Achkar yamina Doctorat d’Etat Champs Disciplinaire

Résumé : 

Erwinia chrysanthemi (Ech) est une entérobactérie phytopathogène, responsable de la bactériose "pourriture molle" de plusieurs plantes à intérêt économiques et ornementales, au champ ou au stockage. L’infection est causée par les outils agricoles, eaux d’irrigation, semence infectée et/ou insectes. Le traitement de cette bactériose se fait essentiellement par utilisation des produits chimiques. Cependant ce dernier, a perdu son attraction en raison du développement des souches résistantes et leurs effets indésirables sur l’environnement, d’où la nécessité de chercher des microorganismes antagonistes et leurs usage dans le bio-contrôle. Les actinomycètes sont connus par la production des métabolites secondaires biologiquement active et donc peuvent être utilisé comme agent de bio-contrôle contre les bactéries phytopathogènes. Un traitement efficace nécessite d’abord la détection de l’agent phytopathogène. Cette détection se fait le plus souvent par des tests biochimiques et microbiologiques qui sont, quoi que fiables, demandent beaucoup de temps. La mise au point d’une technique rapide et fiable comme la PCR pour détecter Ech dans les plantes malades est devenu une nécessité.

Ce travail de recherche traite dans un premier temps, pour la première fois, la détection spécifique d’Ech par amplification du gène msrA à partir du macérât. En effet, aucune amplification n’a été détectée en utilisant comme matrice l’ADN de plusieurs bactéries montre la spécificité de détection d’Ech. Le seuil de détection in vitro d’Ech par PCR est de 4 cellules par mélange PCR. In vivo (à partir du macérât), le seuil de sa détection sans extraction d’ADN génomique et sans enrichissement est de 5 à 6 cellules. La pourriture molle de 20 tubercules de pomme de terre et de 30 carottes a été analysée pour détecter l’agent causal. Aucune amplification du gène msrA n’a été obtenue alors que l’amplification de l’ADNr 16S est positive Ce qui suggère que ces pourritures sont dues à des bactéries autres qu’Erwinia chrysanthemi. Cette technique a été mise en application et validée par la détection d’Ech chez un insecte (un coléoptère non identifié) qui a été confirmée par séquençage de l’ADNr 16S et msrA.

Dans un deuxième temps, l’étude de la lutte microbiologique contre Ech a été réalisée en utilisant des actinomycètes isolés à partir d’un sol dans la région de Fès. Sur 50 isolats testés, 14 se sont révélés inhibiteurs de la croissance d’une seule des deux espèces d’Erwinia (E. chrysanthemi et E. carotovora). Parmi ces isolats d’actinomycètes, Streptomyces cinereoruber identifiée après séquençage de l’ADNr 16S, a été choisie pour la caractérisation de son ou de ses produits bioactifs. Les résultats obtenus ont montré que ces produits sont sécrétés à partir du 6^éme jour, qu’ils restent stables dans l’eau pendant 30 jours à 4°C et sont extractibles par l’acétate d’éthyle. C’est un aspect intéressant de ce travail et ouvrant des perspectives fort prometteuses en termes de bio-contrôle contre la pourriture molle causée par Ech.

Mots-clés : Erwinia chrysanthemi, pourriture molle, insecte, actinomycètes, PCR, lutte microbiologique.
DETECTION OF ERWINIA CHRYSANTHEMI BY PCR DIRECTLY FROM MACERATED AND CONTRIBUTION TO THE MICROBIOLOGICAL CONTROL OF THE SOFT ROT

Abstract:
Erwinia chrysanthemi (Ech) is a pathogenic enterobacteriaceae responsible of the soft rot disease in several economic plants during the storage or in the field. Contamination is principally driven by the agricultural tools, seeds or irrigation water. Treatment of this disease is essentially done using chemical substances. However, chemical treatment is being less effective because pathogenic strains acquire resistance to these chemicals, hence, it is necessary to look for new strategies based on bio-control. Actinomycetes are well known by their production of secondary metabolites, mainly antibiotics, where their use can be extended to treat plant diseases in the field. The first step in the bio-control approach is to detect the phytopathogen. This detection is generally performed by the microbiological and biochemical methods, which are expensive and time consuming. Molecular approach can be easily used after the setup of the PCR conditions to specifically detect the target phytopathogen.

In this work, we have for the first time established the specific detection of Erwinia chrysanthemi (Ech) by amplifying the msrA gene from macerate. Indeed, primers used for the specific detection were unable to detect other bacteria in the same conditions. The threshold of detection of Erwinia chrysanthemi (Ech) in vitro was calculated as 4 UFC/PCR mixture. In vivo studies showed that the threshold of detection directly from the macerate is 4 to 6 UFC/PCR mixture. 20 potato tubercles and 40 carrots were used to validate the developed detection strategy. According to the obtained results, no amplification of the msrA gene was observed, however, positive contol used showed that there is an amplification of the 16S rRNA gene. These results suggest that soft rot is also attributed to other bacteria. This technique was validated from a coleopteran insect in which we have detected the presence of Erwinia chrysanthemi (Ech) and the sequence was confirmed by sequencing.

In another work, bio-control was assessed against Erwinia chrysanthemi (Ech) using an isolated Actinomycete from soil. Out of 50 isolates 14 isolates were capable to inhibit the growth of two Erwinia species. Streptomyces cinereoruber was further characterized and the 16S rRNA gene sequence was determined. Results obtained for the bio-control, related to the secondary metabolites produced by this bacterium showed that production of the growth inhibitors starts from the 6^th day of growth of Streptomyces cinereoruber, and the product remains stable in water for a long period of time (30 days) at 4°C. the active compounds seems to be ethyl acetate extractable.

This work presents promising results in order to generalize the use of such strain against pathogenic species of the genus Erwinia.

Key Words :

Erwinia chrysanthemi, Soft rot, Insecte, actinomycetes, microbiological control.

Contribution à l’évaluation de Supports

Multimédias Pédagogiques

« Expérimentation d’un Didacticiel d’Optique Géométrique »
Par

AHAJI Khalid
Champs Disciplinaire : Physique / Didactique de la Physique

UFR : Didactique des Mathématiques et de la Physique

Soutenu le : 23 Octobre 2010
Membres de jury : 

Moncef ZAKI, Président	Faculté des Sciences Dhar El Mahraz, Fès
Abdelkrim El HAJJAMI, Rapporteur	Ecole Normale Supérieure , Fès
Ahmed Fal MERKAZI, Rapporteur	Ecole Normale Supérieure, Marrakech
Nadia BENJELLOUN, Rapporteur	Faculté des Sciences Dhar El Mahraz, Fès
Samir BENNANI, Membre	Ecole Mohammedia d’ingénieurs, Rabat
Lotfi AJANA, Membre	Ecole Normale Supérieure, Fès