Aplicaţii biotehnologice ale bacteriilor din genurile streptomyces Şi bacillus

Deoarece nu există o corelaţie strictă între ţintele antibioticului şi căile metabolice în care el este format, este riscant să se spună că toţi metaboliţii secundari manifestă o anumită activitate biologică, mai ales dacă ţinem cont de faptul că de multe ori aceşti compuşi au semnificaţie numai pentru om şi mai puţin pentru organismul producător.

Deşi cercetările asupra utilităţii medicale a antibioticelor s-au referit în special la activitatea antibacteriană, în prezent sunt studiate acţiunile unor asemenea substanţe şi asupra unor alte tipuri de celule, eucariote. Un exemplu în acest sens îl constituie monensinul, identificat iniţial în culturi de Streptomyces cinnamonensis şi care în prezent este utilizat pe scară largă ca şi coccidiostatic sau ca stimulator al creşterii animalelor (Vining, 1990).

O problemă care se pune în cazul producerii de substanţe antibiotice este aceea a modalităţilor în care bacteriile producătoare rezistă la acţiunea acestor substanţe care de obicei inhibă creşterea sau alte procese biochimice esenţiale. Pentru a elimina efectul de inhibare a creşterii, bacteriile producătoare pot prezenta mai multe mecanisme de rezistenţă: modificarea situsului ţintă al antibioticului, modificarea permeabilităţii membranare sau inactivarea metabolitului toxic (Cundliffe, 1989). Deoarece antibioticele sunt rapid eliminate în exteriorul celulei pe măsură ce el este produs, inactivarea celulară nu afectează eficienţa produsului extracelular.

Un studiu efectuat asupra rezistenţei la antibiotice a tulpinilor bacteriene sensibile ("ţintă") a evidenţiat faptul că antibioticele excretate în mediu şi care acţionează în vecinătatea organismului producător au semnificaţia unor factori implicaţi în competiţia pentru resurse. Rezistenţa la antibioticele obţinute a fost observată la multe tulpini bacteriene de colecţie, izolate înainte de introducerea acestor antibiotice în practica medicală ceea ce sugerează ideea că populatiile bacteriene vin în contact cu asemenea compuşi în mediul lor natural de viaţă. De asemenea, unii metaboliţi toxici chiar dacă nu au o valoare antibiotică mare, ei pot potenţa activitatea altor antibiotice faţă de care s-a instalat rezistenţa la numeroase tulpini bacteriene. Acesta este cazul acidului clavulanic produs de tulpini de S.clavuligerus care are o slabă activitate antibiotică dar care determină o sporire a acţiunii unor antibiotice β-lactamice cum este cefamicinul prin inhibarea β-lactamazelor pro-duse de tulpina bacteriană ţintă.

Antibioticele descoperite până în prezent şi utilizate mai mult sau mai puţin intens în practica medicală pot fi clasificate ţinând cont de diferite criterii: modul de acţiune, natura chimică, spectru de acţiune etc.

O abordare recentă a structurii unor antibiotice consideră că acestea, alături de un număr mare de metaboliţi sintetizaţi atât de către bacterii cât şi de fungi sau plante, pot fi grupate într-o familie de compuşi denumiţi poliketide (Hopwood şi Sherman 1990). Toţi aceşti compuşi au în comun prezenţa unor grupări keto la nivelul unor atomi de carbon foarte variaţi ca poziţie în molecula respectivă. Printre compuşii incluşi în această familie menţionăm: tetraciclinele, antraciclinele, eritromicina, rifamicinele, granaticinul, avermectinul (toate sintetizate de către streptomicete), aurantininul (sintetizat de Bacillus sp.) mupirocin (elaborat de Pseudomonas sp.) precum şi ale substanţe elaborate de celule eucariote: micotoxine, flavonoizi, fitoalexine etc.

1. 
   Antibiotice care inhibă sinteza peretelui celular
   

După descoperirea penicilinei de către Fleming în 1929, un număr mare de antibiotice înrudite cu aceasta au fost izolate, ele având în comun structura chimică (sunt β-lactami) şi modul de acţiune (inhibarea sintezei peretelui celular bacterian).

Deşi penicilinele au fost descoperite ca fiind produse de către fungi, s-a dovedit că asemenea antibiotice pot fi sintetizate şi de către unele specii de streptomicete cum ar fi: S.clavuligerus, S.lipmanii, S.lactamgens, S.cattleya (Martin şi Liras, 1989; Matsushima şi Baltz, 1989; Srinivasan şi colab.,1991).

Pe lângă antibioticele β-lactamice au mai fost izolaţi şi caracterizaţi şi alţi compuşi care afectează funcţiile membranei plasmatice. Un exemplu îl constituie nistatinul, antifungic produs de unele specii ale genului Streptomyces. Un alt grup este reprezentat de polimixine, bacitracine şi gramicidine, antibiotice polipeptidice produse de bacterii aparţinând genului Bacillus (B.polymixa, B.licheniformis, B.brevis). Aceşti compuşi determină creşterea permeabilităţii membranei plasmatice ceea ce are drept consecinţă ieşirea masivă a unor aminoacizi sau a unor derivaţi purinici şi pirimidinici din bacterie, conducând în final la moartea celulei. De asemenea, bacitracina acţionează asupra sintezei peretelui celular, determinând inhibarea biosintezei peptidoglicanului unor bacterii Gram negative.

2. 
   Antibiotice care inhibă sinteza proteinelor
   

Dintre antibioticele care afectează sinteza proteinelor, un loc important este ocupat de aminoglicozide, tetracicline şi cloramfenicol, toate cele trei grupe fiind sintetizate de specii ale genului Streptomyces..

Aminoglicozidele reprezintă un grup foarte important de antibiotice care au drept component principal unele glucide aminate. Primul antibiotic din acest grup care a fost descoperit în 1944 este streptomicina produsă de S.griseus, după care au fost izolate numeroase alte aminoglicozide de la bacterii aparţinând în principal genurilor Streptomyces şi Micromonospora: gentamicina produsă de specii de Micromonospora, neomicina produsă de S.fradiae, ribostamicina produsă de S.ribosidificus, kanamicina sintetizată de tulpini de S.kanamyceticus, butirozina produsă de B.circulans etc.(Okuda şi Ito, 1982).

Aminoglicozidele sunt antibiotice cu spectru larg de acţiune utilizate de obicei pentru tratarea unor infecţii produse de tulpini de E.coli, Klebsiella sp., Proteus sp., Enterobacter sp. Mecanismul prin care aceste antibiotice omoară celulele sensibile nu este pe deplin elucidat. Există numeroase date experimentale care evidenţiază că situsul primar de acţiune al acestor antibiotice ar fi ribosomii, ceea ce determină afectarea sintezei proteinelor. Efectele pleiotropice ale aminoglicozidelor asupra bacteriilor sunt considerate a fi consecinţa interacţiunii lor cu ribosomii. Alături de interferenţa cu sinteza proteică, aminoglicozidele induc distrugeri ale membranei plasmatice, afectează respiraţia celulară, acumularea de ARN şi determină în final moartea celulelor. In ceea ce priveşte mecanismul rezistenţei bacteriilor producătoare la acţiunea acestor antibiotice s-a evidenţiat faptul că acestea prezintă strategii diferite cum ar fi producerea unor enzime ce inactivează antibioticul sau modificarea situsului de acţiune al acestuia (Cundliffe, 1989). Spre exemplu, bacteriile producătoare de aminoglicozide sintetizează în acelaşi timp şi enzime ce modifică antibioticele respective: aminoglicozid-fosfotransferaza (APH) şi acetiltransferaza (AAC). De asemenea, bacteriile respective (S..kanamyceticus, S.tenebrarius) pot produce simultan şi enzime ce modifică unele situsuri de acţiune ale antibioticului (de exemplu, situsurile ribosomale) prin metilarea ARNr.

Tetraciclinele reprezintă un grup destul de heterogen de antibiotice produse în special de bacterii din genul Streptomyces ele având în comun o structură chimică de bază dar variind în funcţie de grupările chimice care se leagă de această structură: oxitetraciclina (produsă de S.rimosus), tetraciclina (produsă de S. viridofaciens), clortetraciclina (sintetizată de S.aureofaciens). Tetraciclinele prezintă un spectru destul de larg de acţiune fiind bacteriostatice pentru diferite bacterii Gram pozitive şi Gram negative (cu excepţia tulpinilor de Salmonella, Proteus şi Pseudomonas) şi bactericide în concentraţii mari. Tinta principală de acţiune a acestor antibiotice este sinteza proteică, ele neavând efecte evidente asupra ADN, ARN sau asupra sintezei peretelui celular. Modalitatea exactă a legării tetraciclinelor la ribosomi nu este încă pe deplin cunoscută. Se pare că ele se leagă puternic de subunitatea 70S a ribosomilor ceea ce determină efectul inhibitor al antibioticelor. De asemenea, tetraciclina se leagă slab de subunitatea 30S ceea ce are drept consecinţă blocarea legării aminoacil-ARNt la această subunitate şi deci a alungirii lanţurilor polipeptidice. Autorezistenţa bacteriilor producătoare poate include modificarea situsurilor ţintă normale, inactivarea intracelulară a antibioticului sau eliminarea sa rapidă din celulă (Cundliffe, 1989).

Cloramfenicolul este un antibiotic cu spectru destul de larg de acţiune, el fiind izolat în 1947 din filtrat de cultură de S.venezuelae. Acţiunea cloramfenicolului constă în împiedicarea ARN_m să se lege la ribosomi ceea ce se concretizează prin inhibarea sintezei proteice (a formării legăturilor peptidice) (Pongs, 1979).

3. 
   Antibiotice care inhibă replicarea şi transcrierea informaţiei genetice
   

Dintre antibioticele care împiedică replicarea ADN şi sinteza ARNm menţionăm novobiocina, coumermicina şi rifamicinele.

Novobiocina este un antibiotic cu o structură complexă produs de S.sphaeroides cu efect, de obicei, bacteriostatic asupra bacteriilor, mai ales în mediu acid. Similar ca acţiune este coumermicina A, un antibiotic izolat din culturi de S.rishinensis şi S.hazeliensis. La concentraţii mai mici de novobiocină şi cumermicină A este afectată doar replicarea ADN din celulele sensibile, nu şi procesul de transcriere. Cele două antibiotice pot afecta acţiunea ADN girazei, enzimă ce determină suprarăsuciri ale moleculei de ADN, ceea ce explică inhibarea replicării şi transcrierii informaţiei genetice (Ryan, 1979). Rezistenţa la novobiocină a bacteriei producătoare S.sphaeroides este determinată de gena gyrB al cărei produs, ADN giraza B este rezistentă la acţiunea acestui antibiotic (Cundliffe, 1989).

Rifamicinele, având ca reprezentat tipic rifampicina reprezintă un grup de antibiotice macrociclice care acţionează, în special, asupra micobacteriilor şi bacteriilor Gram pozitive. Mecanismul lor de acţiune se referă la inhibarea procesului de transcriere a informaţiei genetice prin blocarea acţiunii enzimei ARN-polimeraza.

Un alt antibiotic cu acţiune inhibitoare asupra acizilor nucleici este granaticinul, antibiotic de tip quinonic, izolat din culturi de S.olivaceus şi S.violaceoruber. Acţiunea sa „in vitro” se manifestă, atât la procariote cât şi la eucariote, asupra sintezei de ADN, ARN, dar şi de proteine. De aceea, granaticinul are efect antitumoral, împotriva leucemiei P388 şi efect citotoxic pentru celulele KB (Ogilvie şi Kersten, 1979).

1.2. Acţiuni asupra celulelor animale
Numeroase substanţe antibiotice nu au fost utilizate în practica medicală datorită acţiunii lor toxice asupra celulelor animale. Acest efect toxic rezultă din acţiunea directă asupra uneia dintre căile metabolismului primar, căi care sunt universale, de obicei, asupra producerii de energie sau exprimării genelor. Totuşi, toxicitatea asupra celulelor animale nu rezultă întotdeauna din inhibarea aceleiaşi reacţii care este ţintă la microorganisme. Spre exemplu, amfomicina care interferă cu transportul membranar al intermediarilor mureinei la bacterii, la celulele eucariote determină o blocare a glicozilării.

Unele antibiotice care au evidenţiat o activitate de inhibare a creşterii mai multor tipuri de organisme au început să fie utilizate ca substanţe antitumorale datorită toxicităţii lor asupra celulelor ce proliferează rapid. Printre aceste substanţe, un loc important îl ocupă antraciclinele şi bleomicina substanţe care sunt produse de specii ale genului Streptomyces (Tsukagoshi şi colab.,1986). Descoperite iniţial ca agenţi antibacterieni, s-a dovedit ulterior că cele două familii de substanţe se leagă specific, prin intercalare, la moleculele de ADN iar bleomicina, în plus, poate determina scindarea catenelor de ADN. Citotoxicitatea selectivă a bleomicinei rezultă din scăderea activităţii unei enzime de inactivare din celulele tumorale.

Un alt tip de produşi antimicrobieni sau inhibitori enzimatici cu activitate antitumorală este reprezentat de proteine de dimensiuni mici, cum ar fi: macromicinul, actinoxantinul, forfenicin sau bestatin, ce conţin o grupare prostetică cromoforă ce se intercalează în macromoleculele de ADN, modificându-le structura(Aoyagi şi colab.,1978).

Unii metaboliţi secundari manifestă acţiune farmacologică specificpă asupra animalelor; în acest caz ei nu prezintă o citotoxicitate generală, dar acţiunea lor farmacologică îi poate face uneori extrem de toxici. Un exemplu îl constituie acţiunea vasodilatatoare a unui compus (WS 1228A, B) izolat de la S. aureofaciens care însă nu este însoţită şi de toxicitate sau activitate antibiotică. Un alt compus, MY-336a, izolat din culturi de S. gabonae exercită acţiune antagonică cu receptorii β-adrenergici, avînd deci o acţiune farmacologică selectivă, netoxică (Kase, 1986). In cazul amicourmamicinei A izolate de la B. pumilis s-a evidenţiat iniţial o acţiune antibiotică, după care s-a dovedit a avea şi o activitate antiinflamatorie asupra animalelor testate (Itoh şi colab., 1981).

De asemenea, printre substanţele izolate iniţial în experimentele de screening pentru activitatea antibiotică au fost descoperite unele care au acţiune de modulare a răspunsului imun. Spre exemplu, substanţa IC201 izolată de la S.cirratus şi S fimbriatus ca agent antitumoral, s-a dovedit a avea acţiune activatoare şi asupra macrofagelor. Un alt compus, macrolidul FK 506 izolat de la S.tsukubaensis în cursul unor experimente de selecţie a unor substanţe care să inhibe producerea de interleukină-2 s-a dovedit a avea acţiune imunosupresoare.
1.2.1. Activitate insecticidă

S-a evidenţiat că numeroşi metaboliţi secundari produşi de streptomicete în special au acţiune insecticidă. Unii dintre ei, cum ar fi unele antibiotice macrolidice polienice, blochează respiraţia celulară sau inhibă sinteza proteică la eucariote, fiind astfel agenţi nespecifici. Alţi metaboliţi secundari, de tipul nikamicinei au acţiune specifică inhibând chitin-sintetaza şi deci acţionează asupra peretelui celular chitinos al insectelor. Un alt antibiotic, mibelmicina produsă de S. hygroscopicus subsp. aureolacrimosus, nu are efect antibacterian dar acţionează selectiv asupra insectelor având în plus şi efect antihelmintic şi acaricid.

Intr-un studiu recent, Fabre şi colab.(1988) au izolat în urma unui complex proces de selecţie realizat asupra a 6280 de culturi de actinomicete, o nouă substanţă cu acţiune insecticidă. O importantă acţiune insecticidă este datorată biosintezei de către unele tulpini bacteriene a chitinazei care acţionează direct asupra învelişurilor insectelor patogene.
1.3. Activitate asupra celulelor vegetale
Unii metaboliţi secundari produşi de bacteriile din genul Streptomyces au acţiune fitotoxică şi uneori antifungică. Spre exemplu, herbicidinele produse de S.sagonensis sunt nucleozide cu acţiune fitotoxică pentru plantele dicotiledonate. Ele inhibă, de asemenea, şi dezvoltarea fungilor. Alte substanţe, cum ar fi herbimicinele produse de S.hygroscopicus au o foarte slabă activitate antibiotică, în schimb sunt toxice pentru celulele vegetale. In plus, herbimicina A inhibă dezvoltarea virusului mozaicului tutunului şi are acţiune antitumorală pentru celulele animale (Yamashita şi colab., 1989). O altă substanţă, homoalanozina, produsă de S. galileus este un antimetabolit al acidului aspartic şi acidului glutamic, ea exercitând acţiune insecticidă şi herbicidă (Fushimi şi altii,1989).

De asemenea, numeroşi cercetători (Backman 1995, Baker 1985, Bachow 1995) au publicat date referitoare la capacitatea unor specii aparţinând genului Bacillus de a inhiba dezvoltarea unor ciuperci fitopatogene (Tabelul 1). In majoritatea cazurilor combaterea biologică a fungilor fitopatogeni implică folosirea factorilor biotici existenţi în mediul plantelor. Studiile efectuate până în prezent au evidenţiat capacitatea unor tulpini de Bacillus subtilis de a combate diferite ciuperci fitopatogene, cum ar fi : Macrophomina phaseolina – patogen la mazăre (Siddiqui 1995), Rhizoctomia solani - patogen la mazăre (Bochow 1994), fasole şi seminţe de grâu (Lazzareti 1994), Fusarium oxysporum şi Phytyum ultinacere – patogeni la tomate (Sadders 1996).

Cele mai frecvente specii ale genului Bacillus care au prezentat capacitatea de a preveni şi combate evoluţia unor boli determinate de ciuperci fitopatogene sunt: Bacillus subtilis (Figura 3), Bacillus licheniformis, Bacillus polymyxa, Bacillus cereus.

Figura 3. Acţiunea inhibitoare a tulpinii B.subtilis B2 asupra fitopatogenului Sclerotinia sclerotiorum.
Studiile privind oportunitatea utilizării acestor specii bacteriene în combaterea biologică s-au bazat pe proprietatea de a produce spori cu înaltă rezistenţă şi longevitate în condiţii naturale de mediu, acesta determinând posibilitatea obţinerii şi comercializării lor într-o manieră similară cu fungicidele chimice.

In lupta pentru nutrienţi microorganismele au la dispoziţie un întreg arsenal de compuşi chimici care inhibă organismele competitive. Mulţi din aceşti compuşi au origine peptidică şi pot fi sintetizaţi ribozomal sau neribozomal. Multe dintre tulpinile de Bacillus subtilis produc o serie de substanţe de natură lipooligopeptidică din gama iturinului, care au activitate antifungică, hemolitică precum şi proprietăţi antibiotice. Structura chimică a acestor substanţe a fost determinată prin diverse metode (spectrometrie de masă (MS), gel cromatografie, cromatografie în strat subţire (TLC), lichid cromatografie (HPLC)). Componenta proteică a acestor substanţe este reprezentată de oligopeptide alcătuite din şapte aminoacizi, iar componenta lipidică conţine acizi graşi cu catena carbonică lungă (C₁₄-C₁₆).

Astfel, iturin AL conţine o heptapeptidă (2 D-Asp, 1 L-Asp, 1 L-Glu, 1 L-Pro, 1 L-Ser, 1 D-Tir) şi un amestec de -amino acizi graşi cu catenă lungă C₁₄-C₁₆. Iturin D şi iturin E conţin o heptapeptidă (3 Asp, 1 Glu, 1 Pro, 1 Ser, 1 Tyr) şi un amestec de -amino acizi graşi cu catenă C₁₄-C_16, diferind de iturin A prin prezenţa unei grupări carboxil la iturin D şi o grupare carboximetil la iturin E. Mycosubtilin, o substanţă din gama iturinului, conţine o heptapeptidă ciclică (Asn, Tyr, Asn, Gln, Pro, Ser, Asn) legată de un -amino acid gras. Tot din gama iturinului fac parte surfactinul şi fengycinul care conţin un -hidroxiacid gras şi bacillomycinul care conţine un -amino acid gras.

Studii mai intense au fost efectuate cu o substanţă produsă de mai multe specii de Streptomyces (S. hygroscopicus, S. viridochromogenes) şi care a primit denumirea de bialafos (fosfinotricin-alanil-alanina). Aceasta substanţă a fost iniţial selectată pentru activitatea sa antibiotică după care s-a observat că ea are, de fapt, o acţiune mult mai complexă. Componentul activ al bialafosului este fosfinotricinul care inhibă glutamin-sintetaza din celulele vegetale, ceea ce îi conferă bialafosului o puternică acţiune herbicidă (Lea şi colab., 1984).

Mulţi dintre metaboliţii secundari produşi de diverse microorganisme au fost testaţi pentru eventuala lor acţiune asupra unor enzime. Atunci când sistemul test a inclus enzime cheie în procesele farmacologice de la animale, numeroşi metaboliţi secundari au fost detectaţi ca având activităţi fiziologice "in vivo". Mulţi dintre aceşti compuşi au fost descoperiţi a fi inhibitori proteazici, acţionând asupra pepsinei, papainei, tripsinei, chimiotripsinei, catepsinei, elastazelor, aminopeptidazei B şi leucin-aminopeptidazei (Umezawa, 1982). Printre inhibitorii proteazici izolaţi de la actinomicete unii acţionează asupra reninei sau asupra unei zinc-exopeptidaze care converteşte angiotensina I în angiotensină II.

Cercetările efectuate asupra culturilor microbiene au permis izolarea unor inhibitori şi ai altor enzime. Acesta este cazul inhibitorilor pentru glucozidaze (Muller, 1986), pentru cAMP (reticulol), pentru kinaze etc.

2. Determinismul genetic al biosintezei unor antibiotice si a altor metaboliti secundari
In urma experimentelor de cartare a genelor implicate în metabolismul secundar la procariote s-a evidenţiat faptul că acestea sunt grupate formând "clusteri". Localizarea acestor gene este, în majoritatea cazurilor, cromosomală dar, există cazuri cînd acestea sunt localizate pe plasmide (Hopwood, 1978; Kinashi şi colab.,1987). Spre exemplu, genele implicate în sinteza oxitetraciclinei de către S.rimosus sunt grupate în doi "clusteri" cromosomali (Binnie şi colab., 1989). La fel şi genele care determină sinteza actinorhodinului şi undecilprodigiozinului de către tulpini de S. coelicolor (Rudd şi Hopwood, 1979), a eritromicinei de către Saccharopolyspora erythraea (Weber şi altii, 1985) sau avermectinei de către Streptromyces avermectilis (Ikeda şi colab., 1987). In plus, evidenţierea faptului că aceste grupuri de gene includ şi elemente reglatoare ca şi determinanţi genetici de rezistenţă la produsul antibiotic respectiv sugerează existenţa unui sistem foarte bine organizat, cu funcţionare complexă. Nu este însă stabilit cu exactitate dacă această organizare a genelor există şi în cazul altor metaboliţi secundari, fără activitate antibiotică, cum ar fi unii pigmenţi, alcaloizi, reglatori ai celulei vegetale etc. (Martin şi Liras, 1989).

In ceea ce priveşte localizarea plasmidială a unor gene implicate în biosinteza unor antibiotice, datele referitoare la acest aspect sunt mai puţine. Un exemplu îl constituie genele pentru biosinteza metilenomicinei care se găsesc plasate pe plasmida SCP1 de la S. coelicolor (Wright şi Hopwood, 1978; Chater şi Bruton, 1985). De asemenea, de la bacteriile din genul Streptomyces au fost izolate o serie de plasmide lineare cu dimensiuni variate, între 5,4-17 Kb până la 350-520 Kb (Chardon-Loriaux, 1985; Kinashi şi colab., 1987). Evidenţierea plasmidelor lineare uriaşe la şase tulpini de Streptomyces producătoare de antibiotice şi examinarea corelaţiei dintre prezenţa lor şi sinteza de antibiotice a dus la concluzia că, cel puţin în cazul metilenomicinei, genele implicate în sinteza sa sunt plasate pe aceste plasmide care reprezintă aproximativ 5 % din cantitatea totală de ADN celular. Sunt însă necesare studii suplimentare pentru a stabili dacă şi în alte cazuri genele care determină sinteza unor antibiotice sunt localizate pe plasmide similare.

2.1. Organizarea şi exprimarea genelor pentru unii metaboliţi secundari sintetiza şi de specii de Bacillus
Cea mai mare parte a metaboliţilor secundari produşi de bacteriile din genul Bacillus sunt homo- sau heteropeptide. Spre exemplu, gramicidina S este un decapeptid ciclic format din douăă unităţi de D-Phe-L-Pro-L-Val-L-Orn-L-Leu, fiind produsă de tulpini de B. brevis, ca de altfel şi tirocidinele. Familia bacitracinelor cuprinde peptide alcătuite din 12 aminoacizi, produse de tulpini de B. licheniformis. Studiile cu extracte celulare au evidenţiat că aminoacizii constituenţi ai acestor compuşi sunt activaţi şi legaţi în subunităţile respective de către mai multe tipuri de peptid-sintetaze (Kleinkauf şi Van Dohren, 1987).

Experimentele de clonare în E. coli a genelor pentru sinteza gramicidinei şi tirocidinei au evidenţiat faptul că în cazul tirocidinei sunt implicate trei enzime multifuncţionale, în timp ce la producerea gramicidinei S participă cel puţin 2 sintetaze (GS1 şi GS2) codificate de două gene diferite grsA şi grsB.

2.2. Organizarea şi exprimarea genelor pentru unele antibiotice sintetizate de bacteriile din genul Streptomyces
In cazul streptomicetelor au fost evidenţiaţi numeroşi metaboliţi secundari, dar numai puţini au o structură peptidică. Unul dintre aceştia, bialafosul prezintă importanţă practică deosebită, deoarece manifestă activitate herbicidă. Recent, Nakajima şi colaboratorii (1991) au izolat de la S.hygroscopicus un nou compus cu activitate herbicidă, care a primit denumirea de hidantocidin. Bialafosul, care a fost mai intens studiat, este sintetizat pornind de la piruvat sau fosfoenolpiruvat, printr-o cale metabolică care cuprinde cel puţin 13 etape (Thompson şi Anzai, 1987). Experimentele de clonare cu genele implicate în sinteza acestui compus au evidenţiat faptul că în acest proces sunt implicate mai multe gene (cel puţin 7) grupate, alături de care se află şi gena pentru rezistenţa la bialafos (bar). Astfel, au fost obţinute două grupe de clone derivate de la mutante neproducătoare şi care au fost transformate cu plasmida pIJ61 recombinantă (conţinea diferite gene de la S.hygroscopicus). Un grup de asemenea plasmide recombinante restabileşte productivitatea mutantelor care prezintă modificări ale etapelor 5, 6, 12 şi 13 ale căii metabolice, în timp ce un alt grup restabilea producerea de bialafos de către mutantele blocate la nivelul etapelor 1, 3 şi 4. In plus, a fost realizat transferul unui segment de 16 Kb, care restabilea productivitatea tuturor celor 7 tipuri de mutante. Acest segment de ADN conţinea şi gena bar care, de altfel, a permis şi identificarea clonelor transformate. Totuşi, acest fragment nu determină o producţie semnificativă de bialafos la mutantele neproducătoare, ceea ce sugerează existenţa unor gene suplimentare aflate în afara segmentului de 16 Kb, necesare exprimării complete a operonului pentru sinteza bialafosului.

De asemenea, în urma experimentelor de clonare a genelor bar (de rezistenţă la bialafos) în diferite celule gazdă, inclusiv în celulele vegetale s-a evidenţiat faptul că pentru funcţionarea normală a genelor pentru biosinteza bialafosului sunt necesare încă trei gene diferite care determină adenilarea la diferite etape ale biosintezei. Aceste noi date conduc la presupunerea că genele implicate în biosinteza acestui compus se găsesc localizate la nivelul unui fragment de ADN de peste 34 Kb.

Experimentele lui Anzai si ale colaboratorilor (1987) au evidenţiat faptul că prin clonarea unui fragment de ADN de 5,9 Kb, care conţine gena brpA are loc activarea transcrierii atât a genei bar cât şi a cel puţin altor 6 gene structurale bap. De asemenea, aceşti autori au arătat că atât la S.viridochromogenes, cât şi la S. hygroscopicus organizarea genetică a genelor implicate în sinteza bialafosului este identică.

Un alt grup de metaboliţi secundari peptidici, actinomicinele (cromopeptide) este sintetizat în urma acţiunii unei enzime, fenoxazinon-sintetaza (PHS). Prin clonarea genei pentru PHS de la S. antibioticus în S. lividans (Jones şi Hopwood, 1984) s-au obţinut mai multe tipuri de clone: unele care conţineau gena structurală pentru PHS, iar altele care prezentau activitate PHS, dar care a rezultat în urma activării unei gene "tăcute" (silent gene) endogene de către fragmentul de ADN exogen transformant. Fenomenul este frecvent întâlnit în cazul streptomicetelor, el fiind semnalat şi în cazul tulpinilor producătoare de alţi metaboliţi secundari. Un exemplu îl constituie clonarea genelor pentru producerea cefamicinei de la S.cattleya la S.lividans, clonele producătoare rezultând în urma activării unor gene endogene silenţioase (Martin şi Liras, 1989).

Mulţi dintre metaboliţii secundari produşi de streptomicete au o structură de tip macrolidic în care inelul macrociclic derivat de la poliketide este închis printr-o legătură lactonică. La acest inel macrociclic sunt, de obicei, ataşate glucide bazice sau neutre. Spre exemplu, eritromicina produsă de Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythraeus) conţine un inel lactonic (eritronolid) şi 2 glucide specifice, dezozamina şi cladinoza, sinteza sa realizându-se în aproximativ 30 etape enzimatice Prin clonarea în S.lividans a unor fragmente de ADN cromosomal izolate de la tulpini de S.erythraea producătoare de eritromicină s-a stabilit că trei dintre genele implicate în biosinteza antibioticului, eryA, eryB şi eryC sunt grupate şi localizate într-o unică regiune a cromosomului bacteriei producătoare. Utilizând un vector de clonare integrativ (care se poate integra în cromosomul gazdei) s-a stabilit că alături de genele care determină sinteza antibioticului se află şi gena pentru rezistenţa la eritromicină, ermE (genă care determină sinteza unei metilaze pentru ARNr) (Stanzak şi colab., 1986). De asemenea, Mc Alpine şi colab. (1987) au comunicat obţinerea unui antibiotic hibrid care a primit denumirea de 2-noreritromicină, în urma clonării într-o mutantă de S.erythraea, care avea blocată ultima etapă a sintezei eritromicinei a unui fragment de ADN de 30-35 Kb izolat de la S.antibioticus producător de oleandomicină.

Un alt antibiotic, tilozina produs de tulpini de S.fradiae prezintă o structură chimică asemănătoare eritromicinei, având un inel macrociclic, tilanolid şi trei glucide mai puţin răspândite: micaminoza, micaroza şi micinoza. Studiile referitoare la organizarea genelor implicate în sinteza acestui antibiotic au evidenţiat faptul că genele tyl (aproximativ 9 gene) sunt grupate, alături de ele aflându-se şi gena de rezistenţă (tlrB), precum şi o secvenţă de ADN amplificabil flancată de 2 secvenţe repetate direct (Baltz şi Seno, 1988). De asemenea, s-a stabilit că pentru exprimarea genei tylF, care codifică enzima ce controlează ultima etapă a căii metabolice de sinteză a antibioticului este necesară o proteină reglatoare (efector pozitiv) produsă de gena tylG. O situaţie asemănătoare prezintă şi genele care codifică sinteza carbomicinei şi rezistenţa la acest antibiotic (Martin şi Liras, 1989).

Un alt grup de antibiotice derivate de la poliketide este reprezentat de tetracicline şi antracicline, antibiotice intens studiate datorită importanţei lor practice deosebite. In urma examinării mai multor tipuri de mutante incapabile de a sintetiza oxitetraciclina s-a dovedit că genele care codifică producerea acestui antibiotic se află localizate în două grupe plasate opus pe cromosomul bacterian. Prin clonarea în S.griseus a unor fragmente de ADN izolate de la S.rimosus s-a reuşit identificarea a două gene responsabile de rezistenţa la tetraciclină (Ohnuki şi colab., 1985): gena tetA care codifică un polipeptid care interferă cu sinteza proteinelor la nivel ribosomal şi gena tetB care determină o acumulare intracelulară redusă a antibioticului în celulele producătoare. Nu este, însă, clar dacă aceste gene se află localizate la nivelul celor douăă grupuri de gene sau au o altă dispunere. Au mai fost clonate şi alte gene de rezistenţă la tetraciclină, otcRI şi otcRII, dar nu s-a stabilit încă dacă aceste gene sunt sau nu identice cu cele anterioare. Recent, Butler şi colab. (1989) şi Binnie şi colab. (1989), au realizat o serie de clonări a unor gene implicate în sinteza şi rezistenţa la acest antibiotic şi au sugerat faptul că cel puţin o parte, dacă nu chiar toate genele structurale care codifică sinteza oxitetraciclinei sunt linkate cu genele de rezistenţă otcRI şi otcRII, formând, astfel, un singur "cluster".

O grupare asemănătoare prezintă şi genele implicate în biosinteza/rezistenţa tetracenomicinei C, un antibiotic antraciclinic produs de S.glaucescens.

Aminoglicozidele reprezintă un alt grup de antibiotice intens studiat datorită importanţei practice deosebite. Din acest grup streptomicinei i s-a acordat cea mai mare atenţie. Astfel, la S.griseus, cel mai cunoscut producător al acestui antibiotic, cel puţin 13 gene sunt implicate în biosinteza şi rezistenţa la streptomicină, ele fiind localizate într-un singur "cluster" cromosomal (Mansouri şi altii, 1989) (Figura 4).


Figura 4. Reprezentarea schematică a genelor implicate în biosinteza streptomicinei la două specii de streptomicete: S.griseus şi S.glaucescens.
Ohnuki şi colaboratorii (1985) au arătat că la S.griseus grupul de gene str este format din cel puţin 4 gene: strR, strA, strB şi strC. Gena strA codifică enzima streptomicin-6'-fosfotransferaza care asigură rezistenţa la acest antibiotic; strB complementează o mutaţie la o tulpină care prezenta deficienţă în legarea streptidin-6-fosfatului de dihidrostreptoză; strR este o genă reglatoare care codifică un efector pozitiv necesar exprimării complete a genelor strA şi strB. Rezultate similare au obţinut Distler şi colab.(1987), care au evidenţiat că la S.griseus genele necesare sintezei streptomicinei sunt linkate cu gena aphD care codifică pentru enzima streptomicin 6-fosfotransferaza, genă similară genei sph pentru enzima hidroxi-streptomicin-fosfotransferaza de la S.glaucescens. Analizele de restricţie şi studiile de hibridizare a fragmentelor de ADN de la S.griseus şi S.glaucescens au relevat existenţa, în ciuda unei omologii de aproximativ 75 % a genelor implicate în biosinteza streptomicinei, a unor diferenţe majore, ceea ce sugerează faptul că, în cursul evoluţiei a avut loc o separare a genelor de biosinteză în două seturi distincte repartizate doar la speciile de Streptomyces (Martin şi Liras, 1989).
2.3. Organizarea şi exprimarea genelor de biosinteză a unor pigmenţi de către streptomicete
Streptomicetele pot sintetiza pe lângă diferite antibiotice şi alţi metaboliţi secundari, cum ar fi pigmenţii, unii dintre aceştia manifestând şi o uşoară activitate antibiotică. Dintre aceştia cel mai mult studiat este actinorhodinul, un pigment de tip izocromanequinonic, produs de S.coelicolor printr-o cale poliketidică tipică (Floss, 1981). Pigmentul respectiv produs de bacteriile cultivate pe mediul R2YE este roşu şi nedifuzibil la pH neutru dar, după expunere la vapori de amoniac devine albastru şi difuzibil. In urma cercetărilor efectuate pe diferite tulpini mutante de S.coelicolor s-a realizat o grupare a acestora în mai multe clase (7) în funcţie de variaţiile de exprimare a genelor care alcătuiesc "clusterul" act. Rezultatele obţinute au permis elaborarea unei ipoteze referitoare la sinteza unor metaboliţi secundari de tip poliketidic, ţinând cont de marea varietate de asemenea metaboliţi (macrolide, poliene, polieteri, tetracicline, antracicline, ansamicine, isocromaquinone etc). Se pare că la toţi metaboliţii secundari de tip poliketidic, esterii acil-CoA şi -cetoacizii condensează împreună printr-un mecanism de polimerizare de tip cap-coadă, ceea ce conduce la obţinerea unor lanţuri alifatice de diferite dimensiuni. Aceste lanţuri suferă, ulterior, modificări suplimentare, care le asigură specificitatea (Hopwood şi Sherman, 1990). Dacă reacţia de condensare realizată prin intervenţia unei enzime de tip β-ceto-acil-tioester-sintetaza ("enzima de condensare") este comună tuturor metaboliţilor secundari poliketidici, atunci ar însemna că între secvenţele care codifică poliketid-sintetazele la diferite organisme producătoare există o mare omologie care este conservată. Pornind de la o asemenea ipoteză, Malpardita şi colab.(1987) au utilizat genele act de la mutantele din clasele I şi III ca probe de ADN în experimentele de hibridizare şi au observat că între acestea şi ADN de la 14 dintre cei 18 producători de poliketide se produce hibridizare cu intensitate variată, deci există omologie. Probele nu au hibridizat cu ADN izolat de la tulpinile care produc tetraciclină, eritromicină, candicidină şi curamicin. Aceste rezultate demonstrează o corelaţie, incompletă, între producerea de poliketide şi prezenţa de secvenţe de ADN care sunt parţial omoloage cu actinorhodin poliketid-sintetaza. Această strategie de hibridizare poate fi extinsă prin utilizarea unor probe de ADN a unor secvenţe care codifică diferite sintetaze izolate de la tulpini bacteriene variate, ceea ce ar permite recunoaşterea unor producători criptici ai unor clase de metaboliţi secundari particulari. Prin alterarea specificităţii de substrat a unor sintetaze specifice utilizând mutageneza directă sau recombinarea"in vitro" a genelor care codifică pentru aceste enzime pot fi obţinute noi antibiotice cu proprietăţi speciale.

Alte două tipuri de pigmenţi, metilenomicin produs de tulpini de S.coelicolor şi S.violaceoruber sau undecilprodigiozin produs de S.coelicolor A3(2) au fost studiate cu o intensitate mai scăzută, rezultatele obţinute sugerând şi în aceste cazuri o grupare a genelor implicate în biosinteza produşilor respectivi (Malpardita şi colab., 1990).

Gruparea în "clusteri” a genelor care codifică căi ale metabolismului secundar reprezintă un fenomen comun pentru numeroase tipuri de substanţe. In cazul "clusterilor" pentru sinteza tetra-cenomicinei şi actinorhodinului s-a evidenţiat o subgrupare specială a genelor componente care controlează momentul apariţiei fiecărei enzime în calea metabolică respectivă, astfel încât intermediarii apar în anumite etape ale reacţiilor biochimice. Formarea secvenţială a enzimelor este binecunoscută în căile de biosinteză a metaboliţilor secundari la fungi şi streptomicete (Martin şi Liras, 1989). Cuplarea strânsă a proceselor de transcriere/traducere la streptomicete şi la alte procariote, precum şi faptul că genele structurale sunt grupate şi ordonate permite ca enzima obţinută în urma acestor fenomene să acţioneze asupra produsului enzimei anterioare (Motamedi şi Hutchinson, 1987).

O acţiune mai eficientă a enzimelor poate rezulta în urma grupării enzimelor în complexe enzimatice, fenomen întâlnit în cazul biosintezei gramicidinei,tirocidinei şi bacitracinei. Poliketidele şi metaboliţii secundari polienici sunt formaţi prin acţiunea unor complexe enzimatice care cuprind sintetaze specifice.

2.4. Coordonarea exprimării genelor de biosinteză şi rezistenţă
Deoarece genele implicate în biosinteza şi rezistenţa la antibiotice sunt grupate este foarte probabil să existe o coordonare a exprimării genelor pentru a nu produce disfuncţii. Dacă un metabolit secundar este activ faţă de tulpina producătoare, mecanismele de protecţie (inactivarea antibioticului sau sporirea eliminării lui) trebuie să fie induse înaintea acumulării metabolitului respectiv.

Există numeroase exemple referitoare la inducerea exprimării genelor de rezistenţă la antibiotice la bacteriile din genul Streptomyces. Astfel, exprimarea genelor de rezistenţă la tetraciclină, tetA şi tetB de la S.rimosus şi S.griseus a fost indusă de adăugarea de tetraciclină în mediul de cultură (Ohnuki şi colab., 1985). Nivelul rezistenţei a crescut de 2 ori atunci când s-a mărit cantitatea de tetraciclină adăugată (de la 5 la 50μg/ml). Aceasta sugerează faptul că inducerea genelor de rezistenţă protejează tulpinile producătoare faţă de creşterea nivelului antibioticului în timpul cultivării.

Gena de rezistenţă la streptomicină (strA sau aphD) de la S.griseus se află plasată alături de genele pentru biosinteza antibioticului şi se găseşte sub un control dublu, pozitiv şi negativ. Ea este indusă de streptomicină, dar nu şi de streptavidin. Exprimarea genei strA se află sub un control negativ exercitat de o proteină represor de 40 KDa codificată de o secvenţă (ORF) plasată în apropierea acestei gene. De asemenea, ea este stimulată de produsul genei strR care activează în acelaşi timp şi gena strB (genă structurală care codifică o amidinotransferază) (Ohnuki şi colab., 1985) (Figura 5).



Figura 5. Model ipotetic al transcrierii genelor implicate în sinteza şi rezistenţa la streptomicină (după Piepersberg şi colab., 1988).
In mod similar, gena de rezistenţă la kanamicină clonată de la bacteria producătoare S.kanamyceticus se exprimă după inducere în noile gazde (S.lividans, S.lavendulae sau S.parvulus) (Nakana şi colab., 1984).

S-a dovedit că multe dintre tulpinile de Streptomyces producătoare de antibiotice prezintă două sau mai multe mecanisme de rezistenţă la antibioticele pe care le produc, probabil ca o modalitate de protecţie faţă de antibiotice înrudite. Spre exemplu, în cazul tulpinilor de S.kanamyceticus există două mecanisme de rezistenţă la kanamicină: una este modificarea ribozomilor, iar cealaltă presupune inactivarea antibioticului de către o enzimă specifică (6'-N-acetiltransferaza) (Nakano şi colab., 1988). La S.fradiae, la o tulpină industrială au fost identificate cel puţin trei gene diferite care asigură rezistenţa la tilozin, gene care sunt linkate la genele de biosinteză.

In unele situaţii, enzima codificată de gena de rezistenţă poate îndeplini şi alte funcţii catalitice în cadrul căii metabolice de biosinteză a antibioticului respectiv. Acesta este cazul genelor de rezistenţă la puromicină sau bialafos, care se pare că sunt implicate şi în unele dintre etapele intermediare ale sintezei metabolitului respectiv, ceea ce înseamnă că exprimarea genelor de biosinteză şi rezistenţă se află sub acelaşi mecanism de reglare.
2.5. Reglarea exprimării genelor implicate în metabolismul secundar
Metabolismul secundar este o formă de diferenţiere biochimică a microorganismelor. Reglarea desfăşurării sale este realizată prin diferite mecanisme. Astfel, factorul A este o proteină reglatoare cu efecte pleiotropice care stimulează atât biosinteza şi rezistenţa la streptomicină, cât şi sporularea la S.griseus şi S.bikinensis. Au fost identificate, astfel, mai multe gene ai căror produşi de transcriere controlează diferite procese. Un exemplu este reprezentat de gena afsA ("A factor synthesis"), care a fost izolată de la S.bikinensis, şi apoi clonată în diferite gazde. O altă genă, afsB a fost izolată de la S.coelicolor şi s-a dovedit că ea codifică o proteină reglatoare care stimulează atât producerea de factor A, cât şi a unor pigmenţi cum ar fi actinorhodinul şi undecilprodigiozinul.

O situaţie interesantă o prezintă gena saf ("secondary metabolism-acting factor") izolată de la S.griseus, genă care este implicată într-un mecanism de control comun pentru diferenţierea celulară, pentru producerea a cel puţin patru enzime extracelulare şi pentru formarea de pigment (Martin şi Liras, 1989). Secvenţa aminoacizilor pe care îi conţine produsul genei saf indică faptul că acesta interacţionează cu ADN, secvenţa respectivă conţinînd un domeniu tipic de legare la ADN. Aceasta înseamnă fie că polipeptidele de legare la ADN interacţionează specific cu secvenţe reglatorii ale genelor implicate în metabolismul secundar, fie că ele controlează exprimarea genelor care determină formarea factorului A sau a altor efectori pleiotropici, influenţând, astfel, exprimarea grupurilor de gene care codifică enzimele metabolismului secundar.

Genele implicate în biosinteza metabolismului secundar nu sunt exprimate, de obicei, în culturile cu o rată mare de creştere. Astfel, numeroase sintetaze aparţinând metabolismului secundar sunt fie inhibate fie represate de nivelul surselor de carbon, fosfor, sau azot în timpul fazei de creştere a producătorilor (Martin, 1989).

Un alt mecanism de coordonare a exprimării genelor, evidenţiat iniţial la B.subtilis, E.coli, dar şi la alte bacterii, este producerea unor factori sigma sau a altor proteine care modifică specificitatea ARN polimerazei, conducând la o exprimare selectivă a unor seturi speciale de gene. Si în cazul streptomicetelor a fost evidenţiată o heterogenitate a ARN polimerazelor (Westpheling şi col.ab, 1985). Spre exemplu, două holoenzime de ARN polimerază (E 35 şi E 49) de la S.coelicolor recunosc doi promotori bine definiţi de la B.subtilis. Promotorii de la streptomicete sunt destul de variaţi: unii care prezintă conservate regiunile -10 şi -35 par a fi similari celor de la E.coli, în timp ce alţii sunt complet diferiţi (Jansen şi colab, 1985). Distanţa dintre cele două regiuni conservate, -10 şi -35, este un factor important al determinării tăriei promotorului. Astfel, o distanţă de aproximativ 17 perechi de baze este corelată cu o activitate optimă a promotorului, în timp ce o distanţă mai mică de 15pb sau mai mare de 20pb este asociată cu o scădere a activităţii sale.

Date recente (Buttner şi colab., 1988) indică faptul că gena pentru agarază (dagA) de la S.coelicolor care conţine patru promotori diferiţi este transcrisă de cel puţin trei forme diferite (holoenzime) de ARN polimerază. Similar, genele galE şi galK de la S.lividans sunt transcrise de două ARN polimeraze de la nivelul a doi promotori, galP1 şi galP2.

Deşi existenţa mai multor factori sigma este bine cunoscută, semnificaţia fiziologică a diferitelor holoenzime de ARN polimerază rămâne încă neclară. La streptomicete multe dintre secvenţele aflate înaintea regiunii start a transcrierii unor gene conţin doi sau mai mulţi promotori dar nu este clar dacă toţi promotorii funcţionează "in vivo" (Tomich, 1988). Recunoaşterea diferenţiată a promotorilor aranjaţi în tandem de către diferite ARN polimeraze poate explica exprimarea selectivă a anumitor seturi de gene în timpul creşterii şi diferenţierii morfologice şi a altor gene în timpul desfăşurării metabolismului secundar. Aranjarea genelor implicate în biosinteza antibioticelor în grupuri ("clusteri") este deci de mare interes în legătură cu exprimarea diferenţiată a genelor.

2.6. Seminificaţia biologică a metaboliţilor secundari
Semnificaţia biologică a metaboliţilor secundari produşi de diferite microorganisme nu este încă foarte clară. Sinteza lor ar reprezenta rezultatul unor "erori de metabolism" fără importanţă pentru fiziologia microorganismului producător. In legătură cu rolul metaboliţilor secundari au fost avansate numeroase propuneri pornind de la studiul în laborator al activităţii acestor compuşi. Vining (1990) consideră că funcţiile metaboliţilor secundari pot fi grupate în două categorii: unele care privesc direct producătorul (funcţii intrinseci) şi altele care asigură anumite beneficii producătorului prin acţiunea în exterior, în mediu (funcţii extrinseci). In cadrul funcţiilor intrinseci, unii metaboliţi secundari pot fi precursori ai unor componente structurale cum ar fi de exemplu streptomicina care, se sugerează că ar fi un constituent al învelişului mureinic (Szabo şi colab., 1989). De asemenea, alţi metaboliţi secundari joacă un rol important în sporulare şi în germinarea sporilor la actinomicete şi la bacili ca şi în diferenţierea celulară (Chater, 1989; Maplestone şi colab.,1992).

Atunci când activitatea metaboliţilor secundari este direcţionată asupra altor organisme din mediul înconjurător, aceste substanţe pot fi considerate ca "agenţi ecologici" asigurând pro-ducătorilor supravieţuirea în cadrul competiţiei cu alte organisme ce populează aceeaşi nişă ecologică. De asemenea, datele obţinute până în prezent în urma analizei secvenţei de nucleotide sprijină conceptul că metabolismul secundar a rezultat în urma modificărilor căilor existente ale metabolismului primar. Deşi secvenţa de aminoacizi identificată deductiv din secvenţa de nucleotide a genelor corespunzătoare este suficientă pentru a indica o origine comună, pentru ca datele să fie mai concludente ar fi necesară o comparare a genelor de la specii diferite decât de la aceeaşi specie. Informaţiile obţinute în acest fel sugerează că transferul natural de gene între diferite organisme a reprezentat un important factor în evoluţia metaboliţilor secundari. Multe dintre căile metabolismului secundar pot avea o origine foarte veche, modificările care apar la nivelul lor putând rezulta în urma achiziţiilor mai recente de material genetic exogen la nivelul unor microorganisme producătoare.

Pe baza cunoştinţelor acumulate în domeniu, Vining (1992) stabileşte o serie de caracteristici clare ale metabolismului secundar:

1. metaboliţii secundari nu sunt esenţiali pentru creştere şi tind să fie specifici de tulpină;

2. aceşti compuşi au o mare varietate de structuri chimice şi activităţi biologice;

3. metaboliţii secundari derivă din intermediari ai metabolismului primar prin căi de biosinteză unice. Aceste căi sunt deseori lungi şi complexe; reacţiile biochimice sunt catalizate de enzime cu specificitate de substrat diferită de cea a enzimelor echivalente ale metabolismului primar;

4. formarea metaboliţilor secundari este determinată de seturi de gene asociate supuse unui mecanism de reglare care se referă atât la nivelul exprimării genelor cât şi la momentul declanşării acesteia;

5. mecanismele de control este bine integrat cu fiziologia organismului producător.

Relativ recent, Davies (1990) a propus ideea că metaboliţii secundari sunt substanţe cu origine foarte veche şi că mulţi dintre ei exercită activităţi biologice cunoscute (cum sunt antibioticele) datorită interacţiunii cu anumite situsuri vechi, conservate ale diferitelor macromolecule. Aceasta înseamnă că metaboliţii secundari au jucat un rol important în evoluţia reacţiilor biochimice, înainte ca enzimele să fie disponibile. Spre exemplu, reacţiile de biosinteză erau catalizate sau modulate de molecule cu greutate moleculară mică care erau prezente în atmosfera Pământului sau erau produse în "supa primordială". Odată ce sistemul de traducere a evoluat iar proteinele au început să fie produse şi să exercite diferite funcţii, rolul produşilor cu greutate moleculară mică a fost înlocuit de mecanisme mai complexe în care sunt implicate polipeptidele, dar aceştia şi-au menţinut capacitatea de a interacţiona cu anumite situsuri receptoare din macromolecule (acizi nucleici sau proteine).

Conceptul rolului cheie primordial al moleculelor cu greutate moleculară mică ca efectori (stimulatori) ai biosintezelor sugerează o nouă abordare a modalităţilor de screening pentru diferite activităţi farmacologice. In locul urmăririi exclusive a efectelor inhibitorii este necesar să se studieze activitatea stimulatoare fie a unor celule întregi fie a unor extracte celulare (Murakama şi colab.,1989). Numeroase organisme (poate chiar toate) produc compuşi cu greutate moleculară mică cu activitate antibiotică, cum ar fi de exemplu defensinele (Gabai şi colab., 1989). In acest sens, microorganisme de tipul streptomicetelor sunt neobişnuite în sens evolutiv deoarece ele şi-au dezvoltat şi menţinut căile necesare pentru a produce o gamă foarte largă de compuşi cu greutate moleculară mică atunci când sunt cultivate în mod corespunzător. Acţiunea acestor compuşi este foarte variată, ei inhibând de obicei desfăşurarea unor procese biochimice diferite. Studii mai amănunţite asupra activităţii acestor substanţe antibiotice a evidenţiat însă că multe dintre ele au efect stimulator asupra transferului de gene (aminoglicozidele, penicilinele, tetraciclinele), asupra transpoziţiei (tetraciclina), transcrierii (eritromicina, tiostreptonul), creşterii celulare (kanamicina, streptomicina, eritromicina) sau mutagenezei (streptomicina). Pornind de la aceste observaţii, Davies (1990) propune că efectorii cu greutate moleculară mică şi situsurile lor de acţiune datează dinaintea stabilirii rolului proteinelor, deşi acţiunea lor este mai puţin eficientă şi are o specificitate scăzută. Odată ce organismele devin din punct de vedere genetic şi biochimic mai evoluate, rolul efectorilor cu greutate moleculară mică este preluat de proteine care asigură o eficienţă şi specificitate de acţiune ridicată.

3. Enzime produse de bacteriile din genurile Bacillus si Streptomyces
Deşi streptomicetele produc mai mult de 60% dintre antibioticele cunoscute, există relativ puţine date referitoare la echipamentul enzimatic al acestor bacterii. Tinând cont de faptul că streptomicetele sunt microorganisme din sol unde există o mare varietate de posibile substraturi nutritive, este logic de presupus că aceste bacterii prezintă o mare varietate de căi metabolice putând sintetiza unii intermediari prin căi diferite. Căile metabolice alternative fac posibilă utilizarea eficientă a celor mai multe substrate disponibile (Behal, 1986).

In ultimii ani bacteriile din genul Streptomyces constituie un serios subiect de studiu din punctul de vedere al enzimelor pe care le produc, multe dintre ele fiind de importanţă biotehnologică (proteaze, amilaze, glucoz-izomeraze, celulaze, hemicelulaze, endonucleaze, chitinaze etc. Mai mult, s-a dovedit că cel puţin unele dintre aceste enzime sunt produse simultan cu unele antibiotice (tabelul 2) (Pokorny şi Vitale, 1980).

Unele dintre enzimele sintetizate de către streptomicete sunt sau pot fi folosite în practica medicală fie în stabilirea unor diagnostice fie în terapie. Acesta este cazul colesterol-oxidazei produsă de unele specii de Streptomyces şi Nocardia care este utilizată pentru dozările de colesterol din ser, sau al urat-oxidazei produsă de S.cyanogenus care poate fi utilizată pe scară largă pentru detectarea enzimatică a acidului uric (Srinivasan şi colab., 1991).

Producerea enzimelor hidrolitice de către streptomicete depinde în mare măsură de substratul pe care acestea sunt cultivate astfel că datele prezentate în Tabelul 2 pot fi completate şi cu alte tipuri de enzime. Uneori însă, datorită scopului în care enzimele ar putea fi utilizate (de exemplu în industria alimentară) se preferă utilizarea unor tulpini bacteriene producătoare care însă să nu sintetizeze substanţe toxice sau potenţial toxice (cum sunt de altfel antibioticele)

Tabelul 2. Enzime entracelulare produse de unele bacterii producătoare de antibiotice

Specia bacteriană	Antibioticul	Enzimele detectate
S.griseus	streptomicina	proteaze, elastaze, amilaze, peptidaze
S.rimosus	oxitetraciclin	proteaze, elastaze,
S.aureofaciens	tetraciclina	proteaze, amilaze
S.fradiae	neomicina	proteaze, elastaze, keratinaze
S.antibioticus	oleandomicina	proteaze, amilaze
S.venezuelae	cloramfenicol	Proteaze
B.licheniformis	Bacitracina	Proteaze
B.subtilis	Bacitracina	Proteaze