Гейд етмяк лазымдыр ки, биоэен елементлярин даща эениш йайылмасы тяснифатына эюря, бу елементляр 2 група бюлцнцр: 1) макроелементляр (мигдары 0,001%-дян артыг оланлар) вя 2) микроелементляр
Yüklə 3,64 Mb. Pdf görüntüsü
|
|
4.4.3.4. Elektroforez Zülalları fraksiyalaşdırmaq üçün istifadə edilən üsullardan ən əlverişlisi elektroforez hadisəsinə əsaslanır. “Elektroforez” adı altında mayedə olan yüklü hissəciklərin elektrik sahəsi- nin təsiri nəticəsində hərəkəti nəzərdə tutulur. Zülalların elektrik sahəsindəki hərəkətini ilk dəfə 1869-cu ildə F.Reys müşahidə etmişdir. 1937-ci ildə Nobel mükafatı laureatı A.Tizelius məhlulda zülalların elektroforezini müşahidə etməyə imkan verən xüsusi cihaz ixtira etmiş və bu prosesin idarə edilməsi üsulunu işləyib hazırlamışdır. Məlumdur ki, bufer məhlulunda olan yüklü hissəciklərin (o cümlədən zülalların) hərəkət sürəti və istiqaməti onların ion yükündən asılıdır. Müxtəlif zülal növlərinin ion yükləri bir-birindən fərqlən- diyinə görə, onlar elektrik sahəsində müxtəlif sürətlə hərəkət edərək, bir-birin- dən ayrılır. Tizeliusun elektroforez cihazı müxtəlif zülalların elektrik sahəsində bir-birindən fərqlənən sürətlə hərəkət etməsinə əsaslanır. Bu cihazın ilk variantı mayenin tərkibində olan sərbəst zülalların elektroforezi üçün nəzərdə tutul- muşdu. Mayedə sərbəst şəkildə hərəkət edən zülal hissəciklərinin elektroforezi zamanı müxtəlif zülallar arasındakı sərhədlər mühitdə işıq şüalarının sınmasını qeyd edən xüsusi cihazlar (nefelometr, refraktometr) vasitəsilə müəyyənləş- dirilir. Bu zaman optik cihazlar hərəkət edən hissəciklərin müxtəlif qatılığa malik olan bir neçə zonasını qeyd edir. Bu üsulun mənfi cəhətləri müxtəlif fraksiyalar arasında sərhədlərin dəqiq müəyyənləşdirilməsinin çətinlikləri ilə əlaqədardır. Hazırda bu qüsurları aradan qaldırmaq məqsədilə bərk gel mühitində nisbətən yüksək elektrik gərginliyi altında aparılan elektroforezdən daha geniş istifadə edilir. Buna zona elektroforezi deyilir. Zona elektroforezinin sərbəst maye mühitdə aparılan elektroforezə nisbətən üstünlüyü bunlardan ibarətdir: 1) elektroforezin bu növündən istifadə edildikdə mütəhərrik maye mühit kimyəvi cəhətdən neytral olan bərk konsistensiyalı qeyri-mütəhərrik mühit üzrə hərəkət etdirilir, bu isə bufer məhlulunda həll olmuş hissəciklərin temperatur dəyişikliklərindən asılı olan xaotik hərəkətini məhdudlaşdırır; 2) lazım gəldikdə bərk konsistensiyalı mühitin müəyyən his- səsini ayırıb, orada toplanan hər hansı maddəni tədqiq etmək mümkün olur. Zona elektroforezi zamanı neytral daşıyıcı kimi xromatoqrafiya kağızın- dan, asetat-sellülozadan, silikageldən hazırlanmış sütuncuqlardan, sefadeks gelindən və b. materiallardan istifadə etmək olar. Kimyəvi cəhətdən inert olan polimerlərdə aparılan zona elektroforezi müxtəlif maddələri həm ion yüklərinin səviyyəsinə görə, həm də molekul çəkilərinə görə fraksiyalaşdırmağa imkan 110 verir. Bu baxımdan poliakrilamid və aqaroza gellərinin əhəmiyyəti daha böyükdür. Poliakrilamidin əsas üstünlüklərindən biri də bundan ibarətdir ki, onun qatılığını dəyişməklə, istənilən ölçülü məsamələrə malik olan gel hazırlamaq mümkün olur və bu gellə aparılan elektroforez zamanı adsorbsiya və elektroosmos qüvvələrinin tədqiqata təsiri olmur. Elektroforez məqsədilə istifadə edilən poliakrilamid geli hazırlamaq üçün diametri 1 sm 2 -na qədər olan şüşə boruya tərkibində monomer (akrilamid), az miqdarda birləşdirici maddə (bis-N-metilenmetakrilamid) və polimerləşmə reaksiyasının təşəbbüsçüsü (katalizatoru) funksiyasını yerinə yetirən bufer məhlulu doldurulur. Katalizator kimi ammonium-persulfatdan və ya riboflavindən istifadə etmək olar. H 2 C = CH − CONH 2 H 2 C = CH − CONH – CH 2 − NHCO − CH = CH 2 Akrilamid bis-N-metilenmetakrilamid Ammonium-persulfatın katalizatorluğu ilə polimerləşmə reaksiyası adi şəraitdə keçir və otaq temperaturunda saxlanılan qarışıq qısa müddətdən sonra akrilamid gelinə çevrilir. Katalizator kimi riboflavindən istifadə edildikdə, poli- merləşmə reaksiyasının baş verməsi üçün məhlulu lüminessent lampası vasi- təsilə şüalandırmaq lazımdır. Təsvir edilən üsulda pH-ı müxtəlif olan bufer məhlullarından istifadə edilir və akrilamidin müxtəlif qatılıqları vasitəsilə məsamələrinin ölçüləri bir-birindən fərqlənən gellər hazırlanır (bu üsulun müxtəlif variantları haqqında spesifik ədəbiyyatdan məlumat almaq olar). Bu üsul disk-elektroforez adlanır (ingiliscə discontinius – fasiləli). Gel vasitəsilə aparılan elektroforez yüksək effektivliyi ilə fərqlənir. İnsanın qan serumu zülallarının sərbəst maye mühitində elektroforezi zamanı 5, xromatoqrafiya kağızı üzərində aparılan elektroforezi zamanı 6 zülal fraksiyası ayrıldığı halda, nişasta gelində elekroforez edildikdə qan serumunda 10, poliakrilamid gelində isə 18-25 zülal fraksiyası aşkar edilir. Elektroforez prosesinin gedişini müşahidə etmək üçün tədqiq edilən maddələrin qarışığına kimyəvi cəhətdən inert olan (yəni fraksiyalaşdırılan maddələrə kimyəvi təsir göstərməyən) xırdamolekullu boyaq maddələri qatılır. Bu boyaq maddələrinin molekulları fraksiyalaşdırılan maddə molekulları kimi ion yükünə malik olmalı və elektroforez prosesində ən sürətlə hərəkət edən və ilkin olaraq ayrılan zülala nisbətən bir qədər artıq mütəhərriklik göstərməlidir. Bu məqsədlə neytral və qələvi xassəli bufer məhlullarında çox vaxt bromfenol abısından, turş mühitdə isə – yaşıl metil boyağından və ya pironindən istifadə edilir. Boyanmış zona gelin sonuna çatdıqda elektroforezi dayandırırlar. Bundan sonra geli fiksasiya edib, müəyyən müddət ərzində spesifik boyaq məhlulunda saxlayırlar. Zülalla zəngin olan zonalar boyandıqdan sonra boya- ğın artıq hissəsini yuyurlar. Bu zaman geldə müxtəlif ölçülü zolaqlar nəzərə çarpır (şəkil 4.1). Bunlar elektroforez zamanı ayrılan zülal fraksiyalarının yerləşdiyi sahələrə müvafiq gəlir. Disk-elektroforez vasitəsilə ayrılan müxtəlif zülal fraksiyalarının nisbi miqdarı densitometr adlanan cihaz vasitəsilə müəyyənləşdirilir. Bu cihazın iş prinsipi gel üzərində olan zolaqlarda boyanma intensivliyinin müəyyənləşdiril- 111 məsinə əsaslanır. Bəzən yuxarıda göstərilən üsul- lardan heç biri ayrılıqda mürəkkəb tərkibli zülal qarışıqlarının tam frak- siyalaşdırılmasına nail olmağa imkan vermir. Belə hallarda təkrarlanan elektrofezdən istifadə edilir, yəni zü- lal qarışığını ilk dəfə elektroforez etdikdən sonra alınan hər bir zülal zolağını yenidən elektroforez etməklə fraksiyalara ayırırlar. Bu zaman ikinci elektroforez sütuncuğunda müxtəlif zülal növləri ayırd edilir. Bəzən bu yolla bioloji materialın tərkibindən 2000-ə qədər zülal növü ayrılır. Lakin hətta bu üsul da qarışıqda olan bütün zülalların bir-birindən ayrılması üçün kifayət etməyə bilər. Buna görə hazırda elektroforezlə xromatoqrafiyanın əsas prinsiplərini özündə birləşdirən fraksiyalaşdırma üsulları kombinasiyasından geniş istifadə edilir. Yüklə 3,64 Mb. Dostları ilə paylaş:
|