FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

Tavsiye Edilen Türlerin Kültürü ve Kullanımı Hakkında Özel Tavsiyeler
PseudokirchneriellasubcapitataveDesmodesmussubspicatus
Bu yeşil algleri, çeşitli kültür ortamında elde etmek genellikle kolaydır. Uygun ortam hakkında bilgi kültür koleksiyonlarında mevcuttur. Hücreler normal olarak tek ve ayrı dururlar ve hücre yoğunluğu ölçümleri, elektronik tane sayacı ya da mikroskop kullanarak kolay bir şekilde yürütülebilir.
Anabaena flos-aquae
Stok kültürü korumak için çeşitli büyüme ortamları kullanılabilir. Özellikle dikkat edilmesi gereken, yenileme esnasında seri kültürün logaritmik büyüme fazını geçirmesini engellemektedir, çünkü bu noktada geri kazanım zor olur.
Anabaena flos-aquae, iç içe geçmiş hücre zincirlerinin birikimi şeklinde gelişir. Bu birikimin boyutu, kültür koşullarına göre çeşitlilik gösterir. Biyokütle tayini için mikroskop sayımı ya da elektronik tane sayacı kullanıldığında bu birikimleri parçalamak gerekli olabilir.
Farklı çıkan sayım sonuçlarını azaltmak amacıyla zincirleri parçalamak için alt numunelere sonikasyon uygulanabilir. Zincirleri daha kısa boyutlara parçalamak için gerekenden fazla sonikasyon hücreleri yok edebilir. Sonikasyon şiddeti ve süresi, her muamele için özdeş olmalıdır.
Değişkenliğin telafi edilmesine yardımcı olmak için hemositometrede yeterli alan (en az 400 hücre) hesaplanır. Bu, mikroskopik yoğunluk tayininin güvenirliliğini geliştirecektir.
Hücre zincirleri sonikasyonla dikkatlice parçalandıktan sonra elektronik tane sayacı ile toplam Anabaena hücre hacmi tayini yapılabilir. Hücrelerin bozulmasından kaçınmak için sonikasyonenerjisi ayarlanmalıdır.

Test kaplarını aşılamada kullanılan alg süspansiyonunun iyi karışmış ve homojen olmasını sağlamak için vorteks karıştırıcı veya benzer uygun bir yöntem kullanılır.

Test kapları, dairesel veya git-gel hareketi ile yaklaşık 150 devir/dakikada çalıştırılan çalkalayıcıya yerleştirilir. Alternatif olarak, Anabaena’nın yığınlaşma eğilimini azaltmak için kesikli çalkalama kullanılabilir. Eğer yığınlaşma olursa biyokütle ölçümleri için önlem olarak temsili numune alınmalıdır. Numune almadan önce alg kümelerini ayırmak için kuvvetli çalkalama gerekli olabilir.
Synechococcus leopoliensis.
Stok kültürü korumak için çeşitli büyüme ortamı kullanılabilir. Uygun ortam hakkında bilgi kültür koleksiyonlarında mevcuttur.
Synechococcus leopoliensis, tek ve ayrık çubuk şekilli hücreler olarak yetişir. Biyokütle ölçümleri için mikroskop sayımının kullanımını zorlaştıran hücreler oldukça küçüktür. Yaklaşık olarak 1 µm’ye kadar tane hesaplaması için donatılmış olan elektronik tane sayaçları kullanışlıdır. İn vitroflorimetrik ölçümler de uygulanabilir.
Navicula pelliculosa
Stok kültürü korumak için çeşitli büyüme ortamı, kullanılabilir. Uygun ortam hakkında bilgi kültür koleksiyonlarında mevcuttur. Ortam içerisinde silikatın gerek olduğu dikkate alınır.
Navicula pelliculosa, belirli büyüme koşulları altında kümelenme oluşturabilir. Lipid üretiminden dolayı alg hücreleri bazen yüzey katmanında birikme eğiliminde olurlar. Bu koşullar altında temsili numuneler elde etmek amacıyla biyokütle tayini için alt numuneler alındığında özel ölçümler yapılmalıdır. Örneğin vorteks karıştırıcı kullanarak kuvvetli çalkalama gerekli olabilir.

Ek-II
Büyüme ortamı
Aşağıdaki iki büyüme ortamından biri kullanılabilir:
OECD ortamı: OECD TG 201 orijinal ortamı, ISO 8692 uyarınca

ASTM uyarınca US. EPA ortamı AAP.

Bu ortamlar hazırlanırken, tepken ya da analitik saflıktaki kimyasallar kullanılmalı ve su deiyonize edilmelidir.
AAP-ortam (US. EPA) ve OECD TG 201 ortam bileşimi

Bileşen	US EPA		OECD
	mg/l	^mM	mg/l	mM
^NaHCO3	15,0	0,179	50,0	0,595
^NaNO3	25,5	0,300
^NH4^Cl			15,0	0,280
^MgCl2^∙6(H2^O)	12,16	0,0598	12,0	0,0590
^CaCl2^∙2(H2^O)	4,41	0,0300	18,0	0,122
^MgSO4^∙7(H2^O)	14,6	0,0592	15,0	0,0609
^K2^HPO4	1,044	0,00599
^KH2^PO4			1,60	0,00919
^FeCl3^∙6(H2^O)	0,160	0,000591	0,0640	0,000237
^Na2^EDTA∙2(H2^O)	0,300	0,000806	0,100	0,000269 (*)
^H3^BO3	0,186	0,00300	0,185	0,00299
^MnCl2^∙4(H2^O)	0,415	0,00201	0,415	0,00210
^ZnCl2	0,00327	0,000024	0,00300	0,0000220
^CoCl2^∙6(H2^O)	0,00143	0,000006	0,00150	0,00000630
^Na2^MoO4^∙2(H2^O)	0,00726	0,000030	0,00700	0,0000289
^CuCl2^.2(H2^O)	0,000012	0,00000007	0,00001	0,00000006
^pH	7,5		8,1

(*) EDTA demir molar oranıbirden çok az yüksek olabilir. Bu, demir çökelmesini korur ve aynı zamanda ağır metal iyonlarının şelatlanmasını en azaindirir.
DiatomeNaviculapelliculosa ile test içerisinde 1,4 mg Si/l elde etmek için her iki ortam, Na₂SiO₃∙9H₂0 ile desteklenmelidir.
Ortam pH’ı, ortam karbonat sistemi ile atmosferik havada CO₂ kısmi basınç arasında denge durumunda iken elde edilir. 25 °C’de pH ve molar bikarbonat konsantrasyonu arasındaki ilişki:
PH_eq = 11,30 + log [HCO₃]

15 mg NaHCO₃, pH_eq= 7,5 (U.S. EPA ortamı) ile ve 50 mg NaHCO₃/l, pH_eq = 8,1 (OECD ortamı) ile.

Test ortamının element bileşimi

Element	EPA	OECD
	mg/l	mg/l
C	2,144	7,148
N	4,202	3,927
P	0,186	0,285
K	0,469	0,459
Na	11,044	13,704
Ca	1,202	4,905
Mg	2,909	2,913
Fe	0,033	0,017
Mn	0,115	0,115

OECD ortamı hazırlığı

Besin	Stok çözeltideki konsantrasyon
Stok çözelti 1: makrobesinler
NH4Cl MgCl2∙6H2O CaCl2∙2H2O MgSO4∙7H2O KH2PO4	1,5 g∙l^–1 1,2 g∙l^–1 1,8 g∙l^–1 1,5 g∙l^–1 0,16 g∙l^–1
Stok çözelti 2: demir
FeCl3∙6H2O Na2EDTA∙2H2O	64 mg∙l^–1 100 mg∙l^-1
Stok çözelti 3: eser elementler
H3BO3 MnCl2∙4H2O ZnCl2 CoCl2∙6H2O CuCl2∙2H2O Na2MoO4∙2H2O	185 mg∙l^–1 415 mg∙l^–1 3 mg∙l^–1 1,5 mg∙l^–1 0,01 mg∙l^–1 7 mg∙l^-1
Stok çözelti 4: bikarbonat
NaHCO3 Na2SiO3.9H2O	50 g∙l^–1

Stok çözeltiler, membranfiltrasyon (ortalama gözenek çapı 0,2 µm) ya da otoklav (120 °C, 15 dak.) ile sterilize edilir. Çözeltiler 4 °C’de karanlıkta saklanır.
Stok çözeltiler 2 ve 4 otoklava konulmaz, fakat membranfiltrasyonlasterilize edilir.
Suya uygun hacimde stok çözelti 1-4 eklenerek bir büyüme ortamı hazırlanır.
500 ml steril suya aşağıdakiler eklenir:

— 10 ml Stok çözelti 1

— 1 ml Stok çözelti 2

— 1 ml Stok çözelti 3

— 1 ml Stok çözelti 4
Karışım, steril su ile 1000 ml’ye tamamlanır.
Ortamın atmosferik CO₂ ile dengelenmesi için yeteri kadar beklenir, gerekirse filtrelenmiş steril hava ile birkaç saat kabarcıklanma yapılır.
AAP ortamının hazırlanması
A1.1. A1.2.1-A1.2.7 içindeki her stok çözeltinin 1 ml’si, yaklaşık 900 ml deiyonize edilmiş ya da damıtılmış suya eklenir ve daha sonra 1 L’ye seyreltilir.
A1.2. Makrobesin stok çözeltileri, aşağıdakilerin 500 ml deiyonize edilmiş ya da damıtılmış suda çözündürülmesi ile hazırlanır.

A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3, ve A1.2.4 reaktifleri bir stok çözeltisi içerisinde birleştirilebilir.

A1.2.1. NaNO₃—12,750 gr.

A1.2.2. MgCl₂∙6H₂O—6,082 gr.

A1.2.3. CaCl₂∙2H₂O—2,205 gr.

A1.2.4. Mikrobesin stok çözeltisi—(bkz A1.3).

A1.2.5. MgSO₄∙7H₂O—7,350 gr.

A1.2.6. K₂HPO₄—0,522 gr.

A1.2.7. NaHCO₃—7,500 gr.

A1.2.8. Na₂SiO₃∙9H₂O—Bakınız Not A1.1.

Not - A1.1 Sadece diatom test türleri için kullanılır. Doğrudan (202,4 mg) ya da ortam içinde 20 mg/L Si final konsantrasyonunu sağlamakiçin stok çözelti yoluyla eklenebilir.
A1.3. Mikrobesin stok çözelti, aşağıdaki bileşiklerin 500 ml deiyonize veya damıtılmış suda çözündürülmesi ile hazırlanır:

A1.3.1. H₃BO₃—92,760 mg.

A1.3.2. MnCl₂∙4H₂O–207,690 mg.

A1.3.3. ZnCl₂—1,635 mg.

A1.3.4. FeCl₃∙6H₂O—79,880 mg.

A1.3.5. CoCl₂∙6H₂O—0,714 mg.

A1.3.6. Na₂MoO₄∙2H₂O—3,630 mg.

A1.3.7. CuCl₂∙2H₂O—0,006 mg.

A1.3.8. Na₂EDTA∙2H₂O—150,000 mg.

[Disodyum (Etilen dinitrilo) tetra asetat].

A1.3.9. Na₂SeO₄∙5H₂O—0,005 mg. Bakınız Not A1.2.

Not - A1.2 Sadece diatom türlerin stok kültürleri için ortam içerisinde kullanılır.

A1.4. pH, 0,1 N ya da 1,0 N NaOH veya HCl ile 7,5 ± 0,1’e ayarlanır.

A1.5. Tane sayacı kullanılacak ise 0,22-μm filtre; kullanılmayacak ise 0,45-μm filtre ile ortam, steril kap içine filtre edilir.

A1.6. Ortam, kullanılana kadar yaklaşık 4 °C’de karanlıkta saklanır.
Ek-III
Kültür algi için prosedür örneği
Genel gözlemler
Aşağıdaki prosedüre dayanan kültürün amacı toksisite testleri için alg kültürlerini sağlamaktır.
Alg kültürlerine bakteri bulaşmamasını garanti altına almak için uygun yöntemler kullanılmalıdır. Saf kültürler istenilir olabilir fakat tek alg kültürleri belirlenmeli ve kullanılmalıdır.
Bütün faaliyetler, bakteri ve diğer alg ile kirlenmeyiönlemek amacıyla steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
Ekipman ve materyaller
Bakınız Test Yöntemi - Düzenekler.
Alg kültürleri elde etmek için prosedürler
Besin çözeltilerinin hazırlanması (ortam):
Ortamın bütün besin tuzları, konsantre edilmiş stok çözeltiler olarak hazırlanır ve karanlık ve soğuk bir ortamda saklanır. Bu çözeltiler, filtrasyon ve otoklav ile steril hale getirilebilir.
Bulaşma olmamasına dikkat ederek doğru stok çözelti miktarını, damıtılmış steril su içerisine ekleyerek ortam hazırlanır. Katı ortam için agarın %0,8’i eklenir.
Stok kültür:
Stok kültürler, başlangıç test materyali olarak kullanılmak üzere düzenli olarak taze ortama transfer edilen küçük alg kültürleridir. Eğer kültürler düzenli olarak kullanılmaz ise eğimli agar tüplerden dışa doğru çizgi oluştururlar. Bunlar, en az iki ayda bir taze ortama transfer edilir.
Stok kültürler, uygun ortam içeren (hacmi yaklaşık 100 ml) erlen içinde yetişirler. Alg, sürekli ışıklandırma ile 20 °C’de inkübe edildiğinde, haftalık transfer gerekir.
Transfer esnasında bir miktar ‘yaşlı’ kültür, steril pipet ile temiz ortam şişesine transfer edilir, bu sayede hızla büyüyen türlerdeki başlangıç konsantrasyon, yaşlı kültürdekinden yaklaşık 100 kat daha küçük olur.
Türlerin büyüme hızı, büyüme eğrisinden belirlenebilir. Eğer bu bilinir ise, hangi yoğunluktaki kültürün yeni ortama transfer edilebileceğini tahmin etmek mümkündür. Bu, kültür ölü faza ulaşmadan önce gerçekleştirilmelidir.
Ön-kültür:
Ön-kültür, test kültürlerinin aşılanması için uygun alg miktarını vermeyi amaçlar. Ön-kültür, test koşulları altında inkübe edilir ve normal olarak 2 ila 4 günlük inkübasyon süresinden sonra üssel büyüme sırasında kullanılır. Alg kültürleri şekil bozuklukları gösterdiğinde ve anormal hücreler içerdiğinde, atılmalıdır.

Ek-IV
Doğrusal olmayan bağlanımlı veri analizi
Genel değerlendirmeler
Alg testlerindeki ve diğer mikrobiyal büyüme testlerindeki tepki; eğer büyüme hızı kullanılır ise proses hızıdır ve eğer biyokütle seçilir ise biyokütlenin zamana karşı integralidir. Biyokütle büyümesindeki tepki doğası gereği sürekli ya da metrik değişkendir. Alg testlerindeki birincil belirleme faktörü olarak ışık ve sıcaklık ile empoze edilmiş koşullar için maksimum tepki gösteren maruz kalmamış tekrar kontrollerinin ilgili ortalama tepkisi için her ikisine de başvurulur. Test sistemi dağıtılır ve homojen hale getirilir ve biyokütle, hücreleri ayrı değerlendirmeden bütün olarak gözden geçirilebilir. Bu sistem gibi tepki çeşidinin varyans dağılımı, ancak deneysel faktörler ile ilgilidir (genellikle hataların log-normal ya da normal dağılımıyla açıklanır). Bu, ayrı organizmaların toleransı (genellikle binominaldağılım uygulanmış) için olan var-yok verisi ile tipik biyodeney tepkilerin aksine çoğu kez baskın varyans bileşiği olacağı kabul edilir. Burada kontrol tepkileri sıfır seviyesi ya da arka plan seviyesidir.
Karışık olmayan durumlarda, normalleştirilmiş ya da bağıl tepkiler, r, monoton bir şekilde 1’den (sıfır yavaşlatma) 0’a (% 100 yavaşlatma) kadar azalır. Bütün tepkilerin birleşik olduğu ve görünen negatif yavaşlatma, sadece rastgele bir hatanın sonucu olarak hesaplanabildiği dikkate alınmalıdır.
Regresyon Analizi
Modeller
Regresyon analizi, Z = log C olan Y = f (C) ya da daha sıklıkla F (Z) matematiksel bağlanım fonksiyonu biçimindeki konsantrasyon – tepki eğrisini açıklamayı amaçlar. Ters fonksiyon olarak kullanılan C = f^–1 (Y), EC₅₀, EC₁₀ ve EC₂₀’i içeren EC_x biçimleri ve %95 güven sınırlarının hesaplanmasına izin verir. Birçok basit matematiksel fonksiyonel biçimler, alg büyümesini yavaşlatma testlerinde elde edilen konsantrasyon-tepki ilişkilerini başarılı bir şekilde açıklar. Fonksiyonlar, örnek verecek olursak asimptotik olarak C 0 için bir ve C ∞ için sıfır yaklaşan bütün“s” biçimindeki eğriler (sigmoid) olan lojistik denklem, simetrik olmayan Weibul denklemi ve log normal dağıtım fonksiyonu içerirler.
Sürekli eşik fonksiyonu modellerinin kullanımı (örneğin “popülasyon büyümesini yavaşlatma” için Koyman modeli, Kooijman ve ark.1996), yakın zamanda önerilmiştir ya da asimptotik modellere alternatiftir. Bu model belirli bir eşiğin altındaki konsantrasyonlarda hiç etki olmadığını varsayar. Eşik konsantrasyon, yani EC0+, dışdeğerbiçim uygulayarak, başlangıç noktasında türevlenebilir olmayan basit sürekli fonksiyon vasıtasıyla konsantrasyon-tepki ilişkisinin konsantrasyon ekseni ile kesiştirilmesinden tahmin edilir.
Eğer heterojenlik telafi edilir ise analizin artık kareler toplamının basit minimizasyonu ya da ağırlıklı kareler olabilecekleri dikkate alınmalıdır.

Prosedür
Prosedür şu şekilde özetlenebilir: uygun fonksiyonel denklem Y = f (C) seçilir ve doğrusal olmayan bağlanım ile veriye yerleştirilir. Veriden mümkün olduğunca fazla bilgi çıkarmak amacıyla, tercihen tekrarların ortalama değeri yerine her ayrı şişeden ölçümler kullanılır. Diğer taraftan, eğer varyans büyük olur ise, tekrarların ortalama değerlerinin, tutulmuş her ayrı veri noktasına göre veri içerisindeki sistematik hatalardan daha az etkilenmiş ve daha sağlıklı matematiksel tahmin sağladığıpratikte tecrübe edilmiştir.
Uygun hale getirilmiş eğri ve ölçülmüş veri çizilir ve yerleştirilmiş eğrinin uygun olup olmadığı tetkik edilir. Kalıntıların analizi, bu amaç için kısmen yardımcı olabilir. Konsantrasyon tepkisini yerleştirmek için seçilen fonksiyonel ilişki, düşük konsantrasyonlardaki tepki gibi eğrinin önemli bir kısmını ya da tamamını tanımlamıyor ise diğer eğri yerleştirme seçeneği seçilir – örneğin simetrik olan yerine Weibul fonksiyon gibi simetrik olmayan eğri. Negatif yavaşlatmalar örneğin log normal dağılım fonksiyonunda problem olabilir ve benzer şekilde bir alternatif bağlanım fonksiyonu gerekebilir. Bu tür negatif değerlere sıfır ya da küçük pozitif bir değer vermek tavsiye edilmez çünkü bu, hata dağılımını bozar. Eğrinin düşük yavaşlama kısmı vb. farklı kısımlarında ECl_owx gibi değerleri tahmin etmek için ayrı eğriler çizmek daha uygun olabilir. Yerleştirilmişdenklemden (‘ters tahmin’ C = f^–1 (Y)) karakteristik EC_x nokta tahminleri hesaplanır ve minimum olarak EC₅₀ ve bir ya da iki EC_{low x} tahmini rapor edilir. Test uygulamalarında veri noktalarının yeterli olduğu ve kirlilik etkeni olarak düşük konsantrasyonlarda uyarılma meydana gelmediği durumlarda, alg testinin doğruluğunun normalde %10 yavaşlama seviyesindegerçeğe yakın bir tahmin verdiği gözlenmiştir. EC₂₀kesinliği, genellikle EC₁₀’dan daha iyidir çünkü EC₂₀çoğunlukla, merkezi konsantrasyon tepki eğrisinin doğrusalkısmında yerleşmektedir. Büyümenin uyarılmasından dolayı bazen EC₁₀’u yorumlamak zor olabilir. Bu nedenle EC₁₀, yeterli doğruluk ile elde edilebilir olmasına rağmen, her zaman EC₂₀'nin de raporlanması tavsiye edilir.
Ağırlıklama faktörleri
Deneysel varyans genel olarak sabit değildir ve tipik olarak orantılı bir bileşen içerir. Bu nedenle rutin olarak ağırlıklı bağlanım yürütmek avantajlıdır. Bu tür bir analiz için ağırlıklama faktörlerinin, varyansa ters orantılı olduğu kabul edilir.
W_i=1/Var(r_i)
Birçok bağlanım programı, tabloda listelenmiş olan ağırlıklama faktörleri ile ağırlıklı bağlanım analizine izin verir. Ağırlıklama faktörleri, n/Σ w_i (n, veri noktalarının sayısı) ile çarpılarak uygun bir şekilde normalleştirilir, bu sayede toplamları 1’e eşit olur.
Normalleştirme tepkileri
Ortalama kontrol tepkisiyle normalleştirme bazı temel problemlere yol açar ve oldukça karmaşık varyans yapısına sebep olur. Yavaşlama yüzdesini elde etmek için tepkileri, ortalama kontrol tepkisine bölmek, kontrol ortalaması üzerindeki hatadan kaynaklanan ek bir hataya sebep olur. Eğer bu hata göz ardı edilecek kadar küçük değilse, bağlanım ve güven sınırlarındaki ağırlıklama faktörleri kontrol ile ortak değişiklik için doğrulanmalıdır (17). Ortalama kontrol tepkisitahmininin yüksek doğruluk ve hassasiyette olması, bağıl tepki için toplam varyansı minimize etmede önemlidir. Bu varyans aşağıdaki gibidir:
(alt simge i, konsantrasyon seviyesi i’yi; alt simge 0, kontrolleri belirtir)
Y_i=bağıl tepki =r_i/r₀=1—I=f(C_i)
varyans ile:

Var(Y_i)=Var(r_i/r₀)≅(∂Y_i/∂r_i)²∙Var(r_i)+(∂Y_i/∂r₀)²∙Var(r₀)

bu nedenle:

(∂Y_i/∂r_i)=1/r₀ ve (∂Y_i/∂r₀)=r_i/r₀²

normal olarak dağıtılmış veri ile ve m_i ve m₀ tepkileri ile:

Var(r_i)=σ²/m_i

bağıl tepkinin toplam varyansı, Y_i şöyle olur:

Var(Y_i)=σ²/(r₀²m_i)+r_i²∙σ²/r₀⁴m₀

Kontrol ortalamasındaki hata, ortalaması alınmış kontrol tepkilerinin kareköküne ters orantılıdır ve geçmiş verileri içermesi için ve hatayı büyük ölçüde azaltma yoluyla gerekçelenebilir. Diğer bir seçenek, veriyi normalleştirmeden tepkileri oldukları gibi tam yerleştirmek ve kontrol tepki verisini de dahil etmek fakat bu veriyi, yani kontrol tepki verisini, doğrusal olmayan bağlanımla yerleşecek ek bir parametre olarak kullanmaktır. Olağan 2 parametreli bağlanım denkleminde bu yöntem 3 parametre yerleştirilmesini gerekli kılar ve bu nedenle önceden ayarlı kontrol tepkisi kullanarak normalleştirilmiş verideki doğrusal olmayan regresyondan daha çok veri noktasına gereksinim duyar.
Ters güven aralıkları
Ters hesaplamayla çizgisel olmayan bağlanım güven aralıklarının hesaplanması oldukça karmaşıktır ve olağan istatistiksel bilgisayar programı paketlerinde uygun bir standart seçenek değildir. Yaklaşık güven sınırları; örneğin tahmin edilecek parametreler olarak EC₁₀ ve EC₅₀ gibi istenen nokta tahminleri ile matematiksel denklemin tekrar yazılmasını kapsayan tekrar parametreoluşturarak (Bruce ve Versteg) standart doğrusal olmayan bağlanım programları ile elde edilebilir (fonksiyonun I = f (α, β, konsantrasyon) olmasına izin verilir ve f (α, β, konsantrasyon) ile eşdeğer fonksiyon g (EC₁₀, EC₅₀, konsantrasyon) yer değiştirmek için f (α, β, EC₁₀) = 0,1 ve f (α, β, EC₅₀) = 0,5 ilişkisinin tanımı kullanılır).
Daha doğru bir hesaplama (Andersen ve ark., 1998), orijinal denklemi koruyarak ve r_i ve r₀ ortalamaları çevresindeki Taylor genişlemesini kullanarak uygulanır.
Yakın zamanda ‘öz yükleme yöntemleri’ yaygın olmuştur. Bu gibi yöntemler ölçülmüş veri kullanır ve denemeli varyans dağılımını tahmin etmek amacıyla yaygın yeniden numune almaya yönelik bir rasgele sayı üretici kullanır.