2011 YÜksek lisans tez özetleri

FİCEN Semra Zuhal

Danışman : Prof. Dr. Şehnaz BOLKENT

Anabilim Dalı : Biyoloji

Programı : Zooloji

Mezuniyet Yılı : 2011

Tez Savunma Jürisi : Prof Dr. Şehnaz BOLKENT

Prof Dr. Tuncay ORTA

Prof Dr. Seyhan ALTUN

Doç Dr. Gül ÖZCAN ARICAN

Doç Dr. Leman YALÇINTEPE GÜNEŞTUTAR

Yeni Sentelenen Nanotaşıyıcıların Gen Salım Amacıyla DNA ile Etkileşimlerinin İncelenmesi

Gen salımı uygulamaları başta kanser olmak üzere, kardiyovasküler sistem hastalıkları, tek gen bozukluğuna bağlı hastalıklar, nörolojik ve immunolojik hastalıklar gibi pek çok hastalığın tedavisinde; terapötik geni hedeflenen doku ve hücrelere başarıyla taşımayı amaçlamaktadır. Terapötik geni hedeflenen bölgeye taşımada uygun vektör kullanımı oldukça önem taşımaktadır. Gen salımı uygulamalarında kullanılan taşıyıcılar viral ve viral olmayan vektörler olarak iki alt sınıfa ayrılmaktadır. DNA’yı hücreye taşımada, viral vektörler viral olmayan vektörlerden daha önce kullanılmaya başlanmıştır, fakat viral vektörlerin sahip olduğu immün yanıtı uyarma, konak genomuna katılma, DNA taşıma kapasitesi azlığı gibi dezavantajlarından dolayı viral olmayan doğal ve sentetik DNA taşıyıcıları tasarlanmaya başlanmıştır. Nano boyutta tasarlanan bu vektörler, hücresel alım, hücre içinde taşınma, doğru zamanda endozomdan kurtularak DNA’yı endozomal/lizozomal enzimlere karşı yıkımdan koruma ve terapötik geni hücre nukleusuna ulaştırma gibi hücresel bariyerlerin üstesinden gelirken aynı zamanda ucuz ve kolay üretilebilir olmalı, immün sistemi uyarmamalı, sitotoksik olmamalı, in vivo’da kararlı yapıda kalarak dolaşımda uzun süre kalabilmeli ve biyouyumlu olmalıdır.

Bu tez çalışmasında, yeni sentezlenen BG-2 oligoelektrolit kopolimerinin gen salımı amacıyla kullanıma uygun olup olmadığını belirlemek açısından, fizikokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu yapıldı. Ayrıca fizikokimyasal ve biyofiziksel açıdan incelenen molekülün DNA ile etkileşim deneylerinden elde edilen sonuçlar hücre kültüründe transfeksiyon ve sitotoksisite çalışmalarıyla desteklenmiştir.

BG-2 oligoelektrolit molekülünün DNA ile etkileşiminden önce, molekülün fizyolojik ortamda nasıl bir davranış gösterdiğini anlamak amacıyla kritik misel konsantrasyonu floresans spektroskopi yöntemiyle çalışıldı. BG-2/pDNA komplekslerinin fizikokimyasal özellikleri olan boyut ve zeta potansiyel ölçümü lazer tekniğiyle, kararlı yapıda kompleks oluşumunun gösterilmesi ise agaroz jel elektroforezi tekniğiyle çalışıldı. DNA paketlenmesi, anyonik ve nötral model membranlar ile etkileşimi floresans spektroskopi yöntemiyle incelendi. Daha sonra in vitro ortamda HeLa hücre soyunda, molekülün transfeksiyon verimini belirleme amacıyla, GFP ekspresyonu floresans mikroskopta görüntülendi. Son olarak, BG-2 oligoelektrolit molekülünün HeLa hücre soyu üzerindeki sitotoksisitesini belirlemek amacıyla, spektrofotometrik yöntemlere dayanan MTT ve BCA testleri yapılmıştır.

Yapılan bu incelemeler sonucunda, BG-2 oligoelektrolit molekülünün kritik misel konsantrasyonu deney sonucuna göre, misel benzeri yapı oluşturduğu belirlendi. Boyut incelemeleri sonucunda, oluşan kompleks boyutlarının 150 nm’nin altında olması molekülün hücreye girişi açısından verimli olarak değerlendirildi. Zeta potansiyel ölçüm sonuçları, (+) yük dağılımına sahip molekülün (-) yüklü pDNA’yı nötralize edip paketlediğini ortaya koydu. Kompleks oluşumu deneyinde, kompleks şeritlerinde serbest pDNA bantlarına rastlanmaması kompleksin kararlı yapıda olduğunu gösterdi. DNA paketlenmesi deney sonuçlarına göre, molekülün sığır DNA ve pDNA’yı paketlediğini ve belli oranlarda ticari olarak elde edilen jetPEI’ya göre daha başarılı olduğunu ortaya koydu. Anyonik ve nötral model membranlarla etkileşimin gösterilmesinde ise, pozitif yüklü kompleks beklenildiği gibi anyonik model membranla etkileşime girerken, nötral model membranla etkileşime girmemiştir. Hücre transfeksiyonunda her ne kadar çok verimli sonuç alınamasa da, az da olsa transfeksiyonun gerçekleşmesi umut vaadedici olarak değerlendirildi. Toksisite profiline bakıldığında ise, molekülün HeLa hücre soyu üzerindeki toksisitesi kabul edilebilir düzeyde bulundu. Bütün bu deney sonuçları çerçevesinden bakıldığında, BG-2 oligoelektrolit molekülünün gen salımı amacıyla kullanılabilir olacağı, fakat transfeksiyon verimini arttırmak için molekül üzerinde bazı modifikasyonların yapılması gerektiği düşünülmektedir. Molekülün yeni sentezlenmiş olmasına rağmen, gen salımı amacıyla anlamlı sonuçlar vermesi, in vivo araştırmalardaki başarısından sonra, gelecekte klinik uygulamalarda da kullanılabileceğini düşündürmektedir.