Agrobiotexnologiya fanidan laboratoriya ishlarini bajarish uchun

О‘SIMLIK HUJAYRASIDAN DNK AJRATISH 
Rekombinant DNKlar texnologiyasiga asoslangan gen-muhandisligi tajribalarida 
ajratilgan DNK genom klonlarining bankini yaratishda, foydali genlarni aniqlashda, 
genom bankidagi klonlardan shu genlarni topish uchun zondlarga ega bо‘lish uchun 
zarurdir. 
Gen muhandisligida genlarni ajratib olish, ularning strukturasini, ekspressiyasini 
о‘rganishda DNKni toza holda ajratib olish muhim axamiyatga ega. 
О‘simlik DNKsini ajratish quyidagi bosqichlarni о‘z ichiga oladi. 
1.
Hujayra 
tо‘qimalarini 
maydalash, 
hujayra 
devorini 
parchalash 
(gomogenizatsiya), odatda suyuq azot yoki quruq muz yordamida amalga 
oshiriladi. 
2.
Hujayra membranalari parchalanib (hujayra lizisi) DNKning ekstraksiya 
buferiga chiqishi uchun dodetsilsulfat natriy (505), setiltrimetilammoniumbromid 
(STAV), sarkozil (I-laurilsarkozinat natriy) kabi detergentlardan foydalaniladi. DNKni 
gidrolizlovchi 
fermentlar-nukleazalardan 
himoya 
qilish 
uchun 
EDTA 
(etilendiamintetrasirka kislota) qо‘llaniladi. 
3.
DNKni oqsillardan tozalash (deproteinzatsiya) xloroform va fenol yordamida 
ekstraksiya qilish orqali amalga oshiriladi. DNKni chо‘ktirishda etanoldan 
foydalaniladi. 
Material va asbob-uskunalar: 
4 gr 14-kunlik g‘о‘za barglari, hovoncha, 
sentrifuga, sentrifuga stakanlari, 2 ta kolba, 2 ta stakan, shisha tayoqcha, refraktometr, 
dializ qog‘ozi, magnitli aralashtirgich, spektrofotometr, muzlatgich. 
ISHNING BORISHI: 
1.
4 g barg havonchada suyuq azot yordamida kukun holiga kelguncha maydalanadi. 
2.
Kukunni 50 ml bufer V bilan birga kolbaga solinadi, 20 daqiqa davomida 
aralashtirib turiladi. 
3.
30 ml fenol qо‘shiladi va yana aralashtiriladi (30 daq.) 
4.
K-23 sentrifugasida 10°Sda 5000 ay/daq tezlikda 1 soat aylantiriladi. 
5.
Ustki qismi toza kolbaga olinib, teng miqdorda fenolxloroform aralashmasi solinib, 
10 daqiqa aralashtiriladi. 

---

6.
30 daq. 10°Sda 5000 ayl./daq tezlikda sentrifugalanadi. 
7.
Ustki qismini olib teng miqdorda xloroform qо‘shilib, 10 daqiqa aralashtiriladi va 
yana sentrifugalash yо‘li bilan fazalarga bо‘linadi. 
8.
Suyuq qismi, 2 miqdor etil spirti solingan stakanga asta sekinlik bilan aralashtirilib 
muzlatgichga qо‘yiladi.«Meduza» hosil bо‘lgandan sо‘ng tayoqchaga о‘rab olinib 10 
ml DNK erituvchi (TE) buferida stakanda eritiladi. 
9.
Suyuqlik sentrifuga probirkalariga solinadi tenglashtirib og‘zi mahkamlangandan 
sо‘ng 20 soat 50000 ay/daq. tezlikda (15°S) sentrifugalanadi. 
10.
UF nurlari ostida DNK shprits yordamida tortib olinadi. 
11.
DNKni etidiy 
bromididan izoamil spirtida 5 marta ekstraksiya qilib tozalanadi. 
12.
DNKni seziy xlordan TE buferida 4°C da 24 soat magnitli aralashtirgichda buferni 
bir necha marta almashtirib dializ qilish yо‘li bilan tozalanadi. 
13.
DNK 
miqdorini 
spektrofotometrda 260 nm tо‘lqin uzunligida 
kvarsli kyuvetada о‘lchanadi. 
V buferi: 
0,2 M NaS1, 
0,05 M NS1 rN 8,0, 
0,01 M EDTA 
0,01 M DDT 
0,2% SDS. 
Fenol. 0,1 M NaS1; 0,1 M tris-NS1, rN 8,0; 0,01 M EDTA bilan 
tо‘yintirilgan. 
Xloroform :izoamil spirti (24:1) TE-buferi 10 mM tris NS1, rN 8,0 1 m 
4,5 g seziy xloridning TE buferda eritmasi. Etidiy bromid eritmasi 10 mg/ml. 
Dializ uchun bufer: 10 mM tris rN 8,0 , 1mM EDTA