FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- Şekil-1 Şekil-2
- B.41. IN VITRO 3T3 NRU FOTOTOKSİSİTE TESTİ YÖNTEM
KAYNAKLAR
Şekil-1  Şekil-2  B.41. IN VITRO 3T3 NRU FOTOTOKSİSİTE TESTİ
Fototoksisite, cildin bazı kimyasallara ilk defa maruz kalması ve bunu takiben ışığa maruz kalması ile tetiklenen ve kimyasalın sistematik uygulanmasından sonra cildin ışınlamaya benzeyen indüklenmesi olarak tanımlanır. In vitro 3T3 NRU fototoksisite testlerinden eldilen bilgiler, test maddesinin UV ve görünür ışıkla etkileşiminde ortaya çıkacak olası tehlikelerinin olması veya olmaması gibi fototoksisite potansiyelinin belirlenmesini sağlar. In vitro teste ait toksisitede son nokta, bir kimyasal ve ışıkla beraber indüklenen fototoksisite belirlenmesi olduğundan, fototoksik bileşiklerin in vivo olarak cilde sistemik uygulanmasından ve dağılmasından ve bunun yanında cilde bölgesel olarak uygulanmasından sonra fotoiritan gibi davranan bileşikler testle belirlenebilir. İn vitro 3T3 NRU fototoksisite testi EU/COLIPA projesinde 1992-1997 arasında geliştirilmiş ve geçerli hale getirilmiştir (1)(2)(3), böylece kullanılan çeşitli in vivo testlere alternatif olarak geçerli in vitro bir test oluşturulmuştur. 1996’da OECD çalışma toplantısında fototoksisite değerlendirmesi için in vitro kademeli test yaklaşımını tavsiye edilmiştir (4). In vitro 3T3 NRU fototoksisite testinin sonuçları, akut fototoksisite / fotoiritan etkileriyle hayvanlarda ve insanlarda in vivo olarak karşılaştırılmış ve testin bu etkileri mükemmel şekilde öngördüğü gösterilmiştir. Her ne kadar bu özgün özelliklere sahip pek çok kimyasal in vitro 3T3 NRU fototoksisite testinde pozitif sonuç verecekse de, bu test kimyasal ve ışığın birlikte etkileşmelerinden kaynaklanan fotogenotoksisite, fotoalerji ve fotokanserojenite gibi olumsuz etkilerin tahmini için tasarlanmamıştır. İlaveten, test fototoksikpotensiyelin değerlendirmesi için tasarlanmamıştır. Kimyasallara fototoksisite test uygulamasının sıralı bir yaklaşımı EK- I’de verilmiştir.
Işık saçma (irradyans): W/m² or mW/cm² olarak ölçülen bir yüzeye çarpan ultraviyole veya görünür ışık yoğunluğu Işık dozu: bir yüzeydeki ultraviyole (UV) veya görünür radyasyon miktarı (=şiddet ×zaman), birim yüzey alanına düşen joule (= W × s) olarak ifade edilir, ör. J/m² or J/cm². UV ışık dalgaboyları: CIE (Commission Internationale de L'Eclairage) tarafından tavsiye edilen adlandırmalar: UVA (315-400nm), UVB (280-315nm) ve UVC (100-280nm). Diğer gösterimler de ayrıca kullanılır: UVB ve UVA arasındaki ayırım genellikle 320nm’de yer alır ve UVA, UV-A1 ve UV-A2 olarak ikiye ayrılabilir, ayırım 340 nm’de olur. Hücre yaşama kabiliyeti (yaşayabilirliği): Bir hücre populasyonunun toplam aktivitesini ölçen (ör.canlıboya Neutral Red’in hücresel lizozomlara alımı), ölçülen son noktaya ve kullanılan testin tasarımına bağlı olarak hücrelerin toplam sayıları ve/veya yaşama kabiliyetleriyle ilişkilendiren parametre Hücre canlılığı: Tüm test prosedürü boyunca alınan (ya +UV ya da -UV) fakat test kimyasalıyla muamele edilmemiş negatif (çözücü) kontrolleriyle ilişkili olarak ifade edilen hücre yaşama kabiliyetidir. Tahmin modeli: Bir toksisite testinin sonuçlarını potansiyel toksisite tahminine dönüştüren bir algoritmadır. Mevcut test talimatnamesinde, PIF ve MPE in vitro 3T3 NRU fototoksisite testinin sonuçlarının dönüşümü ve fototoksisite potansiyelin tahminini için kullanılabilir. PIF (Foto İritasyon Faktörü): Test kimyasalının sitotoksik olmayan UVA/vis ışığın varlığında (+UV) ve yokluğunda (-UV) elde edilen iki eşit etkili sitotoksik konsantrasyonunun (EC50) karşılaştırılmasıyla ortaya çıkan faktör. MPE (Ortalama Foto Etki): Sitotoksik olmayan UVA/vis ışığın varlığında (+UV) ve yokluğunda (-UV) elde edilen iki konsantrasyon-cevap eğrisinin matematiksel analizinden türetilen yeni bir ölçüm. Fototoksisite: cildin belli kimyasallara ve sonrasında ışığa maruz kalması sonucunda meydana gelen veya kimyasalın sistemik uygulamasından sonra benzer şekilde cilt irradyasyonuyla indüklenen akut toksik cevap. Fotoiritasyon: Fototoksisite teriminin alt terimi olan, sadece kimyasallara maruz kalma sonucu (topik veya oral olarak) ciltte meydana gelen fototoksik reaksiyonları tanımlamak için kullanılan ifadedir. Bu fototoksik reaksiyonlar özel olmayan hücre hasarları oluştururlar (güneş yanığı benzeri reaksiyonlar). Fotoalerji: kimyasalla veya ışıkla ilk muamelede ortya çıkmayan ve cilt reaksiyonunun gelişmesi için bir iki haftalık uyarılma süresine ihtiyaç duyulan kazanılmış immünolojik tepki Fotogenotoksisite: Hücrelerin UV/görünür ışığın genotoksik olmayan dozlarına ve genotoksik olmayan kimyasala maruz kalması sonucunda ortaya çıkan, genetik bir son noktayla birlikte gözlenen genotoksik cevap, Fotokarsinojenite: Işık veya kimyasalın tekrarlanan uygulanmalarıyla indüklenen kanserojenite. Eğer bir kimyasalla UV indüklü tümör oluşumu artıyorsa, 'foto ko-kanserojenez' terimi kullanılır.
Her bir yöntemde aynı anda test edilmesi gereken pozitif kontrol kimyasalı Klorpromazin’in yanında, yeni oluşturulan 3T3 NRU’nun fototoksisite testi için de referans kimyasal olarak kullanımı tavsiye edilmiştir (1)(3)(13).
Fototoksik etkileri indükleyen pek çok kimyasal rapor edilmiştir (5)(6)(7)(8).Yaygın olan tek özellikleri günışığı bölgesindeki ışık enejisini soğurabilmeleridir. Fotokimyanın ilk kanununa göre (Grotthaus-Draper’s Kanunu) fotoreaksiyon için ışığın yeterli düzeyde soğurulması gerekir. Bu yüzden, göz önünde bulundurulan mevcut talimatnameye göre biyolojik testlerin uygulanmasından önce, test kimyasalının UV/vis absorpsiyon (soğurulma) spektrumunun belirlenmesi gerekir (ör. OECD Talimatnamesi 101’e göre). Eğer molar ekstinksiyon/absorpsiyon (soğurulma) katsayısı 10 litre × mol-1 × cm-1’den küçükse, kimyasalın fotoreaktif potansiyeli yoktur ve ters fotokimyasal etkiler için in vitro 3T3 NRU fototoksisite testinin veya diğer biyolojik testlerin uygulanmasına ihtiyaç duyulmaz (EK-I).
Işığın (kimyasal) kromofor tarafından soğurularak fototoksik cevapla sonuçlandığı dört mekanizma tanımlanmıştır (7). Hepsi hücre hasarıyla sonuçlanır. Bu yüzden in vitro 3T3 NRU fototoksisite testi UVA/vis ışığın sitotoksik olmayan dozunun hem varlığında hem de yokluğunda test edilen kimyasalın sitotoksisite karşılaştırmasına dayanır. Bu testteki sitotoksisite, test kimyasalı ve ışınlama ile muameleden 24 saat sonra canlı boya, Neutral Red (NR, (9)) alımında konsantrasyona bağlı azalma olarak ifade edilir. Balb/c 3T3 hücreleri tek katmanın oluşması için kültürde 24 saat tutulur. Test kimyasalı başına iki 96-kuyulu plaka daha sonra kimyasalın sekiz farklı konsantrasyonuyla 1 saat boyunca ön-inkübe edilir. Daha sonra, iki plakadan biri sitotoksik olmayan UVA/vis ışığa 5 J/cm² UVA (+UV deneyi) dozunda maruz bırakılır, diğer plaka ise karanlıkta saklanır (-UV deneyi). Her iki plakada da muamele ortamı daha sonrasında kültür ortamıyla yer değiştirir ve bir başka 24 saatlik inkübasyon sonrasında 3 saatlik Neutral Red Alımı (NRU) ile hücre yaşama kabiliyeti belirlenir. Hücre canlılığı, muamele edilmemiş negatif kontrollerin yüzdesi olarak ifade edilir, sekiz test konsantrasyonunun her biri için hesaplanır. Fototoksik potansiyelin tahmini için irradyasyon varlığında (+UV) ve yokluğunda (-UV) elde edilen konsantrasyon cevapları genellikle EC50 düzeyinde karşılaştırılır. (ör. hücre yaşama kabiliyetini % 50 cf. inhibe eden konsantrasyondaki muamele edilmemiş kontroller)
Hücrelerin UVA duyarlılığı, geçmişe yönelik veriler: Hücreler UVA duyarlılığına karşı düzenli olarak kontrol edilmelidirler. Hücreler in vitro 3T3 NRU fototoksisite testinde kullanılan yoğunlukta hazırlanır, 1-9 J/cm² UVA dozlarıyla bir sonraki gün ışınlanır ve NRU yöntemi kullanıldıktan bir gün sonra hücre canlılığı belirlenir. Eğer 5 J/cm2 UVA ile irradyasyon sonrasında canlılıklarıkaranlık kontrollerin canlılığından% 80’inden daha az değilse, hücreler kalite ölçütlerine uyarlar. En yüksek UVA dozu olan, 9 J/cm2, yaşayabilirlik karanlık kontrollerinkinin % 50’sinden daha az olmamalıdır. Bu kontrol hücrelerin yaklaşık her 10 uncu pasajında tekrarlanmalıdır. Negatif kontrol hücrelerinin UVA duyarlılığı, mevcut test: Test, eğer negatif kontroller (%1’lik dimetilsülfoksit (DMSO) veya %1’lik etanol (EtOH) bulunan veya bulunmayan, Earl'ün Dengedeki Tuz Çözeltisisi (EBSS)içindeki hücreler ) +UVA deneyinde eş zamanlı karanlık deneyindeki (-UVA). aynı çözücülü ışınlanmaya tabi tutulmamış hücrelerin yaşama kabiliyetlerinin % 80’inden az olmayan bir yaşama kabiliyeti gösteriyorsa kalite ölçütlerine uyar. Negatif kontrollerin canlılıkları: Negatif kontrollerin NR ekstraktında ölçülen mutlak optik yoğunluk (OD540 NRU) kuyucuk başına ekilen 1×104 hücrenin yöntemin iki günü buyunca normal ikiye katlama zamanında yetişip yetişmediğine işaret eder. Eğer muamele edilememiş kontrollerin ortalama OD540NRUsu ≥0.2 ise, test kabul edilme ölçütlerini karşılar. Pozitif kontrol: Bilinen bir fototoksik kimyasal her bir in vitro 3T3 NRU fototoksisite testiyle eş zamanlı olarak test edilir. EU/COLIPA doğrulama çalışmasında pozitif kontrol olarak Klorpromazin (CPZ) kullanılmıştır ve bu yüzden tavsiye edilir. in vitro 3T3 NRU fototoksisite testinde standart protokolle test edilen CPZ için takip eden test kabul edilebilirlik kriterleri tanımlanmıştır: CPZ ışınlanmış (+UVA): EC50= 0.1 ila 2.0 μg/ml, CPZ ışınlanmamış (-UVA): EC50 = 7.0 ila 90.0 μg/ml. Fotoiritasyon Faktörü (PIF), ör. EC50 değişimi en az 6 olmalıdır. Değerlendirilmekte olan test kimyasalının kimyasal sınıf ve çözünebilirlik karekteristiği için uygun olduğu bilinen diğer fototoksik kimyasallar da CPZ’nin yerine eşzamanlı pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Bu durumda geçmişteki verilere dayanılarak EC50 değerlerinin aralığı ve PIF veya MPE (Ortalama Foto Etki) testin kabul edilme kriteri olarak uygun şekilde tanımlanır.
Onay çalışmasında ya ATCC’den ya da ECACC’den elde edilen fare fibroblast hücre dizisi - Balb/c 3T3, klon 31 –kullanılmıştır ve bu yüzden tavsiye edilir. Diğer hücreler veya hücre dizileri, eğer kültür koşulları hücrelerin özel ihtiyaçlarına göre uyarlanmışsa aynı test protokolüyle başarılı bir şekilde kullanılabilir fakat denklik gösterilmelidir. Hücreler düzenli olarak mikoplazma kirliliği varlığına karşı kontrol edilmeli ve sadece kontrol sonuçlarının mikoplazma varlığının olmadığını gösterdiği durumlarda kullanılmalıdır. Hücrelerin UVA duyarlılığı pasaj sayısıyla artacağından en düşük elde edilebilir pasaj sayılı Balb/c 3T3 hücreleri kullanılmalıdır. Bu da tercihen 100’den azdır. Balb/c 3T3 hücrelerinin UVA duyarlılığının bu rehberde yer alan kalite kontrol prosedürüne göre düzenli olarak kontrol edilmesi önemlidir.
Hücre pasajları için ve test prosedürü boyunca uygun kültür ortamı ve inkübasyon koşulları kullanılmalıdır. Balb/c 3T3 hücreleri için bunlar, %10 yeni doğmuş dana serumu destekli DMEM, 4 mM Glutamin, Penisilin ve Streptomisin ve 37°C / % 7,5 CO2 ortamında nemlendirilmiş inkübasyon ortamıdır. Hücre kültürü koşullarını normal geçmişe yönelik aralık içinde hücre döngüsü süresine sahip hücreler veya hücre dizilerinin kullanılmasını sağlamak oldukça önemlidir.
Donmuş stok kültürlerden elde edilen hücreler uygun yoğunluktaki kültür ortamına ekilirler ve in vitro 3T3 NRU fototoksisite testinde kullanılmadan önce en az bir defa altkültürlenirler. (Fototoksisite testinde hücreler, öyle bir kültür ortamında ekilirler ki, kültürler test sonunda yapışamazlar, hücrenin yaşama kabiliyeti hücrelerin ekiminden 48 saat sonra belirlenir). 96-kuyulu plakada yetiştirilen Balb/c 3T3 hücreleri için, kuyu başına 1104 hücre tavsiye edilen hücre yoğunluğudur. Plakalardan birinin ışınlandığı (+UVA/vis) ve diğerinin karanlıkta tutulduğu (-UVA/vis) zaman dilimi haricinde, her bir test kimyasalı için hücreler birbirine eşit iki ayrı 96-kuyulu plakada ekilirler, daha sonra tüm test prosedürü boyunca eş zamanlı olarak eşit kültür koşulları altında tutulurlar.
Metabolize eden sistemlerin kullanılması genotoksik ve kanserojenik potansiyelin tahmini için tüm in vitro testler için genel bir gereklilik iken bugüne kadar fototoksikoloji söz konusu olduğunda, kimyasalın in vivo veya in vitro bir fototoksin gibi davranması için metabolik transformasyona ihtiyaç duyan bir kimyasal bilinmemektedir. Böylece, bu testin uygulanması için metabolik aktivasyon sistemine ihtiyaç duyulmamaktadır ve de bilimsel olarak gerekçelendirilmesi gerektiği düşünülmemektedir.
Test kimyasalları, kararlılıkla ilgili veriler saklanmanın uygun olduğunu göstermedikçe kullanımdan hemen önce taze olarak hazırlanmalıdır. Fotobozunma meydana gelecek gibiyse hazırlıkların kırmızı ışıkta yapılması gerekebilir. Test kimyasalları Earl'ün Dengedeki Tuz Çözeltisisi (EBSS) veya Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) gibi tampon tuz çözeltisi içinde çözülmelidir. Işınlama sırasındaki etkileşimden kaçınmak için çözeltiler, protein içeriğinden ve ışığı soğuran pH indikatör renklerinden muaf olmalıdır. Sudaki çözünürlüğü sınırlı olan test kimyasalları uygun çözücülerde çözülmelidir, istenilen nihai konsantrasyonun 100 katı hazırlaıp sonra da 1:100 oranında tampon tuz çözeltisiyle seyreltilirler. Eğer bir çözücü kullanılırsa tüm kültürlerde, ör. test kimyasalının negatif kontrollerle birlikte tüm konsantrasyonlarında, % 1 (v/v)’lik sabit hacimde olmalıdır. Dimetilsülfoksit (DMSO) ve etanol (EtOH) tavsiye edilen çözücülerdir. Aseton gibi düşük sitotoksisiteli diğer çözücüler de uygun olabilir fakat böyle çözeltiler test kimyasalıyla reaksiyona girme, fototoksik etkinin bastırılması, radikal yakalama özellikleri gibi özgün özellikleri açısından dikkatlice değerlendirilmelidir. Vorteksleme ve/veya sonikasyon ve/veya 37°C ‘ye ısıtma çözünürlüğe yardımcı olması açısından, eğer gerekiyorsa kullanılabilir.
Işık kaynağı: Uygun ışık kaynağı ve filtre sisteminin seçimi fototoksisite test uygulamalarında en kritik faktördür. UVA ve görünür bölge genellikle fotosentilizasyon ilgilidir (7)(10), ancak UVB bu durumla daha az ilgili olup, doğrudan oldukça sitotoksiktir, sitotoksisitesi 313-280 nm arasında 1000 kat artar (11). Uygun ışık kaynağı seçiminin ölçütleri arasında test kimyasalıyla absorblanan dalga boylarını dışarı veren ışık kaynağının olması ve ışığın dozunun (makul bir zamanda gerçekleştirilebilir) bilinen fotoduyarlılık geliştiricilerin tayin edilmesi için yeterli olması bulunmaktadır. Ayrıca, uygulanan dalga boyları ve dozlar ısı emisyonunun dahil olduğu sisteme (infrared bölge) çok fazla zararlı olmamalıdır. Uygun ışık kaynağı olarak solar simülatörlerle güneş ışığının simülasyonu düşünülmelidir. Güneş benzetişimcilerde hem ksenon arklar ve (katkılı) civa-metal halojenür arklar kullanılır. İkincisinin daha az ısıyı dışarı vermesi ve daha ucuz olması avantajı vardır fakat güneş ışığıyla uyumu mükemmel değildir. Bütün güneş benzetişimciler önemli miktarlarda UVB dışarı verdiğinden, oldukça sitotoksik olan UVB dalga boylarını zayıflatmak için uygun şekilde filtrelenmelidir. In vitro 3T3 NRU fototoksisite testi için bir spektrum UVB olmadan kullanılmalıdır (UVA:UVB ~ 1:20). in vitro 3T3 NRU fototoksisite testinin doğrulama çalışmasında kullanılan filtreli güneş benzetişimci spektral ışınlama dağılımının bir örneği yayınlanmıştır (3). Dozimetre: Işık şiddeti (irradyans) her bir toksisite testinden önce geniş bantlı bir UV ölçer kullanılarak düzenli olarak kontrol edilmelidir. UV-ölçer kaynağa göre kalibre edilmelidir. UV-ölçerin performansı kontrol edilmeli ve bu amaçla aynı tipte ikinci bir referans UV-ölçer ve aynı kalibrasyonun kullanılması tavsiye edilir. İdeal olarak filtrelenmiş ışık kaynağının spektral irradyansını ölçmek ve genişbantlı UV-ölçerin kalibrasyonunu kontrol etmek için daha geniş aralıklarda, bir spektroradyometre kullanılmalıdır fakat böyle aletlerin eğitimli kişiler tarafından uygun şekilde kullanılması gerekir. 5 J/cm² (UVA) dozun onay çalışmasında Balb/c 3T3 hücrelerine sitotoksik olmadığı ve zayıf fototoksik kimyasalları bile uyaracak yeterlilikte potansiyeli olduğu belirlenmiştir. 50 dakikada 5 J/cm²’yi elde etmek için, irradyansın 1.666 mW/cm²’ye ayarlanması gerekir. Eğer başka bir hücre dizisi veya farklı bir ışık kaynağı kullanılırsa, hücrelere zararlı olmama ve standart fototoksinleri tayin etmek için yeterli olma kriterleri kullanılarak UVA dozunun çok az ayarlanması gerekebilir. Işık maruz kalma zamanı aşağıdaki gibi hesaplanır: 
Test kimyasalının en yüksek konsantrasyonu 100 μg/ml’yi geçmemelidir çünkü tüm fototoksik kimyasallar daha düşük konsantrasyonlarda tespit edilmişlerdir. Ancak daha yüksek konsantrasyonlarda yanlış pozitiflerin (tahminlerin üzerinde) insidansı artar (13). Test kimyasalının en yüksek konsantrasyonunun pH’sı yeterli olmalıdır (pH aralığı: 6.5-7.8). Test edilen kimyasalın konsantrasyon aralığı ışığın varlığında (+UVA) ve yokluğunda (-UVA) önce gelen aralık bulma deneylerinde uygun şekilde tayin edilmelidir. Konsantrasyon serilerinin aralık ve kesişimleri öyle ayarlanmalıdır ki, konsantrasyon-cevap eğrileri deneysel verilerlerle desteklenmelidir. Geometrik konsantrasyon serileri (sabit bir seyreltme faktörüyle) kullanılmalıdır.
Kültür ortamında 1x105 hücre/ml’lik hücre süspansiyonu hazırlanır ve 100 μL kültür ortamını yalnızca96-kuyulu doku kültürü microtiter plakanın sadece periferal duvarlarına (= körler) dağıtılır. Geriye kalan kuyulara 1 x105 hücre/ml (= 1 x104 hücre/kuyu)’lik hücre süspansiyonunun 100 μL’sini dağıtılır. Her bir test kimyasalı için, biri sitotoksisite belirlenmesi (-UVA) ve diğeri de fototoksisite belirlenmesi için (+UVA) olmak üzere iki plaka hazırlanır. Hücreleri 24 saat (% 7.5 CO2, 37ºC) yarı karışabilen tek tabaka oluşturuncaya kadar inkübe edilir. Bu inkübasyon süresi hücrenin yenilenmesini, tutunmasını ve üssel büyümesini hesaba katar.
İnkübasyondan sonra kültür ortamındaki hücreler boşaltılır ve kuyu başına 150 μL EBSS/PBS ile iki defa yıkanır. Uygun miktarda test kimyasalı veya sadece çözücü (negatif kontrol) içeren 100 μL EBSS/PBS ilave edilir. 8 farklı konsantrasyondaki test kimyasalı uygulanır. Hücreleri test kimyasalıyla karanlıkta 60 dakika boyunca (%7.5 CO2, 37ºC) inkübe edilir. Yöntemin (+UVA) kısmını uygulamak için hücreler oda sıcaklığında 50 dakika boyunca 1.7 mW/cm² UVA (= 5 J/cm²) ile 96-kuyucuklu plaka kapağından ışınlanır. Kapağın altında H2O’nun yoğunlaşmasını önlemek için fanla havalandırılır. İkili plakalar (-UVA) oda sıcaklığında karanlık kutuda 50 dakika (= UVA maruz kalma süresi) muhafaza edilir. Test çözeltisi dökülür ve 150 μL EBSS/PBS ile iki defa yıkanır. EBSS/PBS’i kültür ortamıyla yer değiştirilir ve bir gece (18-22 sa) inkübe edilir (7.5% CO2, 37 °C).
Mikroskobik değerlendirme Hücreler faz-kontrast mikroskop altında incelenir. Hücrelerin test kimyasalının sitotoksik etkilerine bağlı morfolojik değişiklikleri kaydedilir. Deneysel hataları dahil etmemek için kontrol yapılması tavsiye edilir fakat bu kayıtlar fototoksisite veya sitotoksisite değerlendirmesinde kullanılmazlar. Nötral Kırmızı Alım Testi Hücreleri 150 μL önceden ılıklaştırılmış EBSS/PBS’le yıkanır. Yavaşça vurarak yıkama çözeltisi uzaklaştır. 100 μl NR ortamı eklenir ve 37 °C’de % 7.5 CO2’li nemlendirilmiş bir ortamda 3 saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra NR ortamı uzaklaştırılır, hücreler 150 μL EBSS/PBS ile yıkanır. EBSS/PBS çözeltisini tamamen boşaltılır ve kurutulur (seçmeli olarak: ters çevrilen plaka santrifüjlenir) Tam 150 μL NR desorb çözeltisi (taze hazırlanmış etanol/asetik asit) ilave edilir. Mikrodamlatıcı (microtiter) plaka, mikrodamlatıcı plaka karıştırıcısında hızlı şekilde 10 dakika boyunca NR hücrelerden ekstrakte edilinceye ve homojen bir çözelti oluşuncaya kadar karıştırılır. NR ekstraktının optik yoğunluğu bir spektrofotometrede 540 nm’de, tanık standartlar olarak kullanılarak ölçülür. Veriler daha sonraki analizler için uygun dosya formatında (ör. ASCII) saklanırlar.
Veriler UVA/vis ışınlama varlığında ve yokluğunda elde edilen konsantrasyon-cevap analizlerinin anlamlı olarak yapılabilmesini sağlamalıdır. Eğer sitotoksisite gürülürse, her iki konsantrasyon aralığı ve konsantrasyonların ayrı ayrı kesişimleri öyle düzenlenmelidir ki deneysel verilerin oluşturduğu eğriyle çakışmalıdır. Test kimyasalının karanlık deneyinde (-UVA) belirlenen 100 μg/ml’lik sınır konsantrasyonu kadar sitotoksik olmaması fakat ışınlandığı zaman (+UVA) oldukça sitotoksik olması nedeniyle deneyin her iki kısımda da test edilecek konsantrasyon aralığının uygun veri özelliklerinin gerekliliklerini karşılaması için büyüklük dereceleri farklılık gösterir. Eğer deneyin iki kısmında da (-UVA ve +UVA), sitotoksisiteye rastlanmazsa tek dozla en yüksek konsantrasyon arasında büyük bir kesişme olan testin uygulanması yeterlidir. Net pozitif sonuçların deneyin tekrar edilerek doğrulanmasına gerek yoktur. İlaveten, test kimyasallarının yeterince yüksek konsantrasyonlarda test edilmesi sağlanırsa net negatif sonuçların da doğrulanması gerekmez. Böyle durumlarda, bir veya daha fazla aralık-bulma ön deneyleriyle desteklenen bir ana deney yeterlidir. Tahmin modelinin kesme çizgisine yakın, sınırda sonuçları olan testler doğrulanmaları için tekrar edilmelidir. Eğer bir tekrar testinin gerekli olduğu düşünülürse, deneysel koşulların değişkenliği net sonuçlar elde edilmesi açısından önemli olabilir. Bu testteki kilit değişken, test kimyasalı çözeltilerinin hazırlanmasıdır. Dolayısıyla, bir testin tekrarında bu koşulların değişikliği (co-çözücü, tritürasyon (öğütme), sonikasyon) en uygunu olabilir. Alternatif olarak, irradyasyon öncesindeki inkübasyon süresi değişiklikleri göz önünde bulundurulabilir. Suda kararsız olan kimyasallar için daha kısa bir süre uygun olabilir.
Mümkün yerlerde, hücresel NRU’yu (EC50) % 50 inhibe eden test kimyasalı konsantrasyonu hesaplanır. Bu hesaplama konsantrasyon-cevap verilerine uygun herhangi bir doğrusal-olmayan regresyon prosedürü uygulanarak veya diğer uygun prosedürler kullanılarak yapılır (tercihen bir Hill fonksiyonu veya mantıksal regresyon kullanılır) (14). Daha sonraki hesaplamalar için EC50 kullanılmadan önce uygunluk kontrol edilmelidir. Alternatif olarak grafiksel olarak uygun olan yöntemler EC50 hesaplanmasında kullanılabilir. Bu durumda, olasılık kağıdının kullanılması. (x-skalası: log, y-skalası: probit) tavsiye edilir, pek çok durumda konsantrasyon-cevap fonksiyonları bu transformasyon sonrasında neredeyse doğrusal hale gelir.
Eğer ışığın hem varlığında (+UVA) hem de yokluğunda UVA) tüm konsantrasyon-cevap eğrileri elde edilirse, aşağıdaki formül kullanılarak bir Fotoiritasyon Faktörü (PIF) hesaplanır: (a) 
PIF < 5 ise, fototoksisite potansiyel olmadığı, PIF ≥5 ise fototoksisite potansiyel olduğu tahmin edilir. Eğer bir kimyasal sadece +UVA’da sitotoksikse ve –UVA’da test edildiğinde sitotoksik değilse her ne kadar bu sonuç fototoksisite potansiyele işaret etse de, PIF hesaplanamaz. Böyle durumlarda eğer en yüksek konsantrasyona kadar (Cmaks), (- UV) sitotoksisite testi uygulanırsa bir "> PIF" hesaplanabilir ve bu değer "> PIF" hesaplamasında kullanılır. (b)
 Eğer sadece bir "> PIF" elde edilebiliyorsa, o zaman >1 olan her değer fototoksisiteyi öngörür.. Kimyasalın en yüksek test konsantrasyonuna kadar hiç sitotoksisite göstermemesine bağlı olarak eğer hem EC50 (-UV) hem de EC50 (+UV) hesaplanamazsa bu durum fototoksisite potansiyelin olmadığına işaret eder. Böyle durumlarda, sonucu karakterize etmek için resmi bir "PIF = *1" kullanılır. (c) Eğer sadece bir "PIF = *1" elde edilebiliyorsa, fototoksisite potansiyeli olmadığı öngörülür..  (b)ve (c) durumlarında, in vitro 3T3 NRU fototoksisite testinde elde edilen derişimler fototoksisite potansiyel tahmin edilirken dikkatlice göz önünde bulundurulmalıdır.
Alternatif olarak, fototoksisite potansiyelin tahmin edilmesinde yeni bir model uygulanabilir, bu model EU/COLIPA onay çalışmasının sonuçları kullanılarak geliştirilmiştir (15) ve sonraki çalışmada UV filtreleyen kimyasalların in vitro fototoksisite için kör koşullar altında test edilmiştir (13). Bu model EC50’nin elde edilemediği durumlarda PIF modelinin sınırlamalarının üstesinden gelmektedir. Model, tamamlanmış konsantrasyon-cevap eğrilerinin karşılaştırılmasına dayanan bir ölçüm olan,"Ortalama Foto Etki" (MPE)’yi kullanır. MPE modelinin uygulanması için Humboldt Üniversitesi (Berlin, A) tarafından ücretsiz olarak elde edilebilen özel bir bilgisayar yazılımı geliştirilmiştir.
in vitro 3T3 NRU fototoksisite testindeki bir pozitif sonuç (PIF ≥5 or MPE ≥0.1) test maddesinin fototoksik potansiyeli olduğuna işaret eder. Eğer bu sonuç 10 μg/ml’nin altındaki konsantrasyonlarda elde edilmişse çeşitli in vivomaruz kalma koşullarında test kimyasalı ayrıca fototoksin gibi davranır. Eğer en yüksek test konsantrasyonunda, 100 μg/mL, pozitif bir sonuç elde edilirsezarar veya fototoksik potensiyel değerlendirmesi için daha fazla parametrenin üzerinde durmak gerekebilir. Bunlar arasında kimyasalın derideki nufüz verileri, absorbsiyon verileri ve olası birikmesi veya kimyasalın örneğin insan in vitro cilt modeli gibi alternatif bir teyit testine tabi tutulması bulunmaktadır. in vitro 3T3 NRU fototoksisite testindeki bir negatif sonuç (PIF < 5 veya MPE < 0.1) test maddesinin uygulandığı koşullar altında memeli hücrelerinde fototoksik olmadığına işaret eder. Kimyasalın 100 μg/ml’lik en yüksek konsantrasyona kadar test edildiği durumlarda negatif sonuç kimyasalın fototoksik potansiyeli olmadığına işaret eder ve in vivo fototoksisite olasılığı azdır. Aynı konsantrasyon-toksisite cevabının (EC50+UV ve EC50-UV) daha düşük konsantrasyonlarda elde edildiği durumlarda, verilerin yorumlanması aynı olacaktır. Tam tersine, eğer hiç toksisite yoksa (+UV and -UV) ve sulu çözeltideki çözünürlük 100 μg/ml’den daha az konsantrasyonlarla sınırlıysa, test maddesinin yöntemle uyumluluğu sorgulanmalı ve teyit testinin uygulanması düşünülmelidir (ör. invitro deri modeli veya ex vivo deri modeli veya in vivo test kullanmak).
|