İNŞaat mühendiSLİĞİ anabiLİm dali

Fusarium Türlerinde Trikotesen Üretiminin Durdurulması
Bu çalışmada Fusarium türlerinde trikotesen biyosentezi ile ilişkili tri4 ve tri5 genleri siRNA aracılı mekanizma ile susturuldu. RNAi, F. graminearum 4F ve F. culmorum 9F ve 20F izolatlarında genlerin ekzonik bölgelerine özgün olarak tasarlanan altı siRNA molekülü ile tetiklendi. Bu amaçla, 38 Fusarium izolatında farklı in vitro koşulların tri4 ve tri5 anlatımı üzerindeki etkileri incelendi. pH 5.6 ve 25°C’de üretilen Fusarium kültürleri kontrol grubu olarak kullanıldı. Sıcaklığın trikotesen üretimine etkisi, miselyumun pH değeri 5.6 olan besi ortamında, 8°C ve 15°C’de kültüre edilmesi ile test edildi. pH’nın etkisi ise, Fusarium türlerinin pH değeri 3.0 ve 7.0 olan besi ortamlarında, 25°C’de kültüre edilmesi ile araştırıldı. Trikotesen üretimine etkisi denenen bir diğer parametre ortama H₂O₂ (0.5 mM) eklenmesidir. En yüksek tri4 ve tri5 anlatım düzeyleri kontrol grubunda belirlendi. Taranan 14 izolat arasında en yüksek tri4 ve tri5 geni anlatım düzeyi F. graminearum 4F’de saptandı. En yüksek tri4 anlatımı 24 F. culmorum izolatı arasından 20F’te belirlenirken, maksimum tri5 anlatımı 9F’te bulundu. Dolayısıyla, bu üç izolat RNAi mekanizmasının indüksiyonu için seçildi. Tam boydaki tri4 ve tri5 fragmentleri, özgün siRNA moleküllerini tasarlamak için 4F, 9F ve 20F izolatlarından çoğaltıldı, dizilendi ve CLUSTALW analizine tabi tutuldu. Dizileme sonuçları referans genoma ait tri4/tri5 genleri ile 4F, 9F ve 20F izolatlarına ait gen dizilimleri arasında yüksek düzeyde (%94-99) benzerlik olduğunu ortaya koydu. Bu üç izolatın iki genine ait dizilim bilgileri aksesyon numaraları alınarak (KJ677970, KJ677971, KJ677972, KJ677973, KJ677974 ve KJ677975) veritabanına eklendi. Çalışmada kullanılan siRNA molekülleri bu dizilim bilgilerine göre biyoinformatik araçlarla tasarlandı. Kuramsal olarak belirlenen 60 ekzonik siRNA molekülü arasından tri4 için dört (Tri4E1:5'-ACAATACGGGCGTGAGTCATGTCAA-3', Tri4E2:5'-GAACCCTGAGAGAAGTTGGTGATGT-3', Tri4E3:5'-ACATGCTCCTTGTACTTCAAGTTCT-3', Tri4E4:5'-CATCTTGGAGATCTCCCAGAGAT-3'), tri5 için ise iki siRNA (Tri5E1:5'-AAGCGACTACAGGCTTCCCTCCAAA-3', Tri5E2:5'-CAGGATCTGATGACTACCCTCAATT-3') gen susturma çalışmalarında kullanılmak üzere seçildi. Bu altı çift iplikli siRNA, protoplast kültürlerine tekli ve çoklu olmak üzere tri4 için 30, tri5 için de altı farklı kombinasyonda yardımcı plazmidler (pEGFP75 ve pAN7-1) ile birlikte transfekte edildi. Transfeksiyon etkinliği 36 deneme grubunda 500.00 ile 99.3310.06/5x10⁴ arasında bulundu. Transfektantlar fluoresan mikroskopisi ve spektrofluorimetrik analizle seçildi. Hücrelerde GFP proteininin yayımlandığı fluoresan ışıma spektrofluorimetrik olarak ölçüldü. Transfektantların RFU (relatif fluoresan ünitesi) değerleri 1.37±0.07-2.89±0.06 arasında bulundu. Ayrıca pEGFP75 ve pAN7-1 plazmidlerinin aktarıldığı transfektantların seçiminde PZR da kullanıldı. Bu amaçla pAN7-1 plazmidindeki hph ve pEGFP75 plazmidindeki GFP genlerinin 0.7 kb’lik parçası çoğaltıldı. 30 deneme setinde tri4 geninin %100’e yakın düzeylerde baskılandığı gerçek zamanlı PZR analizi ile gösterildi. Geriye kalan altı deneme grubunda her iki tür için tri5 gen anlatımındaki azalma %65-95 olarak belirlendi. Aynı zamanda, tri4 ve tri5 susturulmuş Fusarium örneklerinde trikotesen biyosentezinin son ürünü olan DON mikotoksininin üretilmediği de ince tabaka kromatografisi ile de gösterildi. Sonuç olarak bu çalışmada tri4 ve tri5 genlerinin trikotesen biyosentez yolağının susturulmasında kullanılabileceği gösterildi. Bununla birlikte tri4 geninin tri5’e göre RNAi için daha kullanışlı bir hedef olabileceği sonucuna varıldı. Fusarium türlerinde siRNA transfeksiyonunun sonucu olarak gözlenen tri4 ve tri5 gen anlatımındaki belirgin düşmenin post-transkripsiyonel düzeyde gerçekleştiği düşünülmektedir. Bu çalışma Fusarium türlerinde siRNA aracılı gen susturma ile ilişkili ilk rapor olması yanı sıra, bitki patojeni olan türler ile mücadelede uygulanabilecek model olması bakımından da büyük önem taşımaktadır.