliermondii, care sunt de mare viitor, este capacitatea lor de a realiza superproducţii de riboflavină (vitamina B2) în timpul cultivării pe mediu deficient în fier. Astfel, 146 de tulpini din 147 analizate, au fost apte să excrete pigmentul galben, identificat ca riboflavină, în timpul cultivării pe mediu deficient în fier. Una dintre tulpini, care nu sintetizează cantităţi importante de riboflavină, aparent în contrast cu reprezentanţii speciei, produce hibrizi care contrastează cu hibrizii speciei Pichia quilliermondii, deoarece nu sporulează. Astfel, însuşirea de a da superproducţii de riboflavină şi de aici acumularea pigmentului galben în lichidul de cultură pe durata cultivării pe medii deficiente în fier, este o caracteristică de specie, la Pichia quilliermondii [17].
Mutanţii sunt incapabili să utilizeze hidrocarburile ca singură sursă de carbon şi energie. Aceştia au fost desemnaţi ca mutanţi alc (alcane nonutilizable), şi aproximativ jumătate dintre ei sunt incapabili să se dezvolte pe glicerol, iar alţii nu pot utiliza o singură hidrocarbură. Analiza genetică a 22 de mutaţii specifice alc, arată că acestea sunt recesive şi se pot împătţi în minimum trei grupuri complementare (alc1, alc2, alc3). 2.5.1.1. Biosinteza riboflavinei Acest microorganism a fost utilizat pentru identificarea genelor structurale şi reglatoare implicate în flavinogeneză. În urma mutagenezei cu UV, au fost izolaţi 114 mutanţi riboflavin deficienţi. Studiile biochimice bazate pe analiza intermediarilor de riboflavină acumulaţi, au împărţit aceşti mutanţi în 5 grupuri biochimice. Analiza complementară a 106 mutanţi relevă 7 clase complementare sau gene (RIB1 – RIB17). Tulpinile din grupul biochimic care acumulează produşi nespecifici, corespund cu grupul complementar rib1: grupul II, acumulează 2, 4, 5 – triminopirimidină şi corespunde cu grupul complementar rib2; grupul III acumulează 2, 6 dihidroxi 4 ribitilaminopirimidină şi este încadrat în grupul complementar rib3; mutanţii din grupul IV, acumulează 2, 6 dihidroxi 5 amino 4 ribitilaminopirimidină şi aceştia sunt divizaţi în 3 grupuri complementare rib4, rib5, rib6; mutanţii din grupul V acumulează 6, 7 dimethyl 8 ribitil lumazină şi corespund grupului complementar rib7. Studiile biochimice şi genetice asupra tulpinilor de Pichia quilliermondii auxotrofe la riboflavină, arată că biogeneza riboflavinei este similară cu cea întâlnită la speciile de Saccharomyces cerevisiae, deoarece are însuşirea de a realiza producţii înalte de riboflavină şi de precursori ai acesteia în medii deficiente în fier [18]. Analizele enzimologice asupra tulpinilor de Pichia quilliermondii auxotrofe la riboflavină, au ajutat la identificarea de noi enzime necunoscute până atunci, care participă la biosinteza riboflavinei. Au fost descoperite: gena RIB1 care codifică enzima din primul stadiu al flavonogenezei; STP ciclohidrolaza; gena RIB2 care codifică enzima din stadiul 2, 2, 5- diamino-6-hydroxy-4-ribosilaminopirimidin-5’-fosfat reductaza. Gena RIB3 care codifică enzima din stadiul 3, 2, 5-diamino-6-hidroxi-4-ribitilaminopirimidin-5’-fosfat-diaminaza. Gena RIB5 codifică 6, 7 dimethyl 8 ribityllumazin sintaza şi gena RIB6 care codifică sinteza unui precursor alifatic al structurii pteridinei, 6, 7-dimethyl-8-ribityllumazină-3,4-dihydroxy-2-butanonă-4-fosfat, care este produs din ribuloză-5-fosfat. Gena RIB7 codifică sinteza riboflavinei [19]. Rolul exact al genei RIB4, nu este încă elucidat. Această genă codifică enzima care defosforilează 2, 4-dihidroxi-5-amino-pirimidin-5’-fosfat, care se presupune că este o fosfatază specifică, dar care nu a fost bine identificată. Astfel studiul tulpinilor de Pichia quilliermondii auxotrofe la riboflavină a dus la elucidarea biochimică a unei căi metabolice noi, aceea a biosintezei riboflavinei la microorganisme (Figura2).
Prin combinarea mutaţiilor care au dus la supraproducţii de ribloflavină în medii bogate în fier, s-au izolat tulpini mutante de Pichia quilliermondii care acumulează în timpul dezvoltării pe medii sintetice sau industriale, cantităţi mari de riboflavină de până la 12 mg/g de celule uscate. Aceste tulpini mutante sunt de interes pentru producţia de furaje cu riboflavină, preparate pe bază de biomasă uscată de drojdii, deoarece granularea drojdiilor este mai ieftină, decât evaporarea şi uscarea biomasei microbiene împreună cu mediul de cultură, în afara procedeelor industriale cunoscute, unde ribloflavina este excretată cel mai mult în mediul de cultură) [18]. Mutanţii de Pichia quilliermondii care transportă activ riboflavina, acumulează eficient această vitamină în interiorul celulei din soluţiile diluate şi sunt utilizaţi pentru concentrarea riboflavinei din lichidele de cultură cu producţii slabe sau moderate, până la 100 g riboflavină/ml. Acest lucru sugerează că obţinerea de biomasă de drojdii îmbogăţită în riboflavină ar fi o sursă de riboflavină mult mai ieftină, decât cea obţinută prin alte metode din soluţiile diluate. Folosirea tulpinilor mutante capabile de a integra riboflavina din mediu, în interiorul celulei constituie o metodă nouă, denumită calea riboflavinkinazei. Aceasta este intemeiată pe riboflavin permeaza, care este incapabilă să catalizeze calea flavinmononucleotidelor. Această observaţie se bazează pe eliminarea riboflavinei, care nu este constituită în flavin mononucleotide prin reacţia riboflavinkinază. La terminarea reacţiei amestecul este incubat pentru o oră cu celule spălate, care posedă riboflavin permează activă şi unde riboflavina este introdusă în celule. Concentraţia de flavin mononucleotide este determinată prin analiză directă de fluorescenţă, din amestecul de reacţie, după ce se îndepărtează celulele prin centrifugare sau filtrare. Această metodă este mult mai simplă, mai ieftină, şi mai convenabilă, decât alte metode utilizate curent [2, 18]. Studiul mutanţilor riboflavin deficienţi de Pichia quilliermondii, care posedă activitate specifică permeazei pentru riboflavină şi sunt capabili să se dezvolte la concentraţii foarte scăzute de riboflavină exogenă (0,005 g riboflavină/ml) s-a soldat cu dezvoltarea unei noi metode auxonografice de analiză microbiologică a vitaminei B2. Sensibilitatea acestei metode este similară cu cea cunoscută pentru Lactobacillus casei, dar la drojdie, metoda este mult mai convenabilă, deoarece necesităţile nutriţionale sunt mai simple pentru Pichia quilliermondii. Tulpina Pichia quilliermondii care conţine mutaţii dominante pentru supersinteza de riboflavină în mediu bogat în fier şi acest mutant este capabil să se dezvolte în mediu minimal fără riboflavină şi să acumuleze în jur de 100 mg de 6,7-dimethil-8-ribitillumazină/ml de mediul de cultură. Producerea de lumazină poate fi utilizată ca substrat în reacţiile riboflavin sintazei. 2.6. Yarrowia lipolytica van der Walt şi von Arx Iniţial această drojdie a fost clasificată ca fiind Candida lipolytica (Harison). Este o specie heterotalică ce prezintă două tipuri de împerechere A şi B. Din fuziunea celulelor vegetative sau sporilor A şi B rezultă diploizi, care se reproduc vegetativ. În comparaţie cu Saccharomyces cerevisiae, celulele haploide de Yarrowia lipolytica cu tip de împerechere opus, fuzionează rar iar majoritatea zigoţilor rezultaţi avortează. Prin sporularea diploizilor se formează asce ce conţin 1 – 4 ascospori, care prezintă o capacitate scăzută de germinare (> 1%). Aceste trăsături negative pot fi remediate prin încrucişări repetate frate×soră până când 80 – 90% dintre asce conţin 4 ascospori, cu o capacitate de germinare de 90%. Această tulpină a fost reclasificată prima dată în Endomycopsis lipolytica (Wickerham, 1970), apoi în Saccharomycopsis lipolytica (Yarrow 1972) şi în final în Yarrowia lipolytica (Van der Walt şi von Arx, 1980).[42] 2.6.1. Dimorfismul la Yarrowia lipolytica Tulpinile de tip sălbatic de Yarrowia lipolytica prezintă colonii de forme variate, netede şi lucioase sau mate. Morfologia coloniilor este determinată de condiţiile de dezvoltare (aeraţie, surse de carbon şi azot, pH) şi de fondul genetic al tulpinii. Yarrowia lipolytica este un fung dimorfic natural, care are celule sub formă de drojdie, pseudohife şi hife septate [20]. Miceliul adevărat constă în hife septate de 3 – 5 m. Celulele apicale ating adesea 100 m, pe când articulaţiile au 50 – 70 m lungime. Proporţia diferitelor forme de celule depinde de tulpina utilizată, probabil în concordanţă cu diferenţele morfologice observate la nivelul coloniei. Sunt cunoscute condiţiile care determină preferenţial forma celulelor de drojdie sau induce dezvoltarea miceliului. S-a observat că sursele de carbon, cum sunt uleiul de măsline, acidul oleic, oleil alcoolul, acidul linoleic şi trioleina, împreună cu sursele de azot ca soia, caseina din laptele de bovine sau extractul de carne induc puternic formarea hifelor la câteva tulpini de Yarrowia lipolytica. Dezvoltarea miceliului a fost inhibată prin deficienţa în sulfat de Mg şi clorură ferică sau adiţia de cisteină sau glutation. S-a realizat inducerea completă şi reproductibilă a miceliului de drojdie la tranziţia tulpinilor în mediu minimal care conţine N – acetilglucozamină ca singură sursă de carbon, dar acestea par a fi tulpini dependente. Unele studii au dus la detectarea unor schimbări fiziologice operate pe durata tranziţiei drojdie – hifă. Comparând compoziţia drojdiei şi a celulelor hifale, s-a arătat că pereţii hifali prezintă un conţinut ridicat în aminozaharuri şi un conţinut redus în proteină. Pe deasupra, activitatea ornitin decarboxilazică şi cantitatea de poliamină celulară, măresc dezvoltarea celulelor hifale pe mediu cu N – acetilglucosamină. Mutaţiile în genele SEC14 şi deleţia la XPR6, au efecte puternice în tranziţia drojdie/hifă. Totuşi, nu se cunoaşte dacă codificarea proteinelor de către aceste gene este implicată în reglarea acestei tranziţii. Mutanţii morfologici sunt incapabili de a forma hife [21]. 2.6.2. Utilizarea hidrocarburilor ca sursă de carbon Este cunoscut de mult timp că Yarrowia lipolytica utilizează n – alcani şi l – alchene ca surse de carbon. Alcanii polimetilaţi şi clorinaţi sunt de asemenea asimilaţi de către această tulpină. Prima etapă în asimilare se presupune că este o emulsificare a suprafeţei celulare, cu un emulsificator celular de 27 kd, care se numeşte lipozan, şi este indus prin dezvoltarea celulelor pe n – alcani. Lipozanul conţine 88% carboxidrat şi 12% proteină. După pătrunderea în celulă, n – alcanii, sunt hidroxilaţi de către sistemul monooxigenază a citocromului P – 450. Citocromul P – 450 a fost detectat în câteva tulpini de Yarrowia lipolytica. Sinteza acestor enzime este indusă în timpul dezvoltării pe n – alcanii, dar nu şi pe glucoză, etanol sau acetat. Diferenţele în sensibilitatea represiei, pe glucoză, pe durata dezvoltării pe hexadecan şi decan indică prezenţa diferitelor gene reglatoare a citocromului P – 450 în Yarrowia lipolytica. L – alcanolul format la sfârşitul primei etape este apoi oxidat de către alcooloxidază care acţionează la nivelul membranei şi nu de către alcooldehidrogenaza NAD(P) – dependentă, care este de asemenea prezentă în Yarrowia lipolytica. Au fost izolaţi şi caracterizaţi câţiva mutanţi care nu utilizează alcani şi corespund la cinci clase fenotipice notate (alKA – alKE) şi care depind de intermediarii din calea de degradare a alcanilor. Mutaţiile în locus 16, cauzează o reducere semnificativă a căii de utilizare a n – alcanilor şi caracterizează trei subtipuri ai mutanţilor alKA, care sunt incapabili să utilizeze oricare alte tipuri de n – alcani (alKAa), nu numai unul din laturile scurte de atomi de carbon, de la C8 la C12 (alKb), ci şi unul din lanţurile lungi (C16) şi reprezintă subtipul alKac. Aceste date arată că în Yarrowia lipolytica există câteva sisteme de căi specifice de utilizare a n – alcanilor sau monooxigenaze specifice citocromului P450 [22]. Yarrowia lipolytica asimilează de asemenea, alcooli (etanol) până la concentraţia de 3%, acetat până la 0,4% şi biosintetizează sau degradează acizi graşi. De asemenea secretă acizi organici şi lizină. 2.6.3. Medii de cultură 2.6.3.1. Medii complete Mediu YPD – extract de drojdie – peptonă – glucoză Extract de drojdie 10 g/l Peptonă Bacto 20 g/l Glucoză 20 g/l Mediu YMG – extract de drojdie – extract de malţ – peptonă – glucoză Extract de drojdie 3 g/l Extract de malţ 3 g/l Peptonă Bacto 5 g/l Glucoză 10 g/l
YNB 6,7 g/l Se recomandă diferite concentraţii ale surselor de carbon: Glucoză 10 – 20 g/l Acetat de sodiu 4 g/l (concentraţie mai mare reduce dezvoltarea) Etanol 3% (concentraţii mai mari sunt toxice) N – alcanii, grăsimile şi acizii graşi nu au efecte toxice, şi uneori se pot folosi în concentraţii mari. Se pot folosi emulsificatori de genul Tween, dar nu este necesar, deoarece Yarrowia lipolytica secretă foarte eficient bioemulsificatori. Mediu minimal cu tiamină (MMT) Câteva tulpini de Yarrowia lipolytica se dezvoltă încet în YNB, de aceea se recomandă mediul cu tiamină, când se pot obţine rate înalte de creştere. NH4H2PO4 5 g/l KH2PO4 2,5 g/l MgSO4×7H2O 1 g/l Tiamină×HCl 0,3 mg/l Soluţie de microelemente 1 ml Soluţia de microelemente (mg la 100 ml) Ca(NO3)2×4H2O 2000 FeCl3×6H2O 200 H3BO3 50 CuSO4×5H2O 10 MnSO4×4H2O 40 ZnSO4×7H2O 40 Na2MoO4 20 CoCl2 10 KI 10
Adăugarea surselor de carbon este recomandată pentru YNB. pH este ajustat la 6 pentru majoritatea surselor de carbon şi la 4 pentru acetat sau acizi graşi. Uneori sunt probleme cu tulpinile care ascund multiple auxotrofii aminoacid şi în acest caz se utilizează 0,1% glutamină ca sursă de azot. 2.6.3.3. Medii de conjugare Frecvenţe înalte de conjugare au fost obţinute cu YM lichid sau solid fără glucoză. Adaosul de 0,05% citrat de sodiu creşte uşor frecvenţa conjugării.[23] Mediu YM – extract de drojdie – extract de malţ Peptonă Bacto 6 g/l Extract de drojdie 3 g/l Extract de malţ 3 g/l Agar Bacto 20 g/l
Sporularea poate fi indusă de către o varietate de medii lichide sau solide. Uneori, mediul folosit pentru inducerea sporulării la frecvenţe înalte, depinde de tulpinile utilizate. Sporularea celulelor diploide poate fi indusă de un mediu (V8), disponibil comercial sau de YM. O frecvenţă înaltă a sporulării este indusă de YNB sau MMT care conţine 1,5% citrat de sodiu. Concentraţiile mici sau mari de citrat de sodiu, reduc dramatic frecvenţa sporulării. Reducerea aeraţiei sau temperaturi de peste 300C, micşorează frecvenţa sporulării.[24] 2.6.3.5. Medii speciale Mediu lichid pentru inducţia proteazei Tulpinile se dezvoltă în faza exponenţială târzie sub o bună aerare la 230C pe mediu YPDm: Peptonă proteoză 50 g/l Extract de drojdie 10 g/l Glucoză 1 g/l Citrat de sodiu soluţie 0,2M pH 4 pentru proteaze acide Na2HPO4, KH2PO4 50 mM pH 6,8 pentru proteaze alcaline Inducţia demarează atunci când D.O.600nm este de 2 – 3. Nivele maxime se realizează după 24 de ore, la D.O.600nm de cca 18. Mediu complet de lapte smântânit pentru proteaze alcaline: se dizolvă 10g de lapte smântânit Difco în 60 ml soluţie fosfat de Na 0,1M pH 6,8, se fierbe 10’ pe baie de apă şi apoi se repetă această operaţie, după ce se lasă 24 de ore la temperatura camerei. Medii pentru inducţia lipazei: Clonele de lipaze pozitive sunt capabile să se dezvolte şi să formeze halouri clare pe mediu YNB cu tributirin (10 ml/l) ca singură sursă de carbon şi energie. Mediile lichide conţin ulei de măsline ca inductor, care poate fi utilizat şi în producţia şi purificarea lipazei. 2.6.4. Temperatura în procesul de cultivare Cele mai multe tulpini de Yarrowia lipolytica se dezvoltă la temperaturi sub 340C, dar sunt şi unele tulpini care sunt adaptate la temperaturi înalte. Temperatura recomandată pentru dezvoltare este cuprinsă între 25 şi 300C. Inducţia şi sporularea este mărită la 230C. Conjugarea şi sporularea au frecvenţa cea mai mare între 23 şi 280C, dar descreşte la temperaturi de peste 300C. Producţia de AEP este înaltă la 230C şi descreşte odată cu creşterea temperaturii [25]. 2.6.5. Valoarea pH în mediile de cultură Cele mai multe tulpini de Yarrowia lipolytica tolerează valori scăzute de pH, până la 3, dezvoltarea fiind redusă la pH 7 şi stopată la pH 8. Uneori, adaosul de soluţii cu pH mai mic de 7 sau valori scăzute de pH (pH 3,5 – 4) în mediu la începutul cultivării sunt recomandate pentru utilizarea sursei de carbon sub formă de acetat. 2.6.6. Rata de aerare Yarrowia lipolytica este obligatoriu aerobă, o presiune scăzută de oxigen reduce foarte puternic dezvoltarea. De aceea se recomandă o agitare puternică în cultivarea batch şi suplimentarea fermentaţiei cu cantităţi mari de oxigen. Pentru combaterea spumării, în special în timpul cultivării pe medii complete (YEPD), se adaugă câteva picături de ulei, care reduc formarea spumei. În cazul spumării, dezvoltarea microorganismului poate fi inhibată, deoarece celulele de Yarrowia lipolytica migrează rapid în spumă, având ca efect reducerea randamentului. 2.6.7. Aplicaţii biotehnologice 2.6.7.1. Secreţia de proteaze alcaline extracelulare (AEP) Tulpinile de Yarrowia lipolytica dezvoltate pe medii bogate (YPD), la pH 6,8 secretă 1 – 2 g/l proteaze alcaline extracelulare. AEP sunt codificate de către gena XPR2, care a fost identificată din cel puţin 11 gene care controlează sinteza, secreţia şi/sau activitatea AEP.Această genă a fost clonată şi secvenţializată din trei tulpini diferite. AEP este o protează de 32 Kda, din familia subtilizinei, care este procesată intracelular dintr-un precursor glicozilat de 55 Kda. Procesarea include clivarea presecvenţei de 15 aminoacizi şi glicozilarea într-un punct unic de pe propeptidă (în timpul translocaţiei în reticulul endoplasmatic), hidroliza procesivă a unei linii de O, N terminal dipeptide (X – Ala sau X – Pro), de către dipeptidyl aminopeptidaza Golgi, urmată de clivarea propeptidei în joncţiunea Lys – Arg, dinaintea părţii mature. Endopeptidaza este codificată de gena XPR6, omoloagă cu KEX2, care de curând a fost clonată şi secvenţializată [26]. 2.6.7.2. Secreţia de proteaze acide extracelulare Pe mediu YPD îmbogăţit, la pH 4, s-a detectat activitate proteazică acidă. Iniţial au fost descrise trei feluri de proteine de 28, 32 şi 36 Kda. Date recente arată că una dintre acestea este o protează acidă, iar inducerea acesteia are loc în condiţii similare cu cele utilizate pentru inducerea AEP, excepţie făcând valoarea pH mediului de cultură. Genele care codifică proteaza acidă au fost clonate şi secvenţializate şi distrugerea acestora, provoacă dispariţia proteazei acide.[2] 2.6.7.3. Secreţia de lipază şi esterază extracelulară Tulpinile de Yarrowia lipolytica dispun de activitate lipazică care acţionează preferenţial asupra resturilor oleil din poziţiile 1 şi 3 ale trigliceridelor. Activitatea lipazică a fost intens studiată, gâsindu-se diferenţe între diferitele tipuri de tulpini. Lipazele extracelulare necesită acid oleic ca stabilizator/activator însă nu şi celulele bagate în lipaze. S-a solubilizat lipaza celulară în doi monomeri de 39 respectiv 44 Kda, diferiţi între ei prin pH optim. Lipaza există şi în peretele celular ca activator, care este rapid disociat prin purificare enzimatică. Mutanţii incapabili să utilizeze tributirinul ca sursă de carbon au fost izolaţi după cultivare pe mediu îmbogăţit în nistatină şi definesc trei grupe complementare. Gena care codifică secreţia proteinei homoloage cu lipaza fungică a fost recent clonată şi poate fi utilizată independent [27]. Lipaza de Yarrowia lipolytica prezintă interes pentru sinteza monoesterilor acidului 2, 4-dimetylglutaric, transesterificarea diolilor mezo – ciclopentan sau este utilizată în industria pielăriei şi alimentară. Esteraza extracelulară termostabilă cu greutate moleculară mică (10.000 Da) este specifică pentru poziţia 1 a trigliceridelor şi a fost descrisă în urmă cu 10 ani [28].
A fost descrisă prima dată de Kamagata în 1964, stârnind de atunci un considerabil interes academic şi comercial. Este cunoscută foarte bine abilitatea tulpinii Candida maltosa de a se dezvolta pe o varietate de substraturi care includ n – alcani, acizi graşi sau carbohidraţi şi care au determinat investigaţii intensive privind fiziologia, biochimia şi genetica moleculară. Cele mai recente studii asupra acestei specii de drojdie se referă la procesele celulare fundamentale privind proteinele ţintă, biosinteza membranei şi rezistenţa la medicamente. 2.7.1. Morfologia drojdiei Candida maltosa Drojdia imperfectă Candida maltosa se prezintă mai ales sub formă de drojdie adevărată. Celulele sunt rotunde sau aproape rotunde, până la ovale cu dimensiunile de 2,5 – 7×3 – 8 m după dezvoltarea pe mediu îmbunătăţit (extract de malţ) şi se înmulţesc prin înmugurire multipolară. În cultivări submerse în condiţii de creştere limitate formează un pseudomiceliu (pseudohife) cu blastospori, însă fără clamidospori sau miceliu adevărat. Candida maltosa se caracterizează prin absenţa hifelor adevărate, a clamidosporilor, balistosporilor, clamidoconiilor şi artroconidiilor. Teleosporii şi ascosporii nu au fost observaţi în culturi mixte sau individuale. Mutantul spontan SBUG700 de Candida maltosa prezintă o morfologie pseudohifală (PHM) în condiţiile testate. Pe mediu solid cu extract de malţ, acest mutant formează colonii de culoare galben închis şi margine rugoasă, în contrast cu cele rotunde care sunt crem sau galbene cu margine întreagă şi netedă. Acest mutant s-a arătat a fi defectiv în cAMP, dependent de inactivarea catabolică a enzimelor gluconeogenezice [29]. 2.7.2. Relaţiile filogenetice ale Candida maltosa cu alte drojdii Progresul realizat în clonarea moleculară şi secvenţializarea genelor comparabile din diferite specii de drojdii, constituie baza unei înţelegeri mai bune a relaţiilor lor naturale de înrudire. Acest lucru este important în special pentru genul Candida, care este un ansamblu heterolog unit în majoritate pe absenţa totală a stadiului sexual (teleomorf). Relaţiile evolutive la câteva specii de Candida au fost recent descrise pe baza secvenţelor subunităţilor de ARN ribozomal (srARN). Secvenţele srARN sunt de obicei utilizate pentru analizele filogenetice la drojdii şi fungi. Investigarea poziţiei evolutive a drojdiei nepatogene Candida maltosa, care asimilează n – alcani s-a realizat recent, după clonarea şi secvenţializarea genelor SSRR a subunităţilor ARN ribozomal 18s (Figura 3) [30]. Arborele filogenetic construit prin metoda valorilor convergente, arată că Candida maltosa formează un subgrup linear cu Candida tropicalis, Candida viswanathii, Candida albicans, Candida parapsilosis şi Candida quilliermondii, în cadrul acestui gen Saccharomyces cerevisiae, Candida kefir, Kluyveromyces lactis, Candida glabrota, Hansenula polymorpha şi Candida krusei formează un alt subgrup, la distanţă relativ mare de Candida maltosa şi de Candida lusitniae şi Yarrowia lipolytica, care au fost excluse din aceste două subgrupuri. Pe baza rezultatelor comparative ale ARN5S, Yarrowia lipolytica este cea mai divergentă între aceste specii.
Datorită aplicaţiilor sale în biotehnologie, Candida maltosa a fost intens studiată din punct de vedere al fiziologiei dezvoltării şi a compoziţiei biomasei. Din punct de vedere fiziologic au fost investigaţi următorii parametrii: temperatura şi pH dezvoltării, rata de creştere () şi randamentul (conversia surselor de carbon biologic în biomasă microbiană), aspecte termodinamice (conceptul de substrat auxiliar şi compoziţia biomasei). 2.7.3.1. Temperatura şi pH Candida maltosa aparţine drojdiilor mezofile, având o temperatură optimă pentru dezvoltare cuprinsă între 32 – 340C, dar se dezvoltă şi la 370C şi mai slab la 40 – 410C. Odată cu creşterea temperaturii, descresc randamentul şi conţinutul în proteină, dar gradul de descreştere este dependent de tulpină. Drojdia Candida maltosa se dezvoltă în principal la pH optim între 4,2 – 4,6 [31]. Pentru dezvoltarea optimă pe mediu minimal, Candida maltosa necesită vitamine, în special biotină. Dependenţa de biotină pentru dezvoltare este foarte mare, atunci când are loc pe hidrocarburi, faţă de carbohidraţi, în special la utilizarea n – alcanilor cu lanţuri scurte. 2.7.3.2. Rata de dezvoltare şi randamentul În mediu cu săruri minerale, Candida maltosa este capabilă să se dezvolte în condiţii optimale, fără nici o limitare în cultivarea batch de laborator, cu rate specifice de creştere comparabile de 0,55 – 0,6 h-1 pe glucoză ca singură sursă de carbon şi energie şi respectiv 0,45 – 0,5 h-1 pe hexadecan. O relaţie similară, dar la valori inferioare ale lui a fost descrisă atunci când s-a utilizat un amestec de glucoză şi n – alcani. În condiţiile de scădere a conţinutului de oxigen din mediu, (sau parametrii corespunzători dezvoltării) scade puternic, dar creşterea limitării oxigenului este dependentă de substratul utilizat. În cultura continuă, tulpinile de Candida maltosa se pot cultiva pe carbohidraţi sau n – alcani la rate de diluţii D, cuprinse între 0,05 – 0,5 h-1. Ratele optime de diluţie pentru obţinerea unui randament crescut în producţia de biomasă sunt între 0,2 – 0,3 h-1. Aceste valori au fost realizate în bioreactoare industriale performante, care asigură o rată înaltă a transferului de masă şi căldură. Cel mai mare transfer de masă este obţinut în bioreactoarele cu recirculare. Au fost efectuate studii de eficienţă economică a proceselor biotehnologice de obţinere a biomasei, care sunt dependente de parametrii fiziologici (randamentul sau rata de conversie a substratului), de condiţiile de mediu (concentraţia sursei de carbon şi energie) şi de starea celulelor. Aceste studii pentru analiza şi stabilirea parametrilor fiziologici, includ măsurători calorimetrice foarte performante şi consideraţii termodinamice exprimate:
În aceste investigaţii pentru optimizarea producţiei de biomasă cu Candida maltosa a fost inclus conceptul de utilizare a substratului mixt sau conceptul de substrat auxiliar. În acord cu acest concept combinarea substraturilor deficiente în energie (glucoză, sucroză, acetat, formiat) cu substraturile bogate în energie (n – alcani, acizi graşi, etanol), trebuie să ducă la îmbunătăţirea coeficienţilor de randament specific, la reducerea producţiei de căldură şi la creşterea ratei de dezvoltare şi a vitezei de utilizare a substratului pentru producţia de biomasă, de către microorganismele capabile să consume simultan ambele tipuri de substrat, fără efectele de inhibiţie sau represie (catabolică). Acest concept a fost verificat cu drojdia Candida maltosa la utilizarea simultană a sucrozei şi hexadecanului (utilizând un amestec de 85% W/W sucroză şi 15% W/W parafine) ca substraturi în cultivarea batch şi hexadecan şi formiat, hexadecan şi izopropanol, sau etanol şi formiat în cultură chemostat [34]. De asemenea eficienţa energetică legată de starea substratului este importantă în această cercetare, pentru optimizarea amestecurilor de substraturi. Astfel sistemele fermentative sucroză/drojdie, parafină/drojdie şi sucroză/parafină/drojdie au fost studiate utilizând populaţii sincrone, produse prin metoda culturilor fazate. Amestecul teoretic optimal de 85% W/W sucroză şi 15% W/W parafină, pentru rata optimă de creştere, coeficienţii de utilizare a carbonului şi oxigenului şi formarea căldurii specifice au fost verificaţi pe date experimentale. În alte condiţii de amestec, nu s-a observat utilizarea simultană a ambelor substraturi. 2.7.3.3. Compoziţia biomasei Compoziţia biomasei de Candida maltosa este variată şi depinde de condiţiile de dezvoltare utilizate. În mod natural, tulpinile conţin între 50 – 60% proteină totală (azot total × 6,25)sau 40 – 45% proteină adevărată, determinată conform metodei Lowry, raportată la biomasa uscată. Biomasa provenită din celule crescute pe n – alcani, conţine mai mult de 25 – 30% carboxidraţi totali (polizaharide 8 – 10% formate din manan cu moleculă mare, 3 – 4% manan cu moleculă mică, 11 – 15% glucan localizat în special în pereţii celulari, 1,5 – 2% glicogen şi 0,7% trehaloză), însă conţinutul în lipide este 13 – 14% şi de proteine 35 – 37% şi un conţinut scăzut în acizi nucleici. Biomasa de Candida maltosa conţine 4 – 5% lizină, 0,8 – 1,5% aminoacizi cu sulf şi un total de 23,5 – 26% aminoacizi esenţiali [35]. 2.7.3.4. Medii de cultură Mediul (complex) complet: YPD (YEPD) – 1% extract de drojdie, 2% peptonă Bacto, 2% dextroză (glucoză). Mediul sintetic cu săruri minerale (minimal): YNB azot de drojdie bazat pe aminoacizi (Difco): Candida maltosa se dezvoltă bine în YNB cu adaos de sursă de carbon (1 – 2%) glucoză, glicerol, etanol sau n – alcani. YNB este adesea notat SD (0,67% YNB şi 2% dextroză (glucoză)) sau SG (0,67% yNB şi 2% galactoză). Alte medii cu săruri minerale: două medii cu săruri minerale au fost cel mai mult utilizate pentru investigaţii cu tulpina Candida maltosa (Tabelul 4) [36]. Tabelul 4. Conţinutul celor două medii în 1.000 ml apă bidistilată.
Yüklə 216,1 Kb. Dostları ilə paylaş:
|
,
,
