Mikroorganizmaların mikrobiyal teknoloji açısından önemli olan yüksek molekül ağırlıklı makromolekülleri proteinler ve polisakkaritlerdir.
Her iki tip makromolekülün de mikroorganizmalarca üretimi günümüzde artan bir şekilde devam etmektedir.
Rekombinant DNA teknolojisi ile normalde az miktarda üretilen proteinlerin miktarları artırılmaktadır.
Ticari olarak mikrobiyal üretimi yapılan proteinler iki çeşittir.
Enzimler ve terapötik proteinler.
Enzim uygulaması çok gelişmiştir. 1980’lerin sonundan itibaren Pazar payları 10.000 ton ve 1 milyar $ a ulaşmıştır.
Enzim uygulaması çok gelişmiştir. 1980’lerin sonundan itibaren Pazar payları 10.000 ton ve 1 milyar $ a ulaşmıştır.
Proteinlerin modifikasyonunu içeren rekombinant DNA teknolojisi uygulamalarının enzim üretiminde önemli payı vardır. Örneğin glukoz izomerazın pH optimumunun düşürülmesi yüksek fruktoz şurubu eldesinde önemli olan normal enzimin yol açtığı karamelizasyonu (kahverengileşme) ortadan kaldırmıştır.
Tedavi edici özellikte olan bazı proteinler ve peptidler insan ve hayvanlardan yeteri kadar saflıkta ve yüksek verimlilikte elde edilemezler.
Tedavi edici özellikte olan bazı proteinler ve peptidler insan ve hayvanlardan yeteri kadar saflıkta ve yüksek verimlilikte elde edilemezler.
Bu nedenle rekombinant DNA teknolojisi proteinlerin biyolojik fabrikalar olarak nitelenebilecek bakteriler (en sık kullanılanı E. coli) ve mayalar (en sık kullanılanı Saccharomyces cerevisiae) içinde üretilmelerine olanak vermiştir.
Terapötik proteinlerin sahip olması gereken özellikler şunlardır:
Terapötik proteinlerin sahip olması gereken özellikler şunlardır:
%95’den daha fazla saf olmalıdırlar,
kontaminant DNA 10 pg/doz’dan daha az olmalı,
endotoksinler belirtilen düzeyin altında olmalı,
saflaştırmada kullanılan toksik kimyasallar belirlenen düzeyin altında olmalı,
Polisakkaritler normalde bitkilerden, su yosunlarından elde edilirler.
Polisakkaritler normalde bitkilerden, su yosunlarından elde edilirler.
Bitkiler gibi doğal kaynaklardan doğal olaylara bağlı olarak seneden seneye ürün miktarını etkileyen değişimlere bağlı olan verimlilikte elde edilirler.
Mikroorganizmalar ise sürekli istenen miktarlarda uniform kimyasal ve fiziksel özelliklere sahip olan polisakkaritleri üretebilmektedirler.
Enzimler canlı organizmalarda substratların kimyasal değişimini katalizleyen kompleks protein molekülleridir.
Enzimler in vitro koşullarda da katalitik aktivite gösterdiklerinden, mikroorganizmaların bu proteinleri bol miktarda üretmeleri sonucu izole edilerek çeşitli endüstriyel alanlarda kullanılabilirler.
Enzimlerin bu şekilde endüstriyel süreçlerde kullanılma işlemleri topluca “enzim teknolojisi” olarak adlandırılır.
enzimlerin fermentasyon yoluyla üretimleri (büyük ölçekte üretimi için yapılan besiyeri, ortam koşulları vb. düzeylerdeki optimizasyonlar),
katalitik etkinliğin arttırılması için enzimlerin üç boyutlu yapılarının değiştirilmesi (protein mühendisliği),
izolasyonları ve
immobilizasyonları (enzimlerin çözünmeyen destek materyaller yardımıyla suda çözünmeyen hale getirilmesi) çalışmalarını kapsar.
Enzimler binlerce yıldır bilinçsizce de olsa insanlar tarafından peynir, bira ve ekmek yapımında kullanılmışlardır.
Enzimler binlerce yıldır bilinçsizce de olsa insanlar tarafından peynir, bira ve ekmek yapımında kullanılmışlardır.
Günümüzde enzimlerin kullanıldığı endüstriyel alanlar oldukça çeşitlenmiş ve mikroorganizmalar kullanılarak her yıl üretilen saf enzimlerin miktarları 500 ton gibi değerlere ulaşmıştır.
2000 yılında endüstriyel enzimler için pazardaki toplam değer yaklaşık 2 milyar dolardır ve büyüme hızı yılda % 5-10’dur.
ŞEKERLEME B.subtulis α-amilazı Tatlandırıcı olarak glukoz şurubu eldesi Nişasta Dekstrin
A. niger α-amilazı
Immobilize olarak sürekli kullanım
Tarım ve orman Ligninaz Odunsu atıklardaki lignoselülozik yapıdaki selülozun hayvanların kullanmasını sağlamak ve endüstriyel organik substrat olarak kullanmak
Tarım ve orman Ligninaz Odunsu atıklardaki lignoselülozik yapıdaki selülozun hayvanların kullanmasını sağlamak ve endüstriyel organik substrat olarak kullanmak
Deri Mikrobiyal tripsin Deriden tüy veya kılların uzaklaştırılması.
Tıp Tripsin Kan pıhtılarının eritilmesinde ve yaraların temizlenmesi.
Çeşitli enzimler Labaratuvar tanılarında.
Endüstriyel enzim marketinin yaklaşık 2/3 nü kapsayan deterjan katkısı olan enzimlerin pazardaki payı 2002 yılı için 980 milyon dolardır.
Endüstriyel enzim marketinin yaklaşık 2/3 nü kapsayan deterjan katkısı olan enzimlerin pazardaki payı 2002 yılı için 980 milyon dolardır.
Nişasta işleme endüstrisi ikinci büyük pazarı oluşturmaktadır. Gıda katkıları ve gıda işlenmesinde kullanılan endüstriyel enzimlerin pazardaki değeri 700 milyon dolardır (2002).
Endüstriyel enzimler için bir diğer önemli alan hayvan yemlerine katılan enzimlerdir. Yaklaşık 200 milyon dolarlık (2002) bir değere sahip olan enzimler yemlerde parçalama yaparak sindirimi kolaylaştırmaktadır.
ENZİM KULLANIM ALANI MİKROORGANİZMA
ENZİM KULLANIM ALANI MİKROORGANİZMA
α-amilaz Maltoz ve dektrinin yıkılması Bacillus subtilis
Leke çıkarıcı Aspergillus oryzae
Unun zenginleştirilmesi B. licheniformis
Glukoz şurubu
β-glucanaz β-glukanın parçalanması yoluyla A. oryzae
biranın berraklaştırılması. B.subtilis
Katalaz İçeceklerin buzulmasını önlemek için A. Niger
Mikrobiyal yolla enzim üretiminin ilk aşaması uygun katalitik özgüllük ve istenilen fiziksel özellikleri taşıyan mikroorganizmanın seçimi ile başlar.
Mikroorganizma düzeyindeki modifikasyonlar genellikle hücre başına üretilen enzim miktarının artırılmasına yöneliktir. Ayrıca kültür ortamı ve fermentasyon koşulları da enzim üretim maliyetini düşürmeye yönelik olan önemli parametrelerdendir.
Suş seçiminde uygun fiziksel özellikler taşıyan enzimlerin seçimi genellikle bir organizmanın optimum üreme koşulları ile enzim özellikleri arasında pozitif korelasyonun varlığı esasına dayanır. Örneğin üreme temparatürü ile hücredışı proteazlarınstabilitesi arasında pozitif bir ilişki vardır. Hücreiçi enzimler üzerine çevresel koşulların etkisi söz konusu değildir.
Farklı mikroorganizmalar tarafından aynı reaksiyonu katalizleyen enzimlere izofonksiyonel enzimler denir.
Farklı mikroorganizmalar tarafından aynı reaksiyonu katalizleyen enzimlere izofonksiyonel enzimler denir.
Bu izofonksiyonel enzimler farklı pH optimumları gibi değişik özellikler taşırlar. Bu farklı özelliklerden istenenler mikroorganizma seçiminde kriter olur.
İyi bir endüstriyel ırk enzimi yüksek konsantrasyonda üretmelidir.
İyi bir endüstriyel ırk enzimi yüksek konsantrasyonda üretmelidir.
Kural olarak yabani tiplerin enzim üretimi ticari kullanım için yeterli değildir. Bu durum katabolit represyon nedeniyledir.
Glukoz gibi karbon kaynaklarının varlığında birçok parçalayıcı enzimin sentezi baskılanır.
Hücreiçi enzimlere göre hücredışı enzimlerin hücre dışına salgılanması için birden fazla genin ürününe gereksinim duyulması, üzerinde durulması gereken başka bir sorundur.
Hücreiçi enzimlere göre hücredışı enzimlerin hücre dışına salgılanması için birden fazla genin ürününe gereksinim duyulması, üzerinde durulması gereken başka bir sorundur.
Çoğunlukla hücredışı enzimlerin öncülleri olan polipeptidler hücre içinde hücre zarına yakın olarak sentezlenirler. Ve daha sonra posttranslasyonel modifikasyonlarla (proteolitik kesimler, funguslarda glikolizasyon) hücredışı hale getirilirler.
Koji prosesi (Solid-state fermentasyon): Klasik yöntemdir.
Koji prosesi (Solid-state fermentasyon): Klasik yöntemdir.
Mikroorganizmalar katı ya da yarı katı tavalardaki besiyerlerinde üretilirler. Bu katı substratlar buğday kepeği, buğday sapı, pirinç kabuğu, arpa, suyu çıkarılmış şeker kamışı vb. dir.
Çoğunlukla bu katı substratlar proteazlar, lipazlar, selülazlar ve oksidazlar gibi enzimlerin üretiminde funguslar için kullanılır.
Bu tip fermentasyonda kontaminasyondan korunmak, uniform temperatür, havalandırma ve nemlendirme sağlamak zordur.
Fermentör kullanımı: Modern yöntemdir. Bu fermentörlerin kullanımı yukarıda sayılan olumsuzlukları ortadan kaldırır. Mikrobiyal enzim üretiminde başlıca 4 çeşit fermentör kullanılır.
Fermentör kullanımı: Modern yöntemdir. Bu fermentörlerin kullanımı yukarıda sayılan olumsuzlukları ortadan kaldırır. Mikrobiyal enzim üretiminde başlıca 4 çeşit fermentör kullanılır.
Karıştırıcılı tank tipi fermentör,
bubble column,
air lift,
packed bed
Bir enzim fermentasyonu prosesinin %50-80’i substrat harcamasıdır.
Bir enzim fermentasyonu prosesinin %50-80’i substrat harcamasıdır.
Bu nedenle de mikroorganizmanın ucuz besiyerlerinde hızlı bir biçimde üremesi önemlidir.
Ucuz besiyerindeki başlıca karbohidratlar;
melas, arpa, mısır, buğday, hidrolize nişasta ve laktoz,
maltoz, az miktarda glukoz ve esas olarak da dekstrinler oluşturulur.
Bu işlem nişastanın vizkozitesini düşürür ve çözünürlüğünü artırır.
Glukoamilazlar ise şekerlerin oluşumuna yol açar. Bu olay ise sakkarifikasyon (şekerlendirme) adını alır.
Aspergillus niger glukoamilazı nişasta ve dekstrinlerde α,1-4 glikozit bağlarına etki ederek zincir ucundan glukoz monomerlerini birer birer ayırırlar.
Aspergillus niger glukoamilazı nişasta ve dekstrinlerde α,1-4 glikozit bağlarına etki ederek zincir ucundan glukoz monomerlerini birer birer ayırırlar.
α,1-6 glikozit bağlarına da yavaşça etki ederek dallanmaları kırarlar.
Bacillus pullulonazı ise α,1-6 glikozit bağlarını hızlı bir biçimde kırarlar.
Bakteriyal glukoz izomeraz ile D-glukoz çok tatlı olan D-fruktoza çevrilir. Normalde reaksiyon denge durumundadır ve glukoz ile fruktozun eşit karışımı elde edilir.
Dünya üzerinde süt endüstrisinde, peynir yapımı için yılda 100 milyon $ değerinde kimozin kullanılır.
Dünya üzerinde süt endüstrisinde, peynir yapımı için yılda 100 milyon $ değerinde kimozin kullanılır.
Bu geniş kullanımı nedeniyle büyük ölçekte rekombinant kimozin üretimi yoluna gidilmiş ve inek kimozini E. coli’de klonlanmıştır.
Bu rekombinant kimozin Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA)’nin 1990’da insan tüketimi için onayladığı ilk genetik mühendisliği ürünü olmuştur.
İnek kimozini E. coli’nin dışında daha sonra çeşitli mayalarda da klonlanmış ve Trichoderma reesei’de aktif ürün eldesi arttırılmıştır.
α -amilazlar nişasta endüstrisinin yanı sıra çeşitli endüstrilerde de kullanılır.
α -amilazlar nişasta endüstrisinin yanı sıra çeşitli endüstrilerde de kullanılır.
Ekmek yapımında, maya tarafından kullanılmak üzere nişastanın glukoza dönüştürülmesinde kullanılır.
Biracılıkta arpa tanelerinden elde edilen maltın öğütülüp su ile karıştırılmasından sonra ilave edilen α -amilazlarla alkolik fermentasyon için mayanın kullanacağı şekerler oluşur.
Tekstilde dokuma ipliklerinin kopmasının engellemek için sertleştirilmelerinde (haşıllama) kullanılan α -amilaz etkisinde bırakılan nişastanın dokuma sonunda ortadan kaldırılmasında (haşıl kaldırma) kullanılır.
Kağıt endüstrisinde ise iyi kalite kağıt (pürüzsüz yüzeyli) eldesi için nişasta banyosuna sokulan kağıt üzerindeki fazla nişastanın uzaklaştırılmasında α -amilazlar kullanılır.
Deterjan endüstrisinde enzimler önemli yer tutarlar.
Yine bulaşık deterjanlarında kullanılan -amilazlar nişastalı artıkların uzaklaştırılması için kullanılmaktadırlar.
Proteolitik bir enzim olan subtilizin Bacillus’tan elde edilir ve 65C’ın üzerindeki sıcaklıklarda bile etkindir.
Proteolitik bir enzim olan subtilizin Bacillus’tan elde edilir ve 65C’ın üzerindeki sıcaklıklarda bile etkindir.
Bu enzimin termostabilitesini arttırmak için genetik mühendisliği çalışmaları yapılmış ve protein molekülünün 218. amino asidi olan aspartik asit, serin ile değiştirilmiştir.
Yine 104. amino asit olan tirozin, fenil alanine dönüştürülerek pH 11’de aktif olan subtilizin elde edilmiştir.
Deterjan endüstrisinde yağlı kirlerin uzaklaştırılması için kullanılan lipazların büyük ölçekte üretilmesi için bir mantar olan Humicola’nın alkali pH’da çalışan ancak üretimi az olan lipaz enzimini kodlayan gen, fermentörde kolaylıkla üreyen Aspergillus oryzae’ye genetik mühendisliği teknikleriyle aktarılmış ve büyük ölçekte lipaz elde edilmiştir.
Enzimlerin çözünmeyen destek görevi gören materyaller (matriksler) yardımıyla suda çözünmeyen hale getirilmeleri immobilizasyondur.
Enzimlerin çözünmeyen destek görevi gören materyaller (matriksler) yardımıyla suda çözünmeyen hale getirilmeleri immobilizasyondur.
Mikrobiyal hücreler de enzimler gibi immobilize edilir.
Tüm hücrelerin immobilize edilmesi saf enzimin gerekli olmadığı proseslerde kullanılan ucuz ve hızlı bir metoddur.
İmmobilize hücreler atıkların kullanımında, azot fiksasyonunda, steroid sentezinde, yarı sentetik antibiyotikler ve diğer tıbbi ürünlerin eldesinde kullanılır.
Kovalent bağlama: Enzimler kimyasal olarak kovalent bağlarla selüloz, sefadeks, agaroz, poliakrilamid, porlu seramik gibi suda çözünmeyen taşıyıcılara bağlanırlar.
Kovalent bağlama: Enzimler kimyasal olarak kovalent bağlarla selüloz, sefadeks, agaroz, poliakrilamid, porlu seramik gibi suda çözünmeyen taşıyıcılara bağlanırlar.
Çapraz bağlama: Enzimler glutaraldehit, alifatik diaminler gibi bifonksiyonel reaktiflerle çapraz bağlanırlar. Bu reaktifler enzim molekülleri arasında bağ oluştururlar. Glutaraldehit enzim moleküllerinin amino gruplarından, diaminler ise karboksil gruplarından çapraz bağlarlar.
Adsorbsiyon: Enzim moleküllerinin taşıyıcıların yüzeyine adsorblanmaları esasına dayanır. Kolay bir yöntemdir. Agaroz, sefadeks türevleri, selüloz türevleri, metal tuzları ve mineraller adsorban olarak kullanılırlar.
Adsorbsiyon: Enzim moleküllerinin taşıyıcıların yüzeyine adsorblanmaları esasına dayanır. Kolay bir yöntemdir. Agaroz, sefadeks türevleri, selüloz türevleri, metal tuzları ve mineraller adsorban olarak kullanılırlar.
Tutuklama: Enzimler yapay ya da doğal polimer kafesleri içinde tutuklanırlar. Polimer kafesler içine substrat girer ve ürün dışarı çıkar. Çapraz bağlı poliakrilamid jeller, Ca alginat, kappa karragenan bu polimerlerin örneklerindendir.
Kapsülleme: Enzimler çeşitli tipteki membranlar içine alınırlar. Bu membranlar yarı geçirgendir. Düşük molekül ağırlıklı substratı ve molekülleri geçirirler. Hegza metilen diamin mikrokapsüllemede kullanılar.
Ayrıca bu yöntemlerin kombinasyonları da, tutuklama-çapraz bağlama, kapsülleme-çapraz bağlama gibi, enzim immobilizasyonunda kullanılır.
Enzimler tekrar tekrar kullanılırlar. Özellikle üretimi zor ve pahalı enzimler için bu önemlidir.
Enzimler tekrar tekrar kullanılırlar. Özellikle üretimi zor ve pahalı enzimler için bu önemlidir.
Ürün enzimle kontamine olmaz, çünkü enzim matrikste tutulur.
Matriks enzimi fiziksel bir bariyer olarak koruduğundan, enzim ekstrem pH ve temparatür gibi etkilere dayanıklı hale gelir.
Sürekli fermentasyonlar için enzimi daha kullanışlı hale getirir.
İmmobilize enzimler çok daha doğru bir şekilde kontrol edilirler.
İmmobilize hücrelerle bir çok enzim de immobilize olacağından aynı anda birden fazla reaksiyon gerçekleşebilir.
Biyosferde en fazla bulunan polisakkaritler
Biyosferde en fazla bulunan polisakkaritler
Uygun kültürleme koşullarında birçok bakteri türü yüksek molekül ağırlıklı mukoid maddeler salgılarlar.
Uygun kültürleme koşullarında birçok bakteri türü yüksek molekül ağırlıklı mukoid maddeler salgılarlar.
Bu vizkoz maddeler hücre çeperine bağlı kalırlarsa kapsül adını alırlar.
Bu yapılar bakteriyi fagositozdan, immun sistemin uyarılmasıyla antikor oluşumundan da korurlar.
Ayrıca hücrenin su kaybını da engellerler.
Toprak, kaya gibi çeşitli yüzeylerde tutunmayı sağlarlar. Bu şekilde de bitki patojeni bakterilerin konak bitki yüzeyine tutunmasında etkili olurlar.
Günümüzde bitkiler ve yosunlar yerine mikroorganizmalardan polisakkarit üretimi gittikçe artmaktadır.
Acetobacter türleri, Leuconostoc mesenteroides ve Streptococcus mutantları tarafından üretilirler.
Ticari olarak Leuconostoc mesenteroides ‘in inorganik fosfat, organik azot ve sukroz içeren besiyerinde kesikli fermentasyonu ile üretilir.
Sukrozdan dekstran sukraz enzimi ile glukozlar dekstran halinde polimerize edilirken fruktozlar serbest kalır.
Kan plazması yerine 1000 ton/yıl, kromatografik ayrımlar için 2000 ton/yıl kullanımı vardır.
Alginatlar:Pseudomdomonas aeroginosa , Azotobacter vinelandii tarafından üretilen alginatlar mannuronik asit ve glukuronik asitlerin tuz içeren polimerleridir.
Alginatlar:Pseudomdomonas aeroginosa , Azotobacter vinelandii tarafından üretilen alginatlar mannuronik asit ve glukuronik asitlerin tuz içeren polimerleridir.
Bakteri ve yosunlarca üretilirler. Yılda 25.000 ton üretilen alginatlar besin jölesi olark kullanılırlar.
Curdlan:Alcaligenes faecalis ‘in ürettiği iki çeşit beta-1,3 glukandan biridir. Diğeri ise succinoglukandır. Succinoglukan %10 suksinik asit ve galaktoz içerirken curdlan sadece glukoz polimeridir.
En fazla tüketilen bakteriyal polisakkarittir.
En fazla tüketilen bakteriyal polisakkarittir.
Xanthomonas campestris tarafından üretildiği 1950’lerde saptandıktan sonra, 1964’de endüstriyel boyutlarda üretilmeye başlanmıştır.
1969’da ise besinlerde kullanımına izin verilmiştir.
Ksantan stabilize edici, kalınlaştırıcı, jelleştirici ajan olarak sos, şurup, tatlı, dondurma, peynir yapımı için gıda endüstrisinde yaygın bir kullanıma sahiptir.
Gıdanın dışında boya, kağıt, seramik, endüstrilerinde, insektisit spreylerinde ve patlayıcı, deterjan, deodorantlarda jelleştirici olarak da kullanımı vardır.
Ksantan reçinesinin primer yapısı β-1,4 glikozid bağlarıyla bağlı glukoz polimeri oluşturur.
Ksantan reçinesinin primer yapısı β-1,4 glikozid bağlarıyla bağlı glukoz polimeri oluşturur.
Endüstriyel ksantan reçinesi üretimi aerobik kesikli fermentasyonla, glukoz, sukroz, nişasta içeren besiyerinde yapılır.
Yüksek verim azot kaynağı kısıtlaması ile elde edilir.
Sıcaklık üretimi etkileyen bir diğer faktördür. Hücreler 24-27oC’da ürerlerken, fazla miktarda ksantan üretimi için gerekli sıcaklık 30-33oC’dır. Bu nedenle fermentasyon 28oC ‘da yapılır.
Gellan:Pseudomonas elodea tarafından üretilir. Son yıllarda yarı tropik ağaçların doğal ürünü olan Guar sakızının yerini alan bakteriyal polisakkarittir. Besin endüstrisinde yılda 60.000 ton kullanılır.
Gellan:Pseudomonas elodea tarafından üretilir. Son yıllarda yarı tropik ağaçların doğal ürünü olan Guar sakızının yerini alan bakteriyal polisakkarittir. Besin endüstrisinde yılda 60.000 ton kullanılır.
Scleroglukan: Glukoz monomerlerinin β-1,3 nadirende 1,6 glikozidik bağ ile oluşturdukları polimerdir. Bir fungus olan Sclerotium glutanicum tarafından üretilir. Besin endüstrisinde ve suyun akışkanlığını değiştirerek petrolün geri kazanılmasında kullanılır.
Pullulan: α-1,4 ve nadiren α -1,6 glikozidik bağ oluşumu ile meydana gelen bir glukandır. Aebasidium pullulans tarafından %5’lik glukoz ortamında %70 verimle fermentasyonla üretilir.
Birçok bakteri besin bakımından dengesiz bir ortamda üretildikleri zaman fazla miktarda poliester yapıda maddeler üretirler.
Birçok bakteri besin bakımından dengesiz bir ortamda üretildikleri zaman fazla miktarda poliester yapıda maddeler üretirler.
Bu maddelerin tipi organizmanın genotipine ve sınırlı olan besin kaynağına bağlı olarak değişebilir.
Eğer karbonun azota oranı yüksek ise ve azot veya oksijen sınırlı ise birçok bakteri glikojen ve/veya alifatik poliesterler, poli-3-hidroksialkanatlar üretirler.
Poli-3-hidroksialkanatlar termoplastik (ısı ile şekil verilebilen) maddelerdir. Termoplastik polimerler ısıyla erirler, fakat soğutulduklarında tekrar sertleşirler.
Polietilen, polipropilen, polivinil klorit, polisteren, polikarbonat ve naylon bilinen termoplastik materyallerdir.
Plastik objeler günlük yaşantımızda yüzlerce amaç için kullandığımız bir materyallerdir.
