Aplicaţii biotehnologice ale bacteriilor din genurile streptomyces Şi bacillus

3.3. Glucoz-izomeraza
In ultimii ani, de mare interes în Japonia, SUA şi Franţa este obţinerea siropurilor cu conţinut ridicat de fructoză din hidrolizate de amidon în urma acţiunii glucoz-izomerazei (xilo-zoizomeraza, EC 5.3.1.5.). Printre producătorii recunoscuţi de asemenea enzime se numără şi unele specii de streptomicete: S.violaceoniger şi S.olivochromogenes. Suekane şi Iizuka (1982), în cadrul unor cercetări legate de producerea de glucoz-izomerază de către streptomicete au evidenţiat faptul că abilitatea de a converti glucoza la fructoză este larg răspândită între bacteriile acestui gen. Localizarea acestei enzime este atât intracelulară (cea mai mare parte) dar şi extracelulară.

Experimentele lui Szentirmai şi colab.(1986) au evidenţiat faptul că, cel puţin în cazul S.matensis, glucoz-izomeraza intracelulară diferă de cea extracelulară din punctul de vedere al greutăţii moleculare. De asemenea, s-a observat că utilizarea ca sursă de azot a unei combinaţii de glicocol şi sulfat de amoniu şi adăugarea xilozei şi a ionilor de cobalt (de magneziu sau mangan în cazul altor specii bacteriene) duce la stimularea producerii de enzimă la S.olivochromogenes, S.flavogriseus sau S.violaceoniger (Chen şi colab.,1979; Sicard şi colab., 1990).

Park şi Toma (1974) au observat că la unele tulpini de streptomicete există o interrelaţie între producerea de glucoz-izomerază şi cea de xilanază, în funcţie de sursa de carbon utilizată pentru cultivarea bacteriilor respective. Utilizarea unui mediu de cultură ce conţine fie xilan fie glucoză ca sursă de carbon determină producerea de glucoz-izomerază în timp ce xilanaza este produsă doar de bacteriile crescute pe mediu cu xilan, nu şi pe cel ce conţine glucoză.

Datorită importanţei practice deosebite a acestei enzime, în ultimii ani au fost realizate studii referitoare la determinismul genetic al sintezei glucoz-izomerazei ca şi la controlul acestei sinteze, scopul fiind acela al obţinerii prin tehnici de inginerie genetică a unor tulpini capabile de a sintetiza noi tipuri de glucoz-izomeraze cu proprietăţi modificate, cu acţiunea mai eficientă.

Utilizarea D-xilozei ca sursă de carbon de către bacterii se realizează pe o cale metabolică ce presupune transportul prin membrana plasmatică, izomerizarea la D-xiluloză şi apoi fosforilarea acesteia cu ajutorul xiluloz-kinazei cu formarea de D-xiluloz-5-fosfat. Intermediarul fosforilat este apoi metabolizat fie pe calea pentozo-fosfaţilor fie pe calea Embden-Meyerhoff. Pornind de la aceste date s-a determinat faptul că operonul xyl de la streptomicete (de la S.violaceoniger în particular) este alcătuit din cel puţin trei gene: xylA care codifică pentru sinteza xiloz-izomerazei, xylB care codifică xiluloz-kinaza şi xylX care determină sinteza unei proteine reglatoare. In cazul acestor bacterii s-a evidenţiat o situaţie interesantă: genele xylA şi xylB plasate apropiat una de cealaltă pe cromosomul bacterian prezintă o orientare diferită, exprimarea lor datorându-se unor promotori divergenţi plasaţi în regiunea dintre cele două gene (Tiraby şi colab.,1989). Produsul genei xylX pare a fi o proteină reglatoare care controlează atât exprimarea celor două gene cu orientare opusă cât şi propria sa sinteză.

Experimentele de clonare care se realizează în diferite laboratoare încearcă, pe de o parte stabilirea cu precizie a genelor ce alcătuiesc operonul xyl la streptomicete şi modul de reglare a exprimării lor atât în tulpina de origine cât şi în diferite tulpini gazdă în care genele respective au fost clonate, şi, pe de altă parte să se construiască "in vitro" tulpini recombinate genetic capabile de a sintetiza glucoz-izomerază cu proprietăţi ameliorate (de exemplu termostabilă) (Sicard şi colab, 1990). Rezultatele obiţute până în prezent sunt promiţătoare, cercetările fiind continuate pe direcţiile menţionate mai sus.

3.4. Celulazele
Biomasa vegetală reprezintă sursa majoră de carbon în ecosistemele terestre astfel că este firească presupunerea că multe dintre microorganismele care populează aceste ecosisteme să fie capabile să degradeze aceste substrate, deci să sintetizeze enzime de timpul celulazelor şi hemicelulazelor. Actinomicetele şi în mod special bacteriile din genul Streptomyces constituie un grup important care intră în alcătuirea populaţiilor microbiene respective (Mc Carthy şi Williams, 1992).

Celuloza este un polimer neramificat de glucoză compus din unităţi de anhidro D-glucoză unite prin legături 1,4-β-D-glucozidice. Aceste legături pot fi hidrolizate de către enzimele celulozolitice. De obicei celuloza este foarte rezistentă la hidroliză datorită gradului ridicat de cristalinitate, rezultatul unei conformaţi lineare (paralele) care permite realizarea unor puternice legături de hidrogen între grupările OH ale lanţurilor paralele vecine. In fibrele de celuloză regiunile cu structură înalt cristalină coexistă cu regiunile cu structură amorfă iar cele cu un raport favorabil zonelor cristaline prezintă o rezistenţă crescută la acţiunea enzimatică. Celuloza, aşa cum se găseşte în natură este un homopolimer cu greutate moleculară mare, insolubil şi adesea în asociere intimă cu lignina, hemiceluloza la nivelul peretelui celular vegetal fapt ce o face puţin accesibilă degradării enzimatice (Robson şi Chambliss, 1989).

Toate organismele care degradează celuloza cristalină secretă sisteme enzimatice mai mult sau mai puţin complexe care sunt alcătuite din enzime cu diferite modalităţi de acţiune, specificitate de substrat şi care acţionează de obicei sinergic pentru a hidroliza celuloza. Cel mai bine studiat sistem celulazic este cel de la fungi (de la Trichoderma reesei), enzimele care îl alcătuiesc fiind grupate în trei categorii:

- exo--1,4-glucanaze sau celobiohidrolaze (EC 3.2.1.91.)

- endo--1,4-glucanaze sau endocelulaze (endoglucanaze)(EC 3.2.1.4.)

- -glucozidaza sau celobiaza (EC 3.2.1.21.)

Aceste trei grupe de enzime acţionează sinergic ducând la hidroliza celulozei cristaline. Endoglucanazele determină ruperea legăturilor interne ale lanţului de celuloză, atacul făcându-se la întâmplare şi ducând la formarea de oligozaharide. Efectul direct al acestui tip de enzime este fragmentarea lanţului de celuloză cuplat cu o creştere slabă a cantităţii de zaharuri reducătoare eliberate. De obicei, în complexele celulozolitice sunt cuprinse mai multe endoglucanaze care pot prezenta afinităţi diferite pentru celo-oligozaharide cu lungimi variate. Spre deosebire de aceste, exoglucanazele (celobiohidrolazele) acţionează la nivelul extremităţilor nereducătoare ale lanţului de celuloză, eliberând glucoză sau celobioză (zaharuri reducătoare) în cantitate crescută, lungimea lanţului celulozic nefiind modificată semnificativ.

Acţionând individual, atât endoglucanazele cât şi celobiohidrolazele pot degrada regiuni restrânse ale lanţului celulozic (cele cu structură amorfă). Pentru a determina hidroliza regiunilor cu structură cristalină este necesar ca în amestecul enzimatic să fie prezente ambele tipuri de enzime.

In ceea ce priveşte β-glucozidazele, acestea determină hidroliza celobiozei în două unităţi de glucoză. Deşi aceste enzime nu sunt propriu-zis celulaze, ele participă la îmbunătăţirea randamentului degradării celulozei prin eliminarea inhibării prin feedback a celulazelor realizată de obicei de celobioză (Robson şi Chambliss, 1989).

Utilizarea a numeroase substrate şi diverse tehnici de evidenţiere a activităţii celulazice a dus la o comparare dificilă a sistemelor celulozolitice de la diferite organisme. Mai mult, deoarece celulazele aflate în extracte brute prezintă o suprapunere parţială a specificităţii de substrat, un studiu corect trebuie realizat în condiţiile purificării acestor enzime. In ultima vreme au fost obţinute o serie de substrate celulozice care ar putea fi folosite ca substrate mai mult sau mai puţin specifice pentru fiecare dintre componentele sistemului celulazic (Wood şi Bhat, 1988). Cel mai utilizat procedeu de determinare a activităţii enzimatice este măsurarea cantităţii de zaharuri reducătoare eliberate în urma acţiunii enzimelor asupra substratului. Astfel, substratele celulozice cu structură amorfă sau cele modificate chimic cum sunt celuloza-azur, carboximetilceluloza(CMC), celuloza tratată cu acizi ("acid-swollen cellulose") sau trinitrofenil-carboximetilceluloza (TNP-CMC) sunt degradate în mod semnificativ şi specific de către endoglucanaze dar, în unele situaţii şi celobiohidrolazele le pot hidroliza de şi cu o eficienţă mai mică. In cazul utilizării drept substrat a celulozei cu structură cristalină de tipul Avicelului (celuloză microcristalină), bumbacului sau hârtiei de filtru, pentru degradarea lor eficientă este necesar un sistem celulazic complet, care să conţină atât endoglucanază cât şi celobiohidrolază. De obidei, pentru a determina prezenţa într-un preparat enzimatic brut a ambelor tipuri de enzime se determină eliberarea de zaharuri reducătoare în funcţie de substrat. Astfel, endoglucanazele cauzează o creştere rapidă a fluidităţii (reducerea vâscozităţii) carboximetilcelulozei dar o eliberare scăzută de zaharuri reducătoare. In contrast, celobiohidrolazele nu modifică fluiditatea substratului dar conduce la eliberarea unei cantităţi mai mari de zaharuri reducătoare. Cu toate acestea este dificil de precizat dacă o celulază este sau nu celobiohidrolază deoarece nu există un substrat specific pentru aceasta. Deshpande şi colab., (1988) au arătat însă că hidroliza unor compuşi cum ar fi metil-umbeliferil-celobiozid (MUC) sau p-nitrofenil--D-celobiozid (pNPC) ar fi un indiciu al activităţii exo--1,4-glucanazice.

Există în prezent numeroase date referitoare la bacterii celulozolitice dar mulţi autori consideră că bacteriile produc doar endoglucanaze şi nu un sistem celulazic complet. Deşi cea mai acceptată teorie referitoare la modul de degradare a celulozei este cea bazată pe rezultatele cercetărilor efectuate asupra fungilor şi care presupune că hidroliza eficientă a substratelor celulozice se realizează în urma acţiunii sinergice a endo- şi exoglucanazelor, ea nu este aplicată bacteriilor. La acestea, modelul de degradare sugerat presupune că endoglucanazele care au ca substrat specific celo-oligozaharidele cu lungimi variate pot determina hidroliza celulozei cristaline dacă ele se află în concentraţie mare sau dacă se leagă de fibrele de celuloză sau sunt grupate în imediata vecinătate a acestora ("celulosomi") (Robson şi Chambliss, 1989). Reuşita unor laboratoare din lume de a izola şi caracteriza celobiohidrolaze de la bacterii vine să contrazică în cazul speciilor respective teoria enunţată mai sus (Creuzet şi colab.,1983; Mac Kenzie şi colab.,1984; Gardner şi colab., 1987; Beguin, 1990; Ruttersmith şi Daniel, 1991).

Printre bacteriile considerate a avea sisteme celulazice complexe, tipice se numără genurile Clostridium, Cellulomonas, Bacillus, Thermomonospora, Ruminococcus, Bacteroides, Erwinia şi Acetobacter. De asemenea, tulpini celulozilitice au fost identi-ficate şi în cadrul altor genuri de bacterii: Streptomyces, Rhizobium, Cellvibrio, Pseudomonas, Microbispora etc. In studiul de faţă ne vom referi doar la sistemele celulazice de la două genuri de bacterii Gram pozitive, Bacillus şi Streptomyces.

La bacteriile din genul Bacillus s-a evidenţiat faptul că ele produc doar endoglucanaza şi nu sînt capabile de o degradare eficientă a celulozei cristaline. Studiile referitoare la celulazele de la Bacillus au fost sprijinite şi de faptul că aceste bacterii pot fi uşor manipulate genetic (genomurile de la mai multe specii fiind destul de bine caracterizate) şi de caracterul extracelular al acestor enzime. Printre speciile care produc celulaze se numără B.subtilis, B.polymyxa, B.licheniformis, B.cereus etc.

Studiile referitoare la celulazele de la Bacillus se referă atât la caracterizarea biochimică a enzimelor cât şi la identificarea şi secvenţierea genelor implicate în producerea acestor enzime ca şi în clonarea şi exprimarea lor în diferite gazde. In prezent se cunoaşte secvenţa de nucleotide a mai multor endoglucanaze de la Bacillus (tabelul 5) şi deci secvenţa de aminoacizi a proteinelor corespunzătoare, realizându-se astfel comparaţii între enzimele secretate de diferite specii de bacili.

Tabelul 5. Genele pentru celulazele de la Bacillus

Tulpina	Gena	Mărimea proteinei produse (aminoacizi)
B.circulans		378
B.subtilis DLG		499
B.subtilis N-24		463
B.subtilis PAP 115		499
B.lautus	celB	536
Bacillus N-4	celA celB celC	384 465 >800
B.polymyxa		365
Bacillus 1139	celF	770
Bacillus sp.KSM 635		912

S-a stabilit astfel că enzimele produse de diferite tulpini de Bacillus prezintă un grad înalt de omologie, porţiunile cu omologie ridicată fiind localizate, în general, în regiunea aminoterminală, ceea ce sugerează că situsul catalitic activ al enzimelor se află plasat în această zonă. Această supoziţie este sprijinită de observaţiile că porţiunea de la capătul carboxiterminal al endoglucanazei respective nu este necesară pentru activitatea celulozolitică, regiunea respectivă putând fi deletată experimental fără pierderea actibvităţii (Nakamura şi colab. 1991). Recent, Henrissat şi colab.(1989) analizând grupările ("clusterii") hidrofobe ale diferitelor enzime au clasificat celulazele, inclusiv pe cele de la Bacillus, în şase familii. Din acest punct de vedere, endoglucanazele de la B.subtilis şi B.ciculans sunt incluse în familia A, subfamiliile A₂ şi A₄ (Beguin, 1990; Gilkes şi colab.,1991).

De asemenea, rezultatele de până acum referitoare la genele pentru enduglucanazele de la Bacillus sugerează ideea că ele ar deriva dintr-o genă ancestrală comună.

In ceea ce priveşte particularităţile biochimice ale endoglucanazelor de la bacteriile din genul Bacillus acestea au o greutate moleculară ce variază, de obicei, între 35 şi 46 kDa, dar poate atinge, la unele tulpini alcalofile, până la 92 kDa (Fukumori şi colab., 1986), sunt în general termostabile, activitatea optimă realizându-se la 50-60^oC.

Reglarea producerii de endoglucanaze de către bacteriile din genul Bacillus variază nu numai de la specie la specie ci chiar şi de la tulpină la tulpină. Spre exemplu, tulpini de B.cereus, Bacillus sp.N-4, B.subtilis AU1, B.licheniformis sintetizează enzima în mod constitutiv în timp ce la alte tulpini, B.polymyxa, B.subtilis DLG, Bacillus sp.1139, aceasta pare a fi inductibilă. De asemenea, nivelul glucozei şi al celobiozei influenţează diferit producerea englucanazei de către tulpinile bacteriene studiate. Dacă în cazul tulpinii B.subtilis AU1 atât glucoza cât şi celobioza inhibă sinteza enzimatică la concentraţii mai mari de 2%, în cazul tulpinii alcalofile Bacillus sp.1139 glucoza inhibă, iar celobioza stimulează producerea de enzimă. La alte tulpini de Bacillus, B.subtilis DGL, B.cereus, B.licheniformis, ambele zaharuri reducătoare stimulează sinteza endoglucanazei.

In urma experimentelor de clonare a genelor pentru endoglucanază în diferite gazde (fie tulpini auxotrofe de E.coli fie alte tulpini de B.subtilis) au fost obţinute informaţii interesante referitoare la exprimarea genelor respective în gazde heterologe ca şi la reglarea exprimării acestora. De obicei, celulazele ale căror gene au fost clonate în E.coli sunt sintetizate iniţial sub forma unor compuşi de dimensiuni mari, activi din punct de vedere enzimatic, cu localizare intracelulară. Aceşti compuşi suferă o "prelucrare" în urma căreia dimensiunea enzimei se micşorează, sub această formă ea fiind exportată în spaţiul periplasmic (Cantwell şi Mc Connel, 1983; Robson şi Chambliss, 1989). In cazul utilizării drept gazda pentru clonare a unor tulpini mutante de Bacillus s-a observat un fenomen similar de "procesare intracelulară" a precursorului enzimatic în urma căruia dimensiunia enzimei se apropie de cea a enzimei produsă de tulpina de origine (Robson şi Chambliss, 1989). De asemenea, Nakamura şi colab.(1991) au observat că utilizarea drept gazdă a unei tulpini mutante de B.subtillis care nu produce proteaze a condus la obţinerea unei cantităţi superioare de enzimă de la tulpina recombinată. Această creştere poate fi de cel puţin 9 ori dacă în noua gazdă este clonată suplimentar şi gena sacQ.

Deşi cele mai multe informaţii referitoare la degradarea substratelor celulozice de către actinomicete sunt legate de bacteriile din genul Thermomonospora (T.fusca, T.curvata)(Wilson, 1992), în ultimii ani au fost realizate şi studii referitoare la sistemul celulazic al bacteriilor din genul Streptomyces.

Tulpinile de streptomicete capabile de a degrada celuloza aparţin la mai multe specii cum ar fi: S.antibioticus (Enger şi Mc Coy, 1965), S.thermodiastaticus (Crawford şi Mc Coy, 1972), S.flavogriseus (Ishaque şi Kluepfel, 1980), S.olivochromogenes (Mac Kenzie şi colab.,1987), S.reticuli (Wachinger şi colab., 1989), S.lividans (Theberge şi colab., 1992), S.flavovirens SfG3 (Cornea şi colab., 1993), dar lista poate continua dacă ţinem cont de tulpinile de Streptomyces care nu au fost încadrate până acum într-o specie anume.

Primele lucrări referitoare la sistemul celulazic de la streptomicete au evidenţiat faptul că acesta este complex, enzimele componente fiind capabile de a degrada substrate foarte variate: CMC, hârtie de filtru, bumbac, celuloză microcristalină, celobioză dar şi paie, tărâţe sau alte deşeuri celulozice. Studiind complexul celulazic de la S.flavogriseus, Ishaque şi Kluepfel (1980) au stabilit că aceste bacterii produc enzime extracelulare capabile de a degrada, cu o rată diferită, carboximetilceluloza, hârtia de filtru şi fibrele de bumbac. De asemenea, tulpina respectivă produce şi -glucozidază dar această enzimă rămâne în cea mai mare parte localizată intracelular. Cercetările ulterioare realizate asupra unor tulpini aparţinând aceleiaşi specii (S.flavogriseus) au condus la precizarea că aceste bacterii produc atât endoglucanaze cât şi exoglucanaze (celobio-hibrolaze)(Mac Kenzie şi colab.,1984). Rezultate asemănătoare au fost comunicate şi de alţi autori în cazul unor specii diferite de Streptomyces: S.reticuli (Wachinger şi colab., 1989) sau Streptomyces sp.SD16 (Cornea şi colab.,1992) (Figura 6).

In ceea ce priveşte stabilirea condiţiilor optime de acţiune a acestor enzime, există o oarecare variaţie în funcţie de tulpina bacteriană studiată şi de autor. Astfel, în cazul tulpinilor de S.flavogriseus analizate, testarea acţiunii enzimelor pe CMC se realizează la 50⁰C, în tampon fosfat 50mM pH 6 (Mac Kenzie şi colab.,1984) sau în tampon citrat-fosfat 50mM pH 7 (Ishaque şi Kluepfel, 1980), în timp ce activitatea enzimatică pe hîrtie de filtru sau pe celuloză microcristalină (Avicel) se realizează la 40⁰C fie în tampon fosfat 50mM pH 6 (Mac Kenzie şi colab.,1984) fie în tampon citrat 50mM pH 5,6 (Ishaque şi Kluepfel, 1980). La o altă specie, S.reticuli, testarea activităţii celulazelor s-a realizat la 45⁰C în tampon Tris HCl pH 7,5 (Wachinger şi colab., 1989). Alţi autori (Godden şi colab., 1989) testează activitatea endoglucanazică a filtratului de cultură de la o tulpină de Streptomyces în tampon fosfat de potasiu 100mM, pH 8 la 50⁰C. Recent, Theberge şi colab.(1992) au caracterizat o endoglucanază de la S.lividans 66 care prezenta o activitate optimă la p 5,5 la 50⁰C. O situaţie particulară a fost evidenţiată la o tulpină alcalofilă de Streptomyces tulpină capabilă de a sintetiza trei endoglucanaze diferite, cu pH optim de acţiune ce variază între 6 şi 8,5 (Nakai şi colab.,1988).

Figura 6. Selecţia unor noi tulpini de Streptomyces sp. producătoare de celulaze.
In cadrul unor exprimente realizate cu o tulpină de Streptomyces sp.SD16 izolată în Institutul de Biologie Bucureşti, Cornea şi colab. (1992) au înregistrat o activitate endoglucanazică maximă la pH 6,4 la 50⁰C în tampon fosfat de potasiu 50mM. In cazul utilizării drept substrat a hârtiei de filtru au fost obţinute valori maxime de degradare (eliberare de zaharuri reducătoare) la 40⁰C în tampon fosfat de potasiu 50mM la pH 5,8 şi pH 8 (Figura 7).

Figura 7. Activitatea enzimatică a unor tulpini de streptomicete izolate din sol (după Cornea şi colab., 1992).
Streptomicetele, ca multe alte bacterii, sitetizează celobiază (β-glucozidază) dar în mod normal nu o excretă în mediul de cultură ci ea rămâne localizată intracelular. Studii mai amănunţite asupra acestui tip de enzime au fost realizate la tulpini de S.granaticolor (Jiresova şi colab.,1987) la care s-a încercat izolarea şi caracterizarea enzimei, ca şi la S.thermodiastaticus (Ozaki şi Yamada, 1991). La această ultimă specie a fost obţinută o tulpină care produce o β-glucozidază a cărei sinteză nu este afectată de glucoză, enzima fiind purificată şi caracterizată. Alături de această enzimă rezistentă la acţiunea glucozei, de la aceeaşi tulpină bacteriană au mai fost izolate încă două enzime de acelaşi tip (β-glucozidaze) dar a căror sinteză este supusă inhibării de către glucoză.

Un aspect interesant al cercetărilor referitoare la celulazele produse de bacteriile din genul Streptomyces este izolarea şi purificarea componentelor acestui sistem. Spre deosebire de bacteriile din genul Thermomonospora la care au fost bine caracterizate cinci endoglucanaze diferite (E1-E5) dintre care E3 prezintă sinergism atât cu alte endoglucanaze cât şi cu o celobiohidrolază izolată de la Trichoderma reesei (Wilson, 1992), la streptomicete asemenea rezultate sunt mai puţine.

Nakai şi colab.(1987) au purificat şi caracterizat de la o tulpină alcalofilă de Streptomyces (Streptomyces sp.KSM9) trei celulaze diferite care degradează preferenţial CMC şi care au fost notate CMC-aza I, CMC-aza II şi CMC-aza III. Greutăţile moleculare ale acestor enzime variază între 32 kDa (CMC-aza I), 32,5 kDa (CMC-aza II) şi 92 kDa (CMC-aza III). Purificarea şi separarea celor trei enzime s-a realizat prin cromatografie pe schimbători de ioni, prin trecerea pe o coloană de DEAE-Toyopearl 650M a unui preparat celulazic brut, rezultat prin precipitarea cu sulfat de amoniu (70%) a proteinelor din filtratul de cultură şi eluarea lor cu un gradient linear de NaCl (0,05-0,4M). Alţi autori (Wachinger şi colab.,1989) au fracţionat celulazele de la S.reticuli prin gel filtrare pe Superose 12 şi au obţinut cel puţin două CMC-aze precum şi mai multe proteine cu activitate pe celuloza microcristalină. CMC-azele, notate CMC-aza 1 de 40 kDa şi CMC-aza 2 de 48 kDa prezintă un pH optim de acţiune ce variază între 5,5 şi 7,5 la o temperatură de 45-50⁰C. De asemenea ele nu sunt inhibate de tamponul fosfat şi nu sunt stimulate de adăugarea de ioni de calciu în amestecul de reacţie. Spre deosebire de acestea, preparatul enzimatic ce prezintă activitate specifică pe Avicel, supus electroforezei în gel de poliacrilamidă în condiţii de denaturare a evidenţiat prezenţa a mai multor benzi cu greutăţi moleculare ce au variat între 42 şi 120 kDa (42, 56, 70, 120). Preparatul enzimatic obţinut prin gel filtrare a avut o temperatură optimă de acţiune la 45-50⁰C la un pH optim 7. Activitatea celulazică pe substrat de Avicel este redusă semnificativ în tampon fosfat, dar este stimulată de adăugarea de CaCl₂ 40mM şi de asemenea ea este pierdută rapid, în decursul a câtorva zile prin păstrare la 4⁰C, în timp ce CMC-azele sunt mult mai stabile. Proprietăţile avicelazei de la S.reticuli sunt foarte asemănătoare celor descrise pentru exoglucanaza de la Ruminococcus albus care a fost izolată sub forma unui complex de 230 kDa, alcătuitdin monomeri de 118 kDa (Gardner şi colab., 1987).

Recent, Theberge şi colab.(1992) au purificat şi caracterizat o endoglucanază de la S.lividans 66 după cultivarea bacteriilor pe mediu cu xiloză ca sursă de carbon. Aceasta este o glicoproteină cu greutatea moleculară de 46 kDa, cu pI la 3,3 şi cu o activitate maximă asupra CMC la 50⁰C la pH 5,5. Interesant este că prin cultivarea bacteriilor în mediu cu Avicel sau celobioză ca sursă principală de carbon s-a obţinut un preparat enzimatic alcătuit din mai multe proteine de dimensiuni variate, dar active pe oligozaharide şi care au interacţionat pozitiv cu anticorpii anti-endoglucanază. Fenomenul respectiv a fost observat la celulazele de la Trichoderma reesei şi de la Clostridium thermocellum, el datorându-se în cazul fungilor fie unui grad diferit de glicozilare a proteinelor fie unor modificări proteolitice. In cazul bacteriilor fenomenul s-ar putea explica prin formarea unor complexe enzimatice specifice, celulosomi, doar în prezenţa substratelor microscristaline. Autorii presupun însă că apariţia fragmentelor endoglucanazice la S.lividans 66 s-ar datora mai degrabă unei serii de fenomene proteolitice decât unei glicozilări diferenţiate sau formării celulosomilor. In orice caz, activitatea specifică a endoglucanazei de S.lividans comunicată de autori a fost de 539 IU/mg proteină, ceea ce reprezintă una dintre cele mai mari valori raportate în literatură (Theberge şi colab.,1992).

Rezultate interesante au fost obţinute şi de Mac Kenzie şi colab.(1984) care au reuşit, printre puţinii cercetători de altfel, izolarea şi caracterizarea unei exoglucanaze de la o tulpină de S.flavogriseus. Aceasta s-a realizat prin cromatografie pe DEAE Bio-Gel A a unui preparat brut obşinut prin concentrarea de 100 ori a filtratului de cultură (prin ultrafiltrare). Eluarea enzimelor s-a făcut cu un gradient linear de NaCl (0-0,2M) obţinâdu-se mai multe "peak-uri" cu activitate celulazică. Cinci dintre acestea au prezentat activitate CMC-azică iar unul a evidenţiat o activitate enzimatică complexă (avicelazică, CMC-azică, xilanazică şi proteazică). Fracţiile care au prezentat cea mai mare activitate avicelazică au fost supuse gel filtrării pe Bio-Gel P60 reuşindu-se separarea avicelazei de CMC-ază. Fracţiile active au fost apoi trecute pe o coloană de Concanavalină A-Sefaroză 4B, fiind recuperată o proteină de 46 kDa care nu a prezentat afinitate pentru coloana respectivă (pentru lectina imobilizată). Această proteină prezintă pI la 4,15, determină în special hidroliza celulozei tratate cu acizi ("acid-swollen cellulose"), produşii de hidroliză fiind celobioza şi celotrioza (în cea mai mare parte).

Datele obţinute la streptomicete, în special de la tulpinile de S.flavogriseus evidenţiază faptul că mecanismul de acţiune al celulazelor de la aceste bacterii este mai degrabă asemănător celui descris la fungi la care degradarea substratelor celulozice se datorează acţiunii sinergice a endoglucanazelor, exoglucanazelor şi β-glucozidazei. De asemenea, glicozilarea unora dintre componentele sistemului celulazic de la streptomicete (a endoglucanazelor, de exemplu), fenomen care este destul de puţin răspândit la bacterii dar frecvent la fungi poate sugera un comportament asemănător al celulazelor de la streptomicete cu cel al unor fungi. In ceea ce priveşte semnificaţia glicozilării, deşi unii autori atribuie glucidului un rol în funcţionarea enzimei, ea rămâne încă neclară (Knowles şi colab.,1987).

Cu toate acestea explicarea mecanismului de acţiune a celulazelor de la streptomicete este complicat de faptul că la unele tulpini bacteriene, la S.reticuli de pildă, au fost identificate celulaze legate de miceliu ("mycelium buond cellulase") care amintesc de formarea celulosomilor de la Clostridium thermocellum (Lamed şi Bayer, 1988; Wachinger şi colab.,1989). O organizare a celulazelor în celulosomi similară celei evidenţiate la clostridii a fost descrisă şi la Thermomonospora curvata deşi studiile au fost în special de microscopie electronică (Figura 8).

Figura 8. Aspect electronomicroscopic al suprafeţei celulelor de T.curvata cultivate pe fibre de celuloză (după Bond şi Stutzberger, 1989).
Modificarea aspectului suprafeţei celulelor de streptomicete cultivate în mediu de cultură ce conţine celuloză drept unică sursă de carbon a fost observată la tulpinile Streptomyces sp.SD16 şi Streptomyces sp.P216 (Figura 9) (Cornea, 1996). Aceste rezultate sugerează că fenomenul complexării sistemului celulazic este comun mai multor tipuri de bacterii iar mecanismul de degradare a celulozei este mai complicat decât s-a presupus iniţial (Ljungdahl 1989).


Figura 9. Aspect electronomicroscopic al celulelor Streptomyces sp.SD16 cultivate în mediu minimal ce conţine celuloză.
In ceea ce priveşte determinismul genetic al producerii enzimelor celulozolitice, datele referitoare la streptomicete sunt destul de puţine şi incomplete. In general, clonarea şi secvenţierea unei gene structurale pentru o enzimă este utilă nu numai pentru determinarea secvenţei de aminoacizi pe care proteina îi conţine ci şi pentru a obţine proteina în cantitate mai mare ca şi pentru studii de mutageneză care să determine rolul anumitor secvenţe de aminoacizi în funcţionarea enzimei. Clonarea prezintă interes mai ales pentru celulaze deoarece prezenţa mai multor gene care codifică aceste enzime la majoritatea microorganismelor celulozolitice face dificilă atât obţinerea de mutante cât şi studiul rolului fiecărui component în parte.

Până în prezent s-a reuşit izolarea, secvenţierea şi clonarea în diferite tulpini mutante de S.lividans (care nu produc celulaze) sau în E.coli a trei gene implicate în sinteza celulazelor la streptomicete: gena casA ce codifică CMC-aza I de la o tulpină alcalofilă de Streptomyces sp. (Nakai şi colab.,1988), gena celA ce codifică o endoglucanază de la S.lividans 66 (Theberge şi colab.,1992) şi gena celA1 ce codifică o endoglucanază de la S.halstedii (Fernandezabalos şi colab.,1992). De asemenea, Shareck şi colab.(1987) au realizat clonarea într-o tulpină mutantă de S.lividans (care nu producea celulaze) a unei secvenţe de ADN care a determinat nu numai restabilirea capacităţii de a degrada celuloza ci şi o sporire de peste 800 ori a activităţii enzimatice comparativ cu tulpina sălbatică. Interpretarea rezultatelor în acest caz rămâne dificilă deoarece genele clonate nu au fost analizate astfel că nu se poate preciza dacă secvenţele de ADN clonate conţin gene ce codifică celulaze (endoglucanaze) sau proteine reglatoare.

Secvenţierea genelor casA şi celA a relevat prezenţa unei secvenţe de 14 pb repetate inversat, plasată înaintea regiunii ce codifică proteinele respective, secvenţă identificată şi la nivelul genelor celE2, celE4 şi celE5 de la Thermomonospora fusca (Wilson, 1992; Theberge şi colab., 1992). De asemenea, din examinarea secvenţelor de aminoacizi deduse din examinarea secvenţelor de nucleotide ale genelor casA şi celA şi compararea lor cu secvenţele de aminoacizi ale altor celulaze au fost evidenţiate elementele structurale ale celulazelor respective, aşa cum au fost ele propuse de Gilkes şi colab.(1991): domeniile catalitice, domeniile de legare la celuloză, linkerii ce unesc asemenea domenii şi secvenţele repetate de aminoacizi. Spre exemplu, endoglucanaza produsă de S.lividans 66 (codificată de gena celA) este alcătuită din două domenii (domeniul catalitic şi domeniul de legare la celuloză) conectate de un linker scurt, extremitatea amino-terminală evidenţiind un grad înalt de omologie cu domeniul de legare la celuloză ("cellulose-binding domain") al endoglucanazei CenA de la Cellulomonas fimi, iar regiunea din mijlocul proteinei prezintă omologie extinsă cu celulaza E5 de la T.fusca şi alte endoglucanaze de Bacillus (Theberge şi colab., 1992).

Conform propunerilor lui Henrissat şi colab.(1989) şi Gilkes şi colab.(1991) de grupare a celulazelor în familii pe baza secvenţelor de aminoacizi de la nivelul domeniilor catalitice conservate la mai multe microorganisme şi a analizei regiunilor ("clusteri") hidrofobe, endoglucanazele ale căror gene au fost clonate şi secvenţializate (casA şi celA) pot fi încadrate în familia A (celA), alături de endoglucanaze de la Clostridium thermocellum, B.subtilis, Bacillus sp., Erwinia chrosanthemi, Ruminococcus albus, Clostridium cellulolyticum etc, şi în familia B (casA) alături de endoglucanaze de la Cellulomonas fimi, Microbispora bispora şi o celobiohidrolază de la Trichoderma reesei.

Reglarea activităţii celulazelor reprezintă un alt aspect al cercetărilor cu aceste enzime, în scopul stabilirii condiţiilor optime de producere şi acţiune a acestora. La fel ca şi în cazul mecanismului de degradare a substratelor celulozice, mecanismul de reglare a sintezei şi activităţii celulazelor este destul de neclar. O ipoteză generală susţine că microorganismele celulozolitice produc celulazele la un nivel bazal care este însă suficient pentru a asigura hidroliza celulozei insolubile, rezultând produşi de degradare care pot funcţiona ca inductori determinând sinteza unor cantităţi crescute de celulaze (Robson şi Chambliss, 1989). Ca şi alte enzime hidrolitice extracelulare şi celulazele se sintetizează ca răspuns la prezenţa inductorului, ele fiind represate de obicei de produşii finali de degradare. In cazul actinomicetelor există mai multe date referitoare la reglarea celulazelor la bacteriile din genul Thermomonospora. Astfel, sinteza celulazelor de către T.fusca este reglată atât prin inducere cât şi prin represie (Liu şi Wilson, 1987). Wilson (1992) a arătat că tulpina T.fusca YX cultivată pe celuloză a evidenţiat o activitate celulazică de 100 ori mai mare decât cea obţinută prin cultivarea în mediu cu glucoză ca sursă unică de carbon. Alţi autori (Fennington şi colab.,1984) au obţinut o tulpină mutantă de T.curvata capabilă de a rezista la acţiunea inhibitoare a glucozei. Liu şi Wilson (1988) au reuşit izolarea unei tulpini mutante de T.fusca YX care sintetiza în mod constitutiv celulaze, dar sinteza lor era supusă în continuare represiei produse de glucoză. Spre deosebire de bacteriile din genul Thermomonospora, la streptomicete există foarte puţine date referitoare la reglarea sintezei celulazelor iar cele care există sunt oarecum contradictorii. Astfel, Mac Kenzie şi colab.(1984) au arătat că activitatea celulazelor de la S.flavogriseus este inhibată de concentraţii mai mari de glucoză şi celobioză, în timp ce Ball şi Mc Carthy (1988) susţin că în cazul unor tulpini de Streptomyces izolate de ei glucoza şi xiloza nu exercită efect inhibitor asupra enzimelor implicate în degradarea deşeurilor celulozice de tipul paielor. In orice caz, cultivarea bacteriilor pe mediu ce conţine celuloză pulbere sau CMC are drept consecinţă inducerea sintezei doar a enzimelor celulazice în timp ce prin cultivarea bacteriilor pe medii mai complexe (cu paie, xilan sau tărâţe de grâu) are loc inducerea unei game mai largi de enzime hidrolitice: atât celulaze cât mai ales hemicelulaze (Mac Kenzie şi col., 1987, Godden şi colab., 1989). Spre exemplu, Godden şi colab. (1989) utilizând pentru testări o tulpină de Streptomyces sp. a evidenţiat faptul că endoglucanazele şi β-glucozidazele sunt induse specific prin cultivarea pe mediu cu CMC ca sursă de carbon. Celobioza a evidenţiat o slabă acţiune de inducere a sintezei endoglucanazelor, dar induce -glucozidaza în timp ce celotrioza şi celotetraoza induc slab endoglucanazele. Obţinerea unei activităţi celulazice specifice ridicate în filtratele de cultură rezultate prin cultivarea bacteriilor pe substratele celulozice naturale (de exemplu paie) se datorează probabil unei cooperări dintre diferiţii inductori rezultaţi din acţiunea componentelor complexului lignocelulozic. Mai mult, inducerea sintezei celulazelor este inhibată de adăugarea a 50 g/ml cloramfenicol ceea ce ar sugera că , cel puţin în cazul tulpinii analizate, inducerea enzimelor este mai degrabă o sinteză "de novo" (Godden şi colab. 1989).

3.5. Hemicelulazele
Alături de celuloză şi lignină, hemicelulozele reprezintă componente de bază ale peretelui celular vegetal, degradarea lor în natură realizându-se destul de greoi, prin cooperarea unor sisteme enzimatice de origini foarte diferite. Intre microorganismele producătoare de hemicelulaze un loc important este ocupat de streptomicete datorită sintezei unei game foarte variate de asemenea enzime.

Hemicelulozele sunt polizaharide care conţin diferite tipuri de resturi de zaharuri (xiloză, manoză, galactoză, arabinoză sau glucoză) ce alcătuiesc polimeri lineari sau ramificaţi. Clasificarea acestor substanţe se face în funcţie de conţinutul în zaharuri. Dintre acestea, β-1,4-D-xilanii reprezintă grupul major de hemiceluloze fiind alcătuiţi din resturi de D-xilopiranozil unite prin legături de tip β-1,4. In mulţi xilani resturile de D-xilopiranozil sunt întocmite de arabinozil, glucuronozil sau diferite grupări acetil, în funcţie de planta de origine. Un alt grup de hemiceluloze, mananii sînt constituiţi din resturi de D-manopiranozil unite tot prin legături de tip -1,4. Si în cazul acestor polimeri unităţile specifice de D-manopiranozil pot fi înlocuite de D-galactozil sau grupări acetat (Zimmermann, 1989). Hemicelulozele reprezintă un important component al peretelui celular vegetal, ele putând fi linkate la compuşi fenolici sau pot prezenta legături cu lignina.

Sistemul enzimatic pentru degradarea hemicelulozelor constă în enzime care clivează legăturile din interiorul macromoleculei (endoenzime) şi în exoenzime care taie resturile de zaharuri de la extremităţile nereducătoare ale polimerului. Prezenţa unor substituenţi variaţi influenţează puternic hidroliza enzimatică. De aceea, pentru hidroliza completă a hemicelulozelor sunt necesare enzime care să taie în diferite puncte de ramificaţie. In sistemul xilanolitic, aceste enzime acţionează în cooperare cu xilanazele pentru hidroliza completă a xilanilor (Biely, 1985).

Tinând cont de habitatul natural al streptomicetelor şi de prezenţa în acesta a unei mari cantităţi de materiale celulozice şi lignocelulozice, bacteriile respective pot fi considerate ca o sursă potenţială de enzime hemicelulozolitice (Zimmermann şi colab., 1992).

Sistemul enzimatic de degradare a xilanului de la diferite tulpini de Streptomyces a fost studiat în detaliu. La aceste bacterii au fost identificate mai multe tipuri de hemicelulaze: xilanaze, β-xilozidaze, α-L-arabinofuranozidaze, α-4-O-metil-glucuronidaze, acetil-xilan esteraze, ferulic şi cumaric esteraze, enzime ce degradează mananii (mananaze). Dintre acestea, 1,4-β-D-xilanazele (EC 3.2.1.8.) au fost mai mult studiate, ele fiind detectate la numeroase tulpini de Streptomyces (Ball şi Mc Carthy, 1988). De asemenea, s-a evidenţiat faptul că aceeaşi tulpină poate produce mai multe xilanaze distincte. Spre exemplu, S.ostreogriseus şi S.exfoliatus produc câte 5 asemenea enzime în timp ce S.lividans produce o singură asemenea xilanază (Sreenath şi Joseph, 1982; Morosoli şi colab.,1986). Recent, Lumba şi Penninchx (1992) au caracterizat mai multe forme de β-xilanază izolate de la o tulpină de Streptomyces cultivată pe lignoceluloză. Interesant însă că în cazul acestei tulpini, formele de β-xilanază evidenţiate nu acţionează sinergic pentru hidrolizarea substratului ceea ce ar constitui o redundanţă a cărei semnificaţie nu este clară.

Pentru purificarea şi caracterizarea xilanazelor de la diferite streptomicete (Tabelul 6) s-au utilizat filtrate de cultură din care enzimele au fost precipitate cu sulfat de amoniu şi apoi supuse unor tratamente speciale: ultrafiltrare, cromatrografie pe schimbători de ioni, gel filtrare şi focusare izoelectrică ("isoelectric focusing")(Sreenath şi Joseph, 1982; Morosoli şi colab., 1986; Mac Kenzie şi colab., 1987; Yasui şi colab., 1988).

Cele mai multe dintre aceste enzime au pH între 5 şi 6,5 iar punctul lor izoelectric variază între 5,2 şi 10,3 (Zimmermann, 1989). Xilanazele determină hidroliza xilanilor prin ruperea legăturilor interne β-1,4, determinând eliberarea de xilotrioză, xilobioză sau xiloză (Yasui şi colab., 1988). Un alt tip de hemicelulaze produse de streptomicete, exo-β-1,4-xilozidazele (1,4-β-D xylan xylohydrolase, EC 3.2.1.37) hidrolizează xilanii prin atac la extremităţile nereducă toare ale lanţului de polimer.
Tabelul 6. Proprietăţile unor xilanaze izolate din diferite tulpini de streptomicete.

Tulpina	pH optim	t^0 optimă	pI	greutate moleculară (kDa)
S.xylophagus	6,5	55-60	-	-
S.flavogriseus CD45-2	6,5	50	-	-
S.exfoliatus	5,5	50	-	-
Streptomyces sp. KT23	5,5	55	6,9	43
S.lividans	5,5-6,5	55-65	5,2	-
Streptomyces sp.E86	5,5-6,2	55-60	7,3	40

Eliberarea de resturi α-L-arabinoză din arabinoxilani, arabinani şi arabinogalactani se datorează acţiunii specifice a α-L-arabinofuranozidazelor, enzime evidenţiate la unele specii de Streptomyces (S.rubiginosus, S.purpurascens, S.massasporus) (Zimmermann, 1989). Alte enzime, α-4-O-metilglucironidaze, evidenţiate la S.flavogriseus şi S.olivochromogenes (Mac Kenzie şi colab., 1987) determină clivarea legăturilor α-1,2 dintre acidul glucuronic şi resturile de xiloză, acţionând sinergic cu xilanazele în procesul de hidroliză a xilanilor. Pe lângă aceste tipuri de hemicelulaze, unele tulpini de Streptomyces mai pot sintetiza şi alte enzime care hidrolizează alte specii de xilani. Acetil-xilan esterazele produse de S.olivochromogenes şi S.rubiginosus participă alături de xilanaze la hidroliza acetil-xilanilor în timp ce alte tulpini de Streptomyces (S.viridosporus) pot produce ferulic esteraze care eliberează acid ferulic din arabinixilanii aflaţi în cantităţi mai mari în peretele celular al gramineelor (Mac Kenzie şi colab., 1987; Deobald şi Crawford, 1987).

O categorie mai puţin studiată de hemicelulaze produse de streptomicete (ţinând cont de literatura de specialitate) este reprezentată de mananaze (1,4-β-D-manan mananohidrolaza, EC 3.2.1.78.) evidenţiate la unele tulpini de S.olivochromogenes sau la alte specii.

Utilizarea tehnicilor de biologie moleculară şi implicit a celor de inginerie genetică în studiul hemicelulazelor de la streptomicete a permis izolarea şi caracterizarea genelor implicate în producerea unor asemenea enzime. Astfel, Mondou şi colab.,(1986) au raportat clonarea unei gene pentru endoxilanază de la S.lividans într-o tulpină mutantă neproducătoare. Clonele ce conţineau un fragment de ADN de 2kb au evidenţiat o creştere de peste 60 ori a producerii de xilanază comparativ cu tulpina sălbatică . De asemenea, Iwasaki şi colab.(1986) au realizat transferul genei pentru xilanază izolată de la o tulpină de Streptomyces în alte două tulpini de streptomicete - S. lividans şi S. kasugaensis - la care s-a observat o creştere a nivelului de sinteză a enzimei respective prin achiziţionarea unui fragment de ADN de 1,04kb. Alături de clonările de gene, fuziunile de protoplaşti constituie o metodă relativ simplă dar eficientă de a obţine tulpini recombinate genetic, capabile de o mai bună degradare a substratelor complexe. Astfel, Pettey şi Crwford (1984) au obţinut o îmbunătăţire a capacităţii de degradare a hemicelulozelor şi ligninei de către o tulpină recombinată obţinută prin fuziunea interspecifică de protoplaşti de la S.viridospurus T7A şi S.setonii 75 Vi2. Rezultate asemănătoare au for prezentate de Cornea şi colab.(1992) care, în urma fuziunii protoplaştilor de S.flavovirens SfG3 cu protoplaşti izolaţi de la Streptomyces sp.SD16 au obţinut mai multe tulpini recombinate genetic care prezentau o capacitate crescută de degradare a substratelor celulozice şi hemicelulozice comparativ cu tulpinile parentale (Figura 10).

Uneori, enzimele produse de diferite tulpini de streptomicete (preparate brute sau enzime purificate) au fost studiate în privinţa acţiunii lor asupra peretelui celulei vegetale sau al unor fungi. Astfel, Cornea şi colab.(1992) au evidenţiat faptul că prin utilizarea unui filtrat de cultură de Streptomyces sp.SD16 s-au putut obţine în condiţii experimentale specifice protoplaşti vegetali de Nicotiana tabacum. Acest rezultat sugerează faptul că filtratul de cultură conţine o mare varietate de enzime asemănătoare celulazelor, hemicelulazelor dar şi alte enzime care cooperează în degradarea peretelui celular vegetal.


Figura 10. Comparaţie între activitatea enzimatică (celulozolitică) a unor tulpini de streptomicete de tip sălbatic (P216, SD16 şi SFG3) şi a unor recombinanţi obţinuţi prin fuziune triparentală de protoplaşti.
In ceea ce priveşte acţiunea pe peretele celular fungic, s-a dovedit că printre enzimele sintetizate de unele tulpini de Streptomyces se numără şi chitinazele, enzimele ce degradează componenta chitinică (dominantă) a peretelui celular fungic ducând la formarea protoplaştilor (Tagawa şi Okazaki, 1991). Okazaki şi Tagawa (1991) au izolat şi caracterizat o chitinază produsă de S.cinereoruber după cultivarea pe un mediu ce conţinea ca sursă de carbon pereţi celulari de Aspergillus niger. Enzima respectivă are o greutate moleculară de 19 kDa şi un pI 8,6 iar pH optim se situează în domeniul acid (4,0-5,0) la 50⁰C.

Beyer şi Diekeman (1984) au caracterizat enzime de tip laminarinază de la Streptomyces sp.ATCC11238 ca şi un complex de enzime ce degradează eficient chitina şi laminarina, fiind active asupra a peste 50 specii de ascomicete. Fracţionarea chitinazei prin gel filtrare şi cromatografie pe schimbători de ioni a condus la evidenţierea unei exo-chitinaze şi a unei β-N-acetil-glucozoaminidaze ce eliberează N-acetil glucozamina din crusta chitinoasă de crab (Beyer şi Diekman, 1985). In mod asemănător, Billich şi colab.(1988) au obţinut protoplaşti de Fusarium scirpi prin utilizarea unui preparat enzimatic de S.tsushimaensis.

Datele prezentate în această lucrare reflectă particularităţile deosebite ale bacteriilor din genurile Streptomyces şi Bacillus şi importanţa pe care acestea o au atât din punct de vedere teoretic cât şi practic, fie pentru obţinerea unor compuşi cu aplicaţii in medicină, industria alimentară, a detergenţilor etc. fie în natură, ca verigi importante ale mecanismelor de degradare şi reciclare a unor resturi organice existente de obicei în sol. Cunoaşterea echipamentului lor enzimatic, al potenţialului lor de biosinteză ca şi al determinismului genetic al acestuia corelată cu tehnicile moderne de biologie moleculară şi cu cele de fuziuni celulare asigură, pe de o parte, o mai bună studiere a caracteristicilor acestor bacterii, inclusiv a taxonomiei grupului iar, pe de altă parte, poate conduce la obţinerea unor tulpini recombinate genetic capabile de a sintetiza sau degrada cu o eficienţă crescută anumiţi compuşi cu importanţă practică deosebită.