Pişirilmiş Balıktan Çıkan Karbonhidrat Fraksiyonları Caco-2 Hücrelerinde Demir Alımı Sağlar

Pişirilmiş Balıktan Çıkan Karbonhidrat Fraksiyonları Caco-2 Hücrelerinde Demir Alımı Sağlar
Eun Chul Huh, Arland Hotchkiss, Janine Brouillette ve Raymond P. Glahn
ÖZET Bu çalışmanın amacı çeşitli analitik ve in vitro hücre kültürleri teknikleri kullanarak hem-içermeyen demir biyoyararlanımını artıran et faktörünü(lerini) izole etmek ve tanımlamaktı. Hem-içermeyen demir biyoyararlanımı Caco-2 hücrelerinde radyoaktif olarak etiketlenmiş demir alımı ya da ferritin oluşumu yoluyla ölçüldü. Mezgit balığı fileto halinde pişirildi ve düşük intrinsik demir içeriği nedeniyle seçilen kas dokusu olarak kullanılmak üzere dondurarak kurutuldu. Hem-olmayan demir alımında balığın artırıcı etkisini başlatmadan sorumlu temel faktörün, düşük mide pH’i (pH 2.0) olduğu gösterildi. Ardından, pişirilmiş balık örnekleri HCl ile pH 2.0’a titre edildi ve faktörü(leri) balıktan ayıracak sindirim enzimleri olmaksızın 1 saat süreyle inkübe edildi. Daha sonra bu asidik özütün üst fazı et faktörü izolasyon işlemlerinin başlangıç materyali olarak kullanıldı. Sephadex G-25 boyutlu eklüzyon yoluyla üretilen fraksiyonlar Caco-2 hücrelerinin demir alımını yaklaşık 9-kat artırdı. Ardından bu fraksiyonların C18 ters-evre HPLC yoluyla kromatografisi yapıldı ve artırma aktivitesi sadece “injeksiyon pik” halinde gözlendi. Yapılan protein ölçümü ve amino asit kompozisyon analiziyle birlikte bu gözlem, aktif fraksiyonların ihmal edilebilir miktarda protein ya da amino asit içerdiğini ortaya koydu. Aktif fraksiyonlar karbonhidratlar yönünden oldukça zenginleşmişti. Daha sonra puls amperometrik detektörlü yüksek performanslı anyon değişim kromatografisi yoluyla yapılan kromatografi, Caco-2 hücresi demir alımını 3.4’den 4.9 katına çıkaran 3 aktif pik ortaya çıkardı. Elde ettiğimiz bulgular bazı karbonhidratların etin enterosit yoluyla demir alımı üzerindeki artırıcı etkisine katkıda bulunduğuna işaret etmektedir. Bu karbonhidratlar kas dokusunun hücredışı matriksinde yer alan glikoaminoglikanlardan çıkan oligosakaritler olabilir.
Anahtar sözcükler: et faktörü, demir, in vitro sindirim, Caco-2 hücreleri, oligosakaritler
J Nutr. 134:1681-1689, 2004
Kas dokularının (etler) tüketilmesi insanlarda (1-7), hayvanlarda (8,9) ve in vitro (10-14) modellerde hem-içermeyen demir emilimini artırır. Bu etki, ilk olarak araştırmacıların sebzelerden sağlanan demir emiliminin dana ya da balık kasıyla arttığını gözlemlediği 1960’ların sonlarında yayınlanmıştır (4,15). Kas dokularından sağlanan artıcı etki ortaya konduğundan, kas dokularının hem-içermeyen demir emilimini nasıl artırdığını saptama amaçlı denemeler yapılmıştır (3,6,10-12,16-20). Ancak, kas dokularının artıcı etkisi halen aydınlatılamamış olup, bu yüzden de yaygın bir şekilde “et faktörü” olarak adlandırılmaktadır.
“Et faktörü” konusunda çeşitli mekanizmalar öne sürülmüştür. Bazı araştırmacılar hem-içermeyen demir emiliminin artmasının dolaylı bir şekilde gastrik faktör(ler) yoluyla hızlandırıldığını düşünmektedir. Örneğin, et tüketiminin gastrik asit salgılamasını uyardığı, bunun da hem-içermeyen demirin çözüleceği daha asidik bir ortam sağlayabileceğine dair bazı kanıtlar söz konusudur (21). Bu kanıt aklorhidrili, demir eksikliği bulunan hastaların demir emiliminin asit çıkışı normal olanlardan daha az olduğu bulgusuyla desteklenmektedir (22,23). Buna karşın, hem-içermeyen demir alımının etlerle arttığını gösteren, diyetle ilgili faktörlerin et etkisinden sorumlu olduğunu destekleyen birçok in vitro çalışma bulunmaktadır. Bazı araştırmacılar proteolitik sindirim yoluyla kas proteinlerinden salınan birtakım aminoasit ve peptitlerin yiyeceklerdeki demiri daha emilebilir ferröz (Fe²⁺) forma indirgeyerek ya da mukoza hücreleri tarafından kolayca alınabilecek çözülebilir demir kompleksleri oluşturarak demir emilimini artırdığını düşünmektedir (3,17,19,24). Buna karşın, bir çalışmada sindirilen ya da sindirilmeyen et homogenatlarından elde edilen diyaliz ürünlerinin in vitro ortamda pH 7’de çözülebilir demiri artırdığı bildirilmiştir, bu da demirin etle çözünebilmesi için proteolitik sindirimin gerekli olmadığına işaret etmektedir (25). Sistein ya da sistein-içeren peptitlerin etin demir emilimi üzerindeki geliştirici etkisinin olası adayları olduğu düşünülmüştür, çünkü bunların ferrik (Fe ³⁺) demiri daha fazla biyoyararlanılabilir durumdaki ferröz (Fe ²⁺) demire indirgediği gösterilmiştir (26). Ayrıca, in vivo ve in vitro çalışmalar sisteinin bulunduğu ortamlarda hem-içermeyen demirin bulunabilirliğinde artış göstermiştir (3,19,24). Buna karşın, kas proteiniyle neredeyse aynı amino asit kompozisyonuna sahip farklı hayvan proteini kaynaklarının (örn, tavuk yumurtası albümini) hem-içermeyen demir emilimini aynı şekilde artırmadığına dair gözlem (1,2), et faktörünün önemli bir parçası olarak sülfihidril grubunun rolünü desteklememektedir. Çeşitli çalışmalarda histidin de et etkisinin bir parçası olarak gösterilmiştir (17,28,29), ancak bulgular yetersiz kalmıştır.
Aşağıda belirtilen nedenlerden ötürü Caco-2 hücre çizgisinden tarama aracı olarak faydalandık: 1) hayvan ya da insanlarla yapılan çalışmalarda örnek veya tedavilerin sayısı in vitro sistemlere göre ciddi anlamda kısıtlıdır; 2) çözülebilir ya da diyalizabl demire dayalı biyoyararlanım tahminlerinin bazı olgularda demir biyoyararlanımının ölçümünde yetersiz olduğu gösterilmiştir (13,30,31); 3) Caco-2 hücre sistemi gastrik asit salgılaması gibi fizyolojik faktörler yerine diyetle ilgili faktörler üzerine odaklanmamıza olanak sağlayacaktır; ve 4) ette (örn, sığır, tavuk ve balık) Caco-2 hücresi demir alımının daha önceki çalışmalarda diğer protein kaynaklarınınkinden 3 ya da 5 kat daha fazla olduğu gösterilmiştir, bu durum in vivo çalışmalardakinin çoğuna oldukça yakındır. Ayrıca, caco-2 monolayerlarının varlığında simüle edilmiş peptik sindirimin ardından bağırsak sindirimini gerçekleştirmek için bir in vitro teknik kullanıldı (14,32-34), bu da bize et etkisini yaratan sindirim koşullarını saptama olanağı sağladı. Ayrıca, sindirim ve fraksiyonasyon işlemlerinde çeşitli farklı benzersiz yaklaşımlar uygulanarak izolasyon işlemleri basitleştirildi ve bu çalışma için uygun hale getirilebildi.
Bu çalışmada “et faktörünün” izolasyon ve karakterizasyonu in vitro sindirim, Caco-2 hücre kültürü ve ardından kromatografik saflaştırma tekniklerinin birarada kullanılması yoluyla gerçekleştirildi.
MATERYAL ve YÖNTEM
Kimyasallar. Başka türlü belirtilmedikçe, ayıraçların tümü Sigma Chemical firmasından satın alınmıştır.
Hücre kültürleri. Caco-2 hücreleri Amerikan Tipi Kültür Toplama pasaj 17’den temin edilmiş olup, pasaj 30-35’deki deneylerde kullanılmıştır. Hücreler 50,000 hücre/cm² yoğunlukta kolajenle işlemden geçirilmiş 6- ya da 24- çukur kültür kaplarına (Costar) ekildi. Hücreler %10 v:v fetal bovine serum (FBS, ³ GIBCO), 25 mmol/L HEPES (Sigma) ve %1 antibiyotik antimikotik çözelti (GIBCO) içeren DMEM’de çoğaltıldı. Hücreler sabit nemde %5 CO₂, %95 hava atmosferiyle bir inkübatörde 37 °C’de tutuldu, medyum her 2 günde bir değiştirildi. Bu hücreler ekim sonrası 14. günde demir alımı deneylerinde kullanıldı. Bu koşullar altında her bir çukurda ölçülen hücre protein miktarı her bir kültür kabında çukurdan çukura hayli tutarlılık gösterdi.
Et örnekleri. Kas dokusu olarak minimum hem-içeren demir düzeyiyle (<0.01 µmol hem Fe/g pişmiş toz) nispeten düşük bir total demir konsantrasyonuna (~0.12 µmol Fe/g pişmiş toz) sahip olması nedeniyle tercih edildiğinden bu çalışmada balık seçildi. Balık minimum demir konsantrasyonuyla mükemmel bir kas dokusu kaynağı oluşturduğundan en uygun doku olarak düşünüldü. Balık örneği donmuş mezgit filetolarından hazırlandı. Balık lokal olarak temin edildi, gözle görülen tüm yağ ve derisi alındı. Toplam 200 g’lık fileto 1,5 – 2.5 cm’lik küpler halinde kesilip, 200 mL’lik deiyonize suya kondu, daha sonra bir blender (Waring Products) ile homojen hale getirildi. Karışım 3 dakika mikrodalgada tutuldu ve 1.5 dakikalık aralıklarla çalkalandı. Pişmiş durumdaki karışım bir kez 10 saniyelik puls ile tekrar blenderda homojen hale getirilip, buz kaplarına döküldü ve -20° C’de donduruldu. Dondurulmuş karışım liyofilize edilip, öğütüldü; ortaya çıkan toz -20° C’de saklandı.

Asidik özütlerin hazırlanması. Liyofilize haldeki pişmiş balık tozu (0.9 gr) 30 mL’lik 0.01 mol/L HCL ile karıştırılıp, 5 mol/L Hcl ile pH 2.0’a getirildi. %5 CO₂ ve %95 hava ile 1 saat süreyle bir inkübatörde 37° C’de sallama platformlu çalkalayıcı üzerinde inkübe edildi. İnkübasyon sonrasında karışım 30 dakika süreyle 4000 x g’da santrifüj edildi (IEV Model HN-SII Santrifüj). Üst faz alındı ve liyofilize edildi.
Sephadex G-25 kolon fraksiyonasyonu. Sephadex G 25 resini (5 gr) bir gece boyunca

4 °C’de deiyonize suda ıslatıldıktan sonra, çökmeyen ince partikülleri almak amacıyla süzüldü. Şişmiş durumdaki resin dengeleme için pH 2.0’de 0.01 mol/L HCl’ye aktarılıp, bir kolon (çap, 1cm; uzunluk, 32cm, Flex-column kromatografi kolonu, Kontes) üzerine alındı. Kolonu dengelemek için, 0.01 mol/L HCl geceleyin ayrıştırıldı. Düşük oran 1.0 mL/dk’ya ayarlandı. Asidik özütten 150 mg’lık bir örnek pH 2.0’de 1.5 mL’lik 0.01 mol/L HCl’de çözündürüldü. Örnek çözelti kolona uygulandı ve peristatik bir pompa (EP-1 Econo Pump, Bio-Rad Laboratories) ile birlikte pH 2.0’da 0.01 mol/L HCl ile ayrıştırıldı. 2.0 mL’lik fraksiyonlar (F_s) bir fraksiyon toplayıcı (Medel 328, Instrumentation Specialties) yardımıyla tüplere alındı. Demir ayrışımı kuru-yakma sonrasında indüktif eşleşmiş argon plazma emisyon spektrometresi (ICAP Model 61E Trace Analyzer, Thermo Jarrell Ash) kullanılarak toplam demir ölçümüyle takip edildi. Protein ve protein sindirim ürünlerinin ayrışması ise Lowry testinin yarı-mikro ticari bir uyarlaması olan (Bio-Rad Laboratories) Bio-Rad DC protein test kiti kullanılarak takip edildi.

Protein ve peptit C18 kolonuyla ters evre HPLC purifikasyonu. Jel kromatografisinden toplanan fraksiyonlara (F_R) çeşitli akış oranlarında %0.1 trifluoroasetik asitli (TFA, v:v) su kulanılarak dengelenmiş bir protein ve peptit C18 kolonu (analitik:4.6 mm i.d. ya da semipreparatif kolon: 10 mm i.d. x 250 mm uzunluk, Vydac) üzerinde ters-evre HPLC (RP-HPLC) uygulandı. %0’dan %60’a doğrusal %100 asetonitril (ACN) (%0.1’lik TFA’da) gradyan uygulandı. Ayrışma 210 nm’de takip edildi. Piklerin her biri toplanıp, bir spin evaporatör (Labconco) ile buharlaştırıldı.
CarpoPac PA1 kolonu ile HPAEC-PAD purifikasyonu. Bir CarboPac PA1 (Dionex) kolonu (9x250 mm) kullanılarak puls amperometrik detektörlü yüksek performanslı anyon değişim kromatografisi (HPAEC-PAD) purifikasyonu yapıldı. Ayrışma 3 mL/dk’lık sabit akış hızında 100 mmol/L NaOH mobil evrede sağlandı. Nötralizasyon amacıyla 0.3 mol/L TFA kullanarak anyon mikro-membran supressor (AMMS) ile bilgisayara bağlı tuzsuzlaştırma yapıldı. AMMS PAD detektör hücresi ile fraksiyon toplayıcı arasına yerleştirildi. Üstüste yapılan injeksiyonlarda 5 ile 10 dakika arasındaki 3 büyük pik toplandı; benzer fraksiyonlar biraraya konuldu ve liyofilize edildi. Her bir fraksiyonun (F_H) saflığı 0.8 mL/dk’lık akış oranı ile AMMS’siz analitik bir CarboPac PA1 kolonunun (4 mm i.d.) kullanılması dışında yukarıda aktarıldığı gibi HPAEC-PAD analiziyle saptandı.
HPAEC-PAD fraksiyonlarının ¹H NMR analizi. Demir alım aktivitesi bulunan HPAEC-PAD fraksiyonları ¹H NMR ile analiz edildi. Örnekler iki kez D₂O (%99.96; Cambridge Isotopes) ile değiştirilip, 50 µL’lik D₂O’da çözündü. Varian gHX Nano prob (2000 Hz’de dönen) kullanılarak 25ºC’de 400-MHz Varian INOVA spektrometreyle proton spektrumları elde edildi. Su pikinin yoğunluğunu azaltmak için ön-doygunluk deneyleri yapıldı. Toplanan transituvar sayısı 512 ile 2048 tarama arasında değişti, arama genişliği 6400 Hz, toplam geri çevrim süresi 2.6 saniyeydi, 32,000 veri göstergesi vardı.
6-çukurlu kültür kabı üzerinde in vitro sindirim/Caco-2 hücresi demir alımı. Geçme halkaya takılan diyaliz membranındaki mineral kontaminasyonunu gidermek için %70 etanol yerine 0.5 mol/L HCl kullanmanın dışında, Glahn ve ark.’larının (14) prosedürlerine uygun olarak moleküler ağırlık sonlanma noktası 15kDA olan bir diyaliz membranı taşıyan geçmelerle eşleştirilmiş 6-çukurlu kültür kapları (Spectra/Por Regenerated Cellulose, Spectrum Medical Industries) hazırlandı. Kısaca, in vitro sindirime başlamadan bir gün önce hücrelerden DMEM (GIBCO) aspire edildi ve yerine 2 mL MEM (GIBCO) kondu. Plastik geçmeler uygun boydaki bir Transwell geçme halkanın (Costar) altına diyaliz mebranı takarak oluşturuldu. Diyaliz membranını geçme halkaya taktıktan sonra, tüm ünite 0.5 mol/L HCl’ye yatırılarak, kullanılıncaya kadar steril suda tutuldu. Bir sonraki gün hücreler 2 mL MEM ile yıkanıp, bağırsaklarda sindirim öncesinde 1 mL’lik taze bir MEM alikuatıyla kaplandı. Diyaliz membranlarına bağlı geçmeler hücre kaplarının çukurlarına ve benzer kaplara (membranda diyaliz edilen alt odacık demirini ölçmek için kullanılan hücreden yoksun 6-çukurlu kaplar) aseptik olarak yerleştirilerek, iki-odacıklı bir sistem oluşturuldu.
İn vitro sindirim yöntemiyle ilgili ayrıntılar başka bir yerde açıklanmıştır (14). Bu çalışmada balığın bağırsaktaki hem-içermeyen demir alımı üzerindeki geliştirici etkisini başlatmak için gereken kritik sindirim özelliğini saptamak amacıyla sindirilecek şeylerin (öz ya da dijest) hazırlığında ufak bir modifikasyon yapıldı. İlk deney serilerinde (Şekil 1) balıklı ya da balıksız (300 mg) FeCl₃ (41.7 µmol/L) içeren özler düşük pH, pepsin ve pankreatin/safra kesesi sindiriminin pişirilmiş balık kas dokusunun varlığında demirin bulunabilirliği üzerindeki kümülatif etkilerini saptamak amacıyla çeşitli derecelerde sindirime tabi tutuldu. İlk iki özün koşullarında örneklerde düşük pH işlemi, pepsin sindirimi ya da pankreatin/safra kesesi sindirimi yoktu. Bu özlerde FeCl₃ ve FeCl₃+ balık, 10 mL’lik 130 mmol/L NaCl, 5mmol/L Kcl ve 5 mmol/L PIPES içeren tüplere yerleştirildi. pH 7.0’a ayarlandı ve örnekler 1 saat süreyle 37º C’de sallantılı bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edildi. Bir saat sonra bu özler toplam 15 mL’ye getirildi ve ayrılan kültür çukurlarının üst odacığına 1.5 mL’lik bir alikuot yerleştirildi. Daha sonra kültür kapları 2 saat süreyle 37° C’de sallantılı bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edildi. Bu özler “Fe” ve Fe/Balık” şeklinde etiketlendi. Bir sonraki öz çifti, pH’in başlangıçta HCl ile 2.0’a ayarlanması ve 1 saat süreyle 37° C’de inkübe edilmesi dışında ilk çiftle aynıydı. Daha sonra, bu özler toplam 15 mL’lik bir hacime ayarlanmadan önce 1 mol/L NaHCO3 ile pH 7.0’a ayarlandı. Bunlar “Fe/pH2” ve “Fe/balık/pH2” olarak etiketlendi. Bir sonraki öz seti, pH 2.0’da 1 saatlik inkübasyon süresi esnasında pepsin eklenmesi dışında bir önceki set ile aynıydı. Bu özler de “Fe/Pep” ve “Fe/Balık/Pep” şeklinde etiketlendi. Son öz seti tam bir in vitro sindirim işlemine tabi tutuldu; bu yüzden, pH 2.0’da pepsin sindirimi ve pH 7.0’a titrasyon sonrasında pankreatin ve safra özütü eklendi. Diğer özlerde toplam hacim 15 mL’ye ayarlandı. İkinci deney serisi (Şekil 2) ilk serinin bulgularını tekrarlayacak şekilde tasarlandı. Buna ek olarak, pankreatin/safra sindirim süresinin başında her bir preparatta toplam çözünebilir demir ile toplam çözünebilir ferröz (Fe²⁺) demir ölçüldü. Öz koşulları, başka iki özün daha eklenmesiyle yukarıda aktarılanlarla aynıydı. “Boş” bir örnekte pH 7.0’da sadece 130 mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl ve 5 mmol/L PIPES yer aldı. Bu örneğe pH ayarı yapılmadı ve yukarıdaki özlerle aynı koşullar altında inkübe edildi. Eklenen ikinci koşul ise “Fe + AA” idi. Bu örnekte FeCl₃ (41.7 µmol/L) pH 2.0’da askorbik asitle (AA, 1.0 mmol/L) karıştırılıp, daha sonra pH 7.0’a uyarlandı ve diğer özlerle aynı şekilde inkübe edildi.
Bağırsaklardaki sindirim süresinin başlangıcında özden 1.5 mL’lik alikuot üst odacığa yerleştirildi. Kabın üstü kapatıldı ve sallantılı bir platformun (model RP-50, Laboratory Instruments) üzerinde 2 saat süreyle 37º C’de inkübe edildi. İki saatlik inkübasyon sonrasında geçmeler dikkatli bir şekilde kaldırıldı ve alt odacıkların her birine 1 mL’lik MEM eklendi. Benzer kapların alt odacıklardaki içeriği tüplere alındı, daha sonra demir analizi yapmak üzere -20 ° C’de saklandı. Sonra, hücre kapları ferritin oluşumuna süre sağlamak amacıyla 22 saat daha (bağırsak sindiriminin başından itibaren 24 saat) yeniden inkübatöre konuldu.
Ferritin analizi için Caco-2 hücre monolayerının alınması. Hücreler Glahn ve ark.larının (14) açıkladığı şekilde alındı. Kısaca bağırsak sindirim süresinin başlamasından 24 saat sonra hücrelerin bulunduğu medyum alındı ve hücreler pH 7.0’da 130 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl ve 5 mmol/L PIPES’tan oluşan 2 mL hacmindeki “çalkama” çözeltisiyle iki kez yıkandı. Çalkama çözeltisi daha sonra aspire edildi ve hücre üzerine 2 mL hacminde deiyonize su kondu. Daha sonra kaplar her bir kabın alt tarafı soğuk bir odada 4 °C’de tutulan bir tezgahüstü sonikatörün (Elma Transsonic Digital sonicator, Lab-Line Instruments) suyuyla temas halinde olacak şekilde bir rafa yerleştirildi. Hücrelere 15 dakika süreyle sonikasyon uygulandıktan sonra kabın yüzeyinden kazındı ve - 20° C’de saklandı.
24-çukurlu kültür kabında demir alımı. Fraksiyon örneklerinin demir alımı üzerindeki etkisini incelemek amacıyla radyoaktif olarak etiketlenmiş demir eklenen 24-çukurlu kültür kapları kullanıldı (Şekil 3, 4 ve Tablo 1). 24-çukurlu kabın hücre medyumu 0.5 mL MEM ile değiştirildi. Bir sonraki gün, alım deneyi öncesinde, hücre katmanı pH 7’de

37 °C MEM ile yıkandı ve her bir monolayerın üzerine 0.5 mL MEM kondu.

Demir alım deneylerinde ⁵⁹ FeCl₃‘ü (0,5 mol/l hidroklorik asitte demir 59, demir klorür, NEN Life Science Products) FeCl₃ (0.1 mol/L HCl’de 1040 mg Fe/L FeCl₃ standartı) ile karıştırarak radyoaktif olarak etiketlenmiş bir demir çözeltisi hazırlandı. Eklenen ⁵⁹FeCl₃ ve FeCl₃ standart çözeltilerinin miktarı ~11 kBq/mL alım çözeltisi ve 10 µmol/L’lik bir demir konsantrasyonu sağlayacak şekilde ayarlandı. Demir alım deneyi örnekleri 300 µL’lik 0.01 mol/L HCl’de (pH ~2.0) oluşturuldu. Örnek çözeltilere önceden hazırlanmış radyoaktif etiketli demir çözeltisi (15 µL) eklendi, sonra ardarda belirtilen sırayla 30 µL 1.5 mol/L NaCl ve 455 µL MEM eklendi. Alımı başlatmak için hazırlanan alım çözeltisinden 500 µL uygun Caco-2 hücre monolayerına kondu. İki saatlik alım sonunda hücre monolayerı gama sayımı yoluyla ⁵⁹Fe’nin sayısının saptanması için alındı. Yukarıda açıklandığı gibi balık kası dokusunda çok az intrinsik demir vardı (~0.12 µmol Fe/g pişmiş balık tozu). Buna bağlı olarak, demir alım deneylerinde kullanılan fraksiyon örneklerinin hepsi, neredeyse tamamıyla (>%96) dışardan eklenen hem-içermeyen demir (10 µmol/L FeCl₃) olan, eşit miktarda demir içerdi.
⁵⁹Fe ölçümü için Caco-2 hücresi monolayerinin alınması. 24-çukurlu kültür kaplarındaki hücreler pH 7’de 0.5 mL’lik “çalkalama” çözeltisiyle bir kez yıkandı. Çalkalama çözeltisi daha sonra aspire edildi ve yüzeye bağlı demiri almak amacıyla hücre monolayeri üzerine 0.5 mL yeni hazırlanmış bir “giderme” çözeltisi kondu. Giderme çözeltisi özgün olmayan bir şekilde bağlanmış demirin Caco-2 hücre monolayerlarından fırça kenar membrana zarar vermeden alınmasını sağlamak için yukarıda açıklanan çalkalama çözeltisine 5 mmol/L sodyum hidrosülfit ve 1 mmol/L batofenantrolen disülfonik asit eklenmesiyle oluşturuldu (35). Giderme süresi sonrasında, giderme çözeltisi aspire edildi ve hücre monolayerı 0.5 mL “çalkalama” çözeltisiyle yıkandı. Çalkalama çözeltisi aspire edildikten sonra, 1.0 mL’lik 0.5 mol/L NaOH çözeltisi monolayerların her birini çözülebilir hale getirmek için monolayerlerın üzerine konarak, hücreler kaptan kazındı. Hücre süspansiyonu bir gama sayacında sayılmak için sintilasyon şişelerine alındı.

TABLO 1

HPAEC-PAD ile toplanan 3 kas fraksiyonundan elde edilen Caco-2 hücrelerinde radyoaktif etiketli demir alımı ^1
	Radyoaktif etiketli demir alımı
Fraksiyon	Çalışma A^2	Çalışma B^3
	%
Kontrol ^4 FH-1 FH-2 FH-3	2.3 7.9 7.9 11.3	3.9 6.4 7.4 16.3

¹ Caco-2 hücrelerindeki radyoaktif etiketli demir alımı. Piklerde toplanan fraksiyonlar kurutulup, daha sonra 300 µL’lik 0.01 mol/L HCl çözeltisinde yeniden oluşturuldu. Tüm alım çözeltileri demir kaynağı olarak 10 µmol/L FeCl₃ içerecek şekilde tasarlandı.

² Fraksiyonların her biri balık kasından izole edildi ve demir alımı için eşit miktarda (2.3 mg)

fraksiyon örneği kullanıldı.

³ Fraksiyonlar balık kasıyla aynı işlemler uygulanarak tavuğun beyaz göğüs kasından hazırlandı, fraksiyonların tutulma süreleri balıklarınkiyle aynıydı.

⁴ Fraksiyonsuz FeCl₃ içeren alım çözeltisi başlangıç kontrolü olarak kullanıldı.

Analizler. Örnek hazırlama ve analizlerde kullanılan cam mamüllerin hepsi mineral kontaminasyondan kaçınmak için kullanım öncesinde %10 HCl ve deiyonize su ile çalkalandı. Caco-2 hücre proteini Lowry testinin (Bio-Rad Laboratories) ticari bir yarı-mikro uyarlaması olan Bio-Rad DC protein test kiti kullanılarak 0.5 mol/L NaOH’de çözülebilir hale getirilmiş örnekler üzerinden ölçüldü. Et örnekleri ve fraksiyonlardaki protein yukarıda açıklanan yöntem kullanılarak saptandı. ⁵⁹Fe otomatik bir gama sayacında (Packard Auto-Gamma model 5530, Packard Instruments) sayıldı. Caco-2 hücresi ferritin içeriğini ölçmek için immünoradyometrik bir test kullanıldı (FER-IRON II Serum Ferritin Testi, RAMCO Laboratories). Her bir ferritin ölçümünde 2 mL alınan 10 µl’lik sonikasyonlu bir Caco-2 hücre monolayer örneği kullanıldı. Deneysel çözelti, örnek ve özlerin demir içeriğiyle ilgili analizler, kuru-yakma sonrasında indüktif eşleşmiş argon plazma emisyon spektrometresi (ICAP Model 61E Trace Analyzer, Thermo Jarrell Ash Corporation) kullanarak yapıldı. Özlerde bulunan toplam çözülebilir demir ve çözülebilir ferröz demirin sayısını bulmak için kolorimetrik ayıraç olarak ferrozini kullanan kolorimetrik bir test yapıldı (36). Örneklerin her birinde çözülemeyen demiri ayırmak için 15,000 x g’deki bir mikrosantrifüjde 10 dakikalık santrifüj kullanıldı. Her bir besin örneği özlerin 2 saatlik inkübasyonunun hemen başında alındı. Kolorimetrik test bu zaman noktasında dakikalar içerisinde yapıldı. Amino asit analizleri Waters PicoTAG yöntemi (Waters Kromatografi Bölümü) kullanılarak HPLC ile yapıldı.
İstatistiksel analiz. Veriler Prism yazılımıyla (GraphPad Software) normallik ve eşit varyans testi yapıldıktan sonra tek-yönlü ANOVA ile analiz edildi. Eşit olmayan varyansları bulunan örnekler logaritmik olarak dönüştürüldü ve tek-yönlü ANOVA ile analiz edildi. Ortalamaları kontrolle karşılaştırmak için Dunnett test-sonrası kullanıldı; eşli ortalamaları karşılaştırmak içinse Tukey’in test-sonrası kullanıldı. Farklılıkların P < 0.05’de anlamlı olduğu düşünüldü.
BULGULAR
Et etkisi yaratacak sindirim koşullarının saptanması. Balığın, ferritin oluşumuyla ölçülen, hem-içermeyen demir alımı üzerindeki artırıcı etkisini oluşturmak için gereken sindirim aşamasıyla(ları) ilgili bulgular Şekil 1 ve 2’de özetlenmektedir. Alt odacıktaki demir miktarı her bir sindirim aşamasının eklenmesiyle artma eğilimi gösterdi, ama çarpıcı farklılıklar gözlenmedi (Şekil 1). pH’i 7.0’da tutulan balığın eklenmesi ferritin oluşumunu etkilemedi (Fe’ye karşı Fe/Balık). pH derecesini 1 saat süreyle 2.0’a düşürmek balık içermeyen özlerden ferritin oluşumunu %171 oranında artırdı (Fe’ye karşı Fe pH 2.0). Bir saat süreyle pH 2.0’da inkübasyonla birlikte balık eklenmesi ferritin oluşumunu %154 daha artırdı (Fe pH 2.0’a karşı Fe/balık pH 2.0). Pepsin ve pankreatin enzimlerinin eklenmesiyle ferritin oluşumunda daha anlamlı artış gözlenmedi.

Şekil 1’deki bulguları yeniden elde etmek ve aynı zamanda toplam çözülebilir demir ve çözülebilir ferröz (Fe ²⁺) demir ölçümlerini sağlamak için yapılan ek deneyler Şekil 2’de özetlenmektedir. Bir kez daha balıkla pH’de inkübasyon yapılması ferritin oluşumunu anlamlı oranda birkaç kat artırdı (yani, %452; Fe pH 2.0’a karşı Fe/balık pH 2.0). pH 2.0’da inkübasyon olmadan balığın olması toplam çözülebilir demiri %84, çözülebilir ferröz demiri ise %69 oranında azalttı. Besinleri pH 2.0’ye aside dönüştürmek toplam çözülebilir demir ve çözülebilir ferröz demir miktarını değiştirmedi. Aynı şekilde, balık pH 2.0’da demirle inkübe edildiğinde balığın varlığı toplam çözülebilir demiri %72, çözülebilir ferröz demiri %69 oranında azaltmasına rağmen, ferritin oluşumu dramatik bir şekilde arttı.

Şekil 1 ve 2’deki bulgulara dayanarak pişmiş balık kasları 1 saat süreyle asidik koşullar altında (pH 2.0) sindirimle ilgili enzimlerin işleminden geçmeden sindirildi. Bu, sindirim sürecinde hem-içermeyen demir alımının arttığını gösteren ilk ve temel aşamaydı. Sindirim sürecindeki ek aşamalar (yani, Fe/Balık Pepsin ve Fe/Balık Pep/PB) anlamlı bir ek artış yaratmadı. Bu bulgular balık kasının asit özütünün daha sonra yapılacak purifikasyon işlemlerindeki ilk materyali oluşturduğuna işaret etmektedir. Asit özütünün liyofilizasyonu ~%21 pişmiş balık tozu ürünü verdi (yani, kütle başına temelinde geri kazanım).
Şekil 1 Balığın hem-içermeyen demir alımı üzerindeki artırıcı etkisini ortaya çıkarmak için gereken sindirim bileşeninin saptanması amacıyla alt odacıktaki demir (A) ve Caco-2 hücresi ferritin oluşumunun (B) ölçümü. Sindirim koşulları hem-içermeyen demir alımı konusunda aşağıdaki faktörleri test etti: 1) balığın varlığı (Fe, Fe/Balık); 2) düşük gastrik pH’in etkisi (Fe pH2, Fe/Balık pH2) 3) pepsinli düşük gastrik pH’in etkisi (Fe Pepsin, Fe/Balık Pepsin); ve 4) tam in vitro sindirimin etkisi (Fe Pep/PB, Fe/Balık Pep/PB). Kullanılan kısaltmalar: Pep, pepsin; PB, pankreatin/safra kesesi. Üst panel bağırsaktaki sindirim süresinin sonunda hiç hücre bulunmayan alt odacıkta ölçülen demir miktarını temsil eder. Alt panel ise bağırsaktaki sindirim süresinin başlamasından 24 saat sonra ölçülen Caco-2 hücresi ferritin oluşumunu temsil eder. Değerler ± SEM olarak verilmiştir, n=5. Ortak bir harfi bulunmayan ortalamalar farklılık gösterir, P < 0.05.
Şekil 2 FeCl₃ ve balık özlerinden (Fe/Balık, sindirim yok; Fe/balık pH2, düşük gastrik pH işlemi) toplam çözünebilir demir (A), çözünebilir ferröz (Fe ²⁺) demir (B) ve Caco-2 hücresi ferririn oluşumu (C) ölçümleri. Fe/Balık ve Fe/balık pH2 ile karşılaştırmalı olarak eklenmiş balık içermeyen özler (Fe ve Fe pH2) kontrol olarak kullanıldı. Demir ve 1.0 mmol/L askorbik asit (Fe + AA) içeren bir öz pozitif kontrol olarak kullanıldı. Her bir öze yerleştirilen toplam demir miktarı eklenmiş demir konmayan boş öz dışında 2.32 µg/mL idi. Değerler ± SEM olarak verilmiştir, n=4. Ortak bir harfi bulunmayan ortalamalar farklılık gösterir, P < 0.05.

Asit özütünün fraksiyonasyonu. Asit özütünün Sephadex G-25 jel kromatografisi 22 fraksiyon çıkardı. Bu fraksiyonların alikuotları hangi fraksiyonların Caco-2 hücrelerinde demir alımı üzerinde artırıcı etkisi olduğunu saptamak için radyoaktif etiketli demir (⁵⁹ Fe) alımı deneylerine tabi tutuldu. Fraksiyonlarla yapılan analizler artırıcı etkinin 5-12 fraksiyonlarından elde edildiğini (Şekil 3), en yüksek artışın tipik olarak sırasıyla 7.7 ve 9.0 katı şeklinde 10. (F_S-10) ve 11. (F_S-11) fraksiyonlarda olduğunu ortaya çıkardı. Protein analizi sonuçları fraksiyonlarda yüksek demir alımı artırıcı etki gösteren sadece eser miktarda protein ya da peptit olduğunu ortaya koydu (Şekil 3). Demir alımı ve protein analizinden oluşan bu fraksiyonasyon deneyi, tutarlı bir şekilde Şekil 3’de gözlenenlere benzer bir artırıcı etki ve protein düzeyinin görülmesiyle sayısız kereler tekrarlandı.
Yukarıdaki aktif fraksiyonların % 0.1 TFA’lı (v:v) suda ACN gradyanıyla (%0-60) bir C18 proteini ve peptit kolonuna injekte edilmesi ortaya çeşitli pikler çıkardı. Piklerin her biri toplandı ve radyoaktif etiketli demir alımı yöntemi kullanılarak Caco-2 hücreleriyle test edildi, bu hücrelerde aktivitenin “injeksiyon pikinde” kaldığı bulundu (veri gösterilmemiştir). İnjeksiyon pikini daha da ayrıştırmak için toplanan injeksiyon piki daha düşük bir akış oranında ACN gradyanı olmadan aynı kolona yüklendi (Şekil 4). Kromatogramda dört fraksiyon [2 farklı fraksiyon (F_R-1 ve F_R-2) ve yakından ayrıştırılan 2 fraksiyon (F_R-3 ve F_R-4)] görüldü (Şekil 4). Demir alım sonuçları F_R-1’de injeksiyon pikinin hala %430 oranında artırıcı etki gösterdiğini ortaya koydu; ama diğerlerinde aktivite yoktu (Şekil 4). Peptitlerin neredeyse hepsi ters-evre C-18 kromatografisi yoluyla biraz tutulma gösterdiğinden, bu gözlem artırıcı faktörün bir peptit olmadığına dair ek kanıt sağlamıştır.

Şekil 3 Tipik bir radyoaktif etiketli demir alım tarama deneyi ve balık Sephadex G-25 fraksiyonlarından (F_S-1 – 22) elde edilen protein konsantrasyonlarının sonuçları. Tüm alım çözeltileri demir kaynağı olarak 10 µmol/L FeCl₃ içerecek şekilde hazırlandı. Kontrol alım çözeltisi (kesikli çizgi) sadece 10 µmol/L FeCl₃ içerdi. Askorbik asit ile FeCl₃ içeren alım çözeltileri (Fe:AA =1:20) pozitif (AA) kontrolü olarak kullanıldı. Alım düzeyleri başlangıç kontrol değerinin fraksiyonları olarak ifade edildi. Protein ürünlerinlerin ayrışması Bio-Rad DC protein test kitinin yarı-mikro bir uyarlamasının kullanımıyla fraksiyonlarda toplam protein ölçümü yoluyla belirtildi.
Şekil 4 RP-HPLC ile toplanan 4 fraksiyondan (F_R-1, 2, 3 ve 4) Caco-2 hücresi demir alımının ölçümü (A). Toplanan fraksiyonlar 300 µL’lik 0.01 mol/L HCl çözeltisinde yeniden oluşturuldu. Tüm alım çözeltileri demir kaynağı olarak 10 µmol/L FeCl₃ içerecek şekilde hazırlandı. FeCl₃ ve fraksiyonsuz askorbik asitli FeCl₃ (Fe:AA = 1:20) içeren alım çözeltileri sırasıyla başlangıç ve (kesikli çizgi) ve pozitif (AA) kontrolleri olarak kullanıldı. Ekli şekil (B) balık Sephadex G-25 fraksiyonasyonundan hazırlanan orta-fraksiyonların (F_S-10, 11) tipik bir RP-HPLC kromatografisini vermektedir. Değerler ± SEM olarak verilmiştir, (AA ve F_R-1’de n=4; F_R-2, 3 ve 4’de n= 2). *Başlangıç kontrolünden farklıdır, P < 0.05.

Aktif fraksiyonların amino asit profili. Amino asit analizi RP-HPLC’den toplanan F_R-1 üzerinde yapıldı. Ayrışma profili turlar arasında farklılık göstermediğinden, analiz için çeşitli turlardan toplanan örnekler biraraya getirildi. Yapılan analizde örneğin sadece 2.2 g/100 g’ının proteinler ya da peptitlerden türediği ortaya kondu, bu da aktif unsur ya da unsurların peptit(ler) olmadığını gösterdi. < 0.1 µmol/g konsantrasyonlarda aşağıda belirtilen amino asitler vardı: Arg, Asx (yani, Asp + Asn), Glx (yani, Glu + Gln), His, Ala, Ile, Val, Cys (disülfit olarak tespit edilmiş, serbest tiol olarak bildirilmiştir), Gly, Ser, Thr ve Tyr. Aşağıdaki amino asitler ise > 0.1 µmol/g düzeylerinde tespit edildi: Lys (0.32 µmol/g); Leu (0.33 µmol/g); Met (0.44 µmol/g; Phe (0.25 µmol/g); ve Pro (2.19 µmol/g).
Aktif fraksiyonların HPAEC-PAD purifikasyonu. Bu bulgulara uygun olarak, HPAEC-PAD’ı bir CarboPac PA1 kolonuyla kullanarak bir önceki RP-HPLC purifikasyonundan elde edilen aktif pikin daha da ayrıştırılmasına karar verildi. Kromatogram 0-3 dk, 3-10 dk ve 10-30 dk olmak üzere 3 bölüme ayrıldı ve her bölüm toplandı (Şekil 5). Mobil evreyi tuzsuz hale getirmek için fraksiyon toplayıcıdan önce in-line AMMS kullanıldı. Tuzsuzlaştırma aşamasının ardından, çoklu HPAEC-PAD turlarından toplanan ve biraraya getirilen 3 bölüm Caco-2 hücreleriyle radyoetiketli bir demir alım testine tabi tutuldu ve sadece ikinci bölüm radyoetiketli demir alımında anlamlı artış gösterdi (veriler gösterilmemiştir). Bu sonuca bağlı olarak, HPAEC-PAD kromatogramlarının ikinci bölümündeki F_H-1, F_H-2 ve F_H-3 etiketli 3 önemli pik toplanıp, yukarıda açıklandığı gibi tuzdan arındırılmıştır. Tablo 1 üç pikin demir alım tarama testi sonuçlarını vermektedir. Tarama sonucu F_H-1 ve F_H-2’nin sadece demir içeren kontrolden sırasıyla 1.7 ve 1.9 kat daha fazla etki gösterdiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, F_H-3’ün etkisi de kontrolden 4.2 kat daha fazlaydı. Tablo 1’de Caco-2 hücresi demir alım deneyi her bir fraksiyonun kısıtlı miktarı nedeniyle HPAEC-PAD’dan toplanan saflaştırılmış fraksiyonlar üzerinde sadece bir kez yapılmıştır. Ancak, bu gözlem tavuk kaslarından elde edilen saflaştırılmış fraksiyonlar kullanılarak ek bir Caco-2 hücre testiyle teyit edilmiştir (Tablo 1). HPAEC-PAD fraksiyonasyonu tekrarlanarak yukarıdaki gibi balık etinden izole edilen F_H-1 ve F_H-2 kombinasyonu olan ve kontrolden (tek başına demir) 3.4 kat daha fazla etkiye sahip olan bir örnek (> 1mg) sağlanmıştır.


Şekil 5 RP-HPLC purifikasyonundan toplanan balık (A) ve tavuk (B) fraksiyonunun HPAC-PAD’ı. Aktif fraksiyonlar (yani, F_R-1) yarı-hazırlayıcı bir CaroPac PA1 (9 mm i.d) kolona injekte edildi ve 3 mL/dk’da 100 mmol/L NaOH ile ayrıştırıldı. Pikler (yani, F_H-1, F_H-2 ve F_H-3) toplandı ve daha sonra fraksiyon saflığını belirlemek için analitik bir CarboPac PA1 kolonuna (4 mm i.d.) yeniden injekte edildi (panel A’daki ek şekil).

Aktif fraksiyonların NMR analizi. Yapılan ön NMR analizi demir alım etkisine sahip fraksiyonların heparin-benzeri glikozaminoglikanlardan (HLGAG’lar) çıktığını gösterdi. 3.4 kat daha yüksek demir alım etkisine sahip F_H-1/ F_H-2 örneği 9.12 Hz eşleşme sabit (³J_H,_H) değeriyle 7.817 ppm’de bir multiplet ortaya çıkardı. Bu kimyasal dönüşüm ve eşleşme sabiti de-N-sülfatlı, re-N-asetilatlı heparin için bildirilen NH değerleriyle (7.82 ppm, 9.40 Hz) uyum içerisindedir (37). Buna karşın, F_H-1/ F_H-2 örneğinin anomerik proton kimyasal dönüşümü (5.234 ppm) de-N-sülfatlı, re-N-asetilatlı heparin için bildirilen N-asetil-glukozamin değeriyle (5.11 ppm) uyuşmaz. F_H-1/ F_H-2 örneğinin anomerik proton kimyasal dönüşümü trisülfatlı heparinin α-L-iduronik asit kalıntısı için bildirilene (5.22 ppm) yakındır (37). Ancak, F_H-1/ F_H-2 örneğinin anomerik proton kimyasal dönüşümü için bizim ölçtüğümüz ³J_H,_H değeri 3.9 Hz’ydi ve trisülfatlı heparinin iduronik asit kalıntısının anomerik protonu için bildirilen ³J_H,_H = 2.9 Hz’den daha yüksekti (37). F_H-1/ F_H-2 anomerik protonunun HLGAG’ların monosakarit bileşenleri olan 6-O-sülfatlı, N-asetil-glükozamin ya da disülfatlı-glükozaminle (5.24 ya da 5.25 ppm ve ³J_H,_H = 3.5 Hz) daha yakından ilişkili olduğu görülmüştür. F_H-1/ F_H-2 örneği ile aynı zamanda toplanan F_H-3 örneğinin 7.402 ppm’de geniş bir doublet’i, 2.081 ppm’de asetil protonu ve 4.643 ppm’de tek bir anomerik protonu vardı (ß-konfigürasyonu). Kontrolden (ilk HPAEC-PAD frraksiyonasyonu) 4.2 kat daha fazla demir alım etkisi bulunan F_H-3 örneği nanoprobe yapılmadan önce NMR ile analiz edildi; bu yüzden, spektral çözünürlük iyi değildi. Ancak, 2 boyutlu bir NMR heteronükleer çoklu bağ korelasyon (HMBC) deneyi 8.09 ppm (¹H) ile 171.23 ppm (¹³C)’deki kimyasal dönüşümler arasında korelasyon olduğunu ortaya koydu. Bu örnekte ayrıca spektrumlarda 2.01 ppm’de bir asetil proton da gözlendi. Mulloy ve ark. (37) 6-O-sülfatlı, N-asetil-glükozamin için kimyasal dönüşümlerin sırasıyla 8.13 ppm (NH) ve 177.30 ppm (asetil CO) olduğunu bildirdi, bu durum HMBC bulgularını açıklayabilir. Bu da demir alımı etkisine sahip fraksiyonların HLGAG’lardan türediğine başka kanıtlar sağlamaktadır.
TARTIŞMA
Et faktörü(lerini) saptayabilmek için son 30 yıldır sayısız çalışma yapılmış bulunmaktadır; ancak bu etkiye etki eden et etkisi mekanizması(ları) ve faktörü(leri) tam olarak belirlenenememiştir. Bu çalışmada kullanılan fraksiyonasyon ve izolasyon koşulları birçok bilim adamının et faktörünün özelliklerini belirlemeye çalışırken yaşadığı çeşitli güçlükleri aşacak şekilde tasarlanmıştır.
Hem-içeren ve –içermeyen demir içeriğinin yüksek olması nedeniyle kas dokusunun genelde iyi bir demir kaynağı olduğu düşünülmektedir. İntrinsik hem-içeren demirin pişirme sırasında porfirin halkalarından salınan hem-içermeyen demire parçalanması olasıdır (38). Bu nedenle, pişirme ve sindirimle hazırlanan et örneklerinin yüksek düzeyde hem-içermeyen demir içermesi beklenmektedir (6), bu durum intrinsik demir kontaminasyonu nedeniyle sonuçların yorumlanmasında güçlük çıkarabilir. Bu çalışmada toplam demir konsantrasyonu nispeten düşük olduğundan balık kas dokusu kullanılmıştır; bu nedenle balık kası fraksiyonlardaki demir seviyelerini kontrol edecek minimum intrinsik demir konsantrasyonuyla yeterli bir kas dokusu ve tahminen et faktörü(leri) kaynağı işi görmüştür.
Daha önce sığır (12,17,39) ya da tavuk (12,18,39,40) kullanarak yapılan et faktörlerini belirleme çalışmalarının çoğunda her bir işlemde farklı miktarlarda demir içerilmiş olabileceğinden bulguların yorumlanmasını güçleştirebilecek intrinsik demir kontaminasyonu göz ardı edilmiştir. İntrinsik demirin katkısını belirlemek için işlem boşlukları (ekstrinsik demir kaldırıldı) hazırlanmasına rağmen, farklı demir konsantrasyonları demirin bulunabilirlik yüzdesinde farklılıklara neden olabilir. Başka bir deyişle, demir alım yüzdesinde gözlemlenen artış potansiyel olarak işlemlerdeki farklılığa değil, daha düşük demir konsantrasyonuna bağlanabilir (4,17,41). Buna ek olarak, bu çalışmada balık asit özütü tam balık kası dokularından (12,18,39,40) çok, et faktörünü(lerini) izole etmek için başlangıç malzemesi olarak kullanıldı; bu aynı zamanda hem-içeren demirin asidik pH’deki çözünürlüğü oldukça düşük olduğundan hem-içeren kontaminasyonu dışarda bırakmaya da yardımcı oldu (42). Ayrıca, daha önce yapılan birçok çalışmada et faktörünün etteki intrinsik demirle ilişkili olduğu öne sürülmüştür (43-46). Bu yüzden, etteki demirin konsantrasyonu ve dağılımı radyoaktif etiketleme ve eti fraksiyonlama yoluyla belirlenmeye çalışıldı. Ancak, et etkisinin birincil unsuru yemeklerden ekstrinsik demirin emilimini sağlamaktır (1,2,15,47). Bu çalışmada minimum demir kontaminasyonuna sahip kas dokusu hazırlayarak aktivitesi olan fraksiyonları takip etmeye çalıştık, yani etteki demiri takip etmedik. Bu yaklaşım verilerimizin yorumlanmasında ortaya çıkabilecek güçlükleri etkin bir şekilde bertaraf etti.
Çalışmamızın başka önemli bir özelliği de sindirim koşullarını sindirim enzimleri olmaksızın basitleştirebilmiş olmamızdı. Et faktörlerini izole etmek için yapılan önemli sayıda deneme sindirim enzimi içeren bir in vitro sindirim yöntemine dayalıydı (17,40). Bu olgularda etten sindirim enzimlerinin kontaminasyonunu uzaklaştırmak güçtü. Şekil 1 ve 2’deki bulgular Fe ile Fe/Balık arasında ferritin oluşumu açısından anlamlı bir farklılık olmadığını göstermektedir, bu da balığın 1 saat süreyle pH 7.0’da inkübe edildiğinde hem-içermeyen demir alımı üzerinde artırıcı etkisinin olmadığını ortaya koymaktadır. Bu gözlem sığırın demir emilimi-artırıcı unsurunun su özütünde var olmadığını belirten daha önceki bulgularla uyuşmaktadır (2). Şekil1’de aynı zamanda pepsin ve pankreatin-safra eklenmesinin (Fe/Balık Pep ve Fe/Balık Pep/PB) ferritin oluşumunu Fe/Balık pH 2.0’a kıyasla anlamlı oranda artırmadığı gösterilmiştir, bu da balığın hem-içermeyen demir alımı üzerindeki artırıcı etkisinin temelde balık kası dokusunun pH 2.0’da 1 saat süreyle demirle inkübasyonundan kaynaklandığını açıkça ortaya koymuştur. Bu gözlem et faktörü(leri) izolasyon işlemlerini daha da karmaşık hale getirebilecek pepsin ve pankreatin-safra eklemeye gerek kalmadığından özellikle faydalı bir gözlemdir. Şekil 1 ve 2’in bulgularına dayanarak özde hepsi olmasa da en azından bazı et faktörlerinin balık örneğini 1 saat süreyle pH 2.0’de inkübe ettikten sonra olması gerektiği düşünülmüştür. Bu yüzden, balık kası dokusu asidik koşullar altında (1 saat süreyle pH 2.0) sindirim enzimleri olmaksızın sindirildi ve asidik besinin üst fazı et faktörü izolasyon işlemlerinin başlangıç malzemesi olarak kullanıldı.
Et faktörüyle ilgili olarak daha önce yapılan çalışmalarda yukarıdaki bulgularla çelişkili bazı sonuçlara rastlanabilir. Örneğin, eklenen demirin çözünürlüğünün sadece asitte-çözünmeyen fraksiyonla anlamlı oranda arttığı bildirilmiştir (18). Buna karşın, bizim elde ettiğimiz bulgularla Slatkavitz ve Clydesdale’inkiler arasındaki farklılık demirin çözünürlüğünün biyoyararlanılabilir demirin iyi bir göstergesi olamayacağına dair elde edilen azımsanmayacak sayıdaki kanıtla kolayca açıklanabilir (17,31,48). Şekil 2’deki bulgular ayrıca toplam çözülebilir demirin, demirin bulunabilirliğini göstermediğini açıkça ortaya koymaktadır. Örneğin, ph 2.0’da demirle inkübe edilen balık içeren özde balıksız özden (Fe/pH2) %72 daha az toplam ve %69 daha az çözülebilir demir vardı; hücrelerdeki ferritin düzeyleri yine de >%450 daha büyüktü, bu da demirin çok daha fazla olduğuna işaret ediyordu. Şekil 1’de de benzer etkiler gözlendi, diyalizabl demir (yani, alt odacıktaki Fe) ferritin değerleriyle korelasyon içinde değildi.
Bu yaklaşımın diğer et faktör çalışmalarına göre başka bir avantajı da asidik pH’de fraksiyonasyonda bulunabilir. Balık örneğinin asit özütü elde edilir edilmez, örnek çözeltiler demir alım süresi öncesinde pH 2.0’de asidik durumda saklandı. Ayrıca, tarama deneyleri için fraksiyonasyon ve örnek hazırlamadan oluşan tüm izolasyon aşamaları asidik ortam koşullarında gerçekleştirildi. Asidik durum et faktörü(lerinin) hem-içermeyen demirle etkileşime girip, demir alımı üzerindeki artırıcı etkisini koruyabileceği gastrik bir ortamı uyarır. Örneğin, AA hem-içermeyen demirin azaltıcı ve/veya kıskaçlayıcı etkilerinden dolayı güçlü bir hem-içermeyen demir emilimi artırıcıdır. Buna karşın, ferrik demirin AA’yla ancak pH değeri < 6.0 olduğunda kolayca azaltılabileceği bilinmelidir (49). Ayrıca, gıdaların demirle ilk etkileşiminin midenin düşük pH’inde olmasının demirin biyoyararlanımını belirleyen kritik faktörler olduğu genelde kabul edilmektedir (50). Yaptığımız ön deneyler AA’nın eklenip, demirle nötr pH’de inkübe edildiğinde Caco-2 hücrelerinde demir alımını artırmadığını göstermiştir, bu da AA ve et faktörü gibi demir alımı artırıcıların etkisini yaratma ve koruma konusunda düşük pH’in önemini açıkça belli etmektedir.
Düşük pH’in demir emiliminde rol oynadığı gözleminin ilginç fizyolojik göstergeleri bulunmaktadır. Bir nesnenin yenmesi gastrik asit salgısını harekete geçirir; ancak yenme sonrasında genel gastrik PH yemekte bulunan besinlere bağlı olarak tipik bir şekilde 1-2 pH’den 4.5-6 pH’a çıkar (51, 52). Gastrik pH 60 dakika içerisinde yeme öncesi değerlerine dönmeye başlayarak, yemeğin yenmesinden sonraki 2 saat içerisinde 2-3 pH değerlerine ulaşır (51,52). Kuşkusuz gastrik pH’deki geçici yükselme yemeğin tamponlama kapasitesinden kaynaklanmaktadır. Gastrik lümendeki yemek parçaları, büyük bir olasılıkla peristaltik karışım öncesi, özellikle mide duvarı boyunca asit salgılamasına en yakın olanlar, geçici düşük pH anları yaşayacaktır. Bu anların demir çözünebilirliği ve demirin besin bileşenleriyle etkileşiminden en çok sorumlu olan anlar olduğunu varsayıyoruz. Aklorhidri çoğunlukla demir eksikliği anemisiyle bağlantılıdır (22,23); bu yüzden yeterli demir çözülebilirliği sağlamak ve bu şekilde bağırsaklarda demir emilimi olasılığına olanak sağlamak için belli düzeyde asit salgılanması gerekli olabilir.
Boyut dışlamalı kromatografi en yaygın kullanılan ayrıştırma tekniklerinden biridir. İlk fraksiyonasyon aşaması için Sephadex G-25 resini (fraksiyonasyon aralığı ~1000-5000 Da) seçilmiştir çünkü proteolitik sindirim sırasında salınan küçük peptitlerin “et faktörü” adaylarından biri olduğu düşünülmüştür (18,53). Şekil 3’deki bulgular Caco-2 hücrelerinde radyoaktif etiketli demir alımının 7 ila 9 kat artışından proteinlerin sorumlu olmadığını ve aktif faktörlerin düşük-moleküler-ağırlıklı bileşik(ler) olduğunu göstermektedir. Etin protein içermeyen unsurlarının hem-içermeyen demir alımını artırdığından bahseden çok az sayıda rapor olduğundan bu bulgular oldukça ilginçtir. Carpenter ve Mahoney (25) sindirilen ya da sindirilmeyen etten elde edilen düşük-moleküler-ağırlıklı (<6000 – 8000 Da) homogenatların çözülebilir demiri artırdığını, bunun da demirin çözülmesi için etin proteolitik sindiriminin gerekli olmadığını gösterdiğini buldu. Onların elde ettiği bu bulgulara dayanarak, et faktörünün(lerinin) protein-dışı, düşük-moleküler-ağırlıklı bir bileşik(ler) olmasının olası olduğu varsayıldı.
Şekil 4’de F_R1’in tutulma süresi ~6 dk idi, bu da protein ve peptitler normalde bu kromatografik koşullar altında daha geç (>6 dk) ayrıştığından (Enslow, W. şahsi görüşme) bizim fraksiyondaki et faktörünün(lerinin) ne protein ne de peptit olmadığı şeklindeki varsayımınızı bir kez daha desteklemektedir. Buna ek olarak, bu bulgu F_R1’de ihmal edilebilir miktarda amino asit olduğunu gösteren amino asit analiziyle de teyit edildi. Bu durum özellikle şaşırtıcıydı çünkü söz konusu bulgu sistein (3,19,20,29,54) ve histidinin (17,29,54) hem-içermeyen demirin biyoyararlanımını en çok artıranlar arasında olduğunu ortaya koyan daha öncekilerle çalışmalarla uyumlu değildi.
Yukarıdaki bulgular balık asit özütünden izole edilen faktörün protein ya da peptitler olmadığını açıkça gösterdiğinden, aktif fraksiyonların karbonhidrat içerip içermediğini saptamak amacıyla bir test yaptık. Karbonhidratlarla ilgili tipik bir kolorimetri testi olan fenol-sülfirik asit testi kullanıldığında aktif fraksiyonumuz olan F_R1’de pozitif sonuçlar elde edildi (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, özellikle karbonhidrat analizi için HPAEC-PAD kullanarak Dionex sistem düzeninden faydalandık (55,58). C18 RP-HPLC’den elde edilen F_R1’in HPAEC-PAD analizi bulguları F_H-1, F_H-2 ve F_H-3 olarak etiketlenen 3 önemli pikin ayrıştırıldığını gösterdi (Şekil 5). Demir alım bulgularından (Tablo1 ) ayrıştırılan bileşiklerin 3’nün de, özellikle F_H-3’ün hem-içermeyen demir alımını artırdığı anlaşılmaktadır. Buna ek olarak, Sephadex G-25 boyut dışlamalı kromatografi, RP-HPLC ve HPAEC-PAD purifikasyonunun yanısıra Caco-2 hücreleriyle demir alımı (Tablo 2) verilerinin aynısı tavuk kas dokusuyla elde edilmiştir. Bu gözlem faktörlerin balık kasına has olmadığını, diğer etlerde de bulunduğunu göstermektedir.
NMR verileri toplu olarak ele alındığında et faktörünün aktif bileşenlerinin HLGAG’ların düşük-moleküler-ağırlıklı karbondihrat (yani, oligosakaritler, disakarit ve monosakarit) degredasyon ürünleri olduğunu ortaya koymaktadır. Bu polisakaritlerin yapısı çok karmaşık olup, 3 pozisyona kadar O-sülfatlanabilmenin yanısıra N-sülfatlı ya da N-asetilatlı olabilecek bir α-D-glükozamine 1-4 bağlı 32 farklı olası üronik asit kombinasyonundan (α—L-iduronik asit ya da ß-D-glükuronik asit) oluşmaktadır (59). Bu yüzden, farklı HPAEC-PAD fraksiyonlarının farklı düzeyde sülfatasyon ya da farklı üronik asitlere sahip HLGAG’lardan oluşması olasıdır. Üç HPAEC-PAD pikinin hepsi demir alım aktivitisine sahip olsa da, HLGAG’ın fiili yapısının optimum demir alımı aktivitesiyle ayrıştırılması ileride yapılacak yayınların konusu olacaktır.
Bu çalışmada izole edilen et faktörlerinin asidik sindirim koşulları altında iskelet kaslarındaki hücredışı matriksten salındığını ve demir alımını bağırsaklardaki epitelyal hücrelerle artırdıklarını düşünüyoruz. İskelet kasında hücrelerin dışında yerleşik düzenli bir yapı olan, hücreler tarafından üretilen proteinler ve polisakaritlerden oluşan hücredışı matriks yer alır (60). Hücredışı matriksin önemli bileşenlerinden biri olan proteoglikanlar bir ya da daha fazla sayıda glikoaaminoglikan zincirinin bağlı olduğu merkezi bir çekirdek protein içerir. Pişirilmiş balık örneğine yaptığımız asidik işlemle protein sindiriminin yeterli olması olası değildir çünkü özde proteolitik sindirim enzimi yoktu. Protein sindiriminin %10-20’si pepsinin etkisi ve protein sindiriminin büyük bir çoğunluğunun bağırsakta olması nedeniyle midede oluştuğundan (61), sindirim enzimleri içermeyen sindirim koşullarımızın protein hidrolizini katalize etmeyeceğini iddia ediyoruz. Buna ek olarak, pepsin sindiriminin önemli özelliklerinden biri de diğer sindirim enzimlerinden fazla etkilenmeyen protein kolajenini sindirebilme yeteneğidir (61). Kolajen, etlerin hücrelerarası bağ dokularının önemli bir bileşenidir; bu yüzden, kolajen fiberlerinin sindiriminin sindirim enzimlerinin hücresel et proteinlerinin sindirimi için dokuya girmesini kolaylaştırması olasıdır. Sonuç olarak, pepsin aktivitesi olmadan yapılan asidik işlem balık örneğini iyi bir şekilde sindirmeyebilir. Bu yüzden, kısmen parçalanmış glikozaminoglikanlardan çıkan oligosakaritlerin asidik koşullar altında hücredışı matriksten kolayca çıkabileceği ve serbest kalan karbonhidratların demirle etkileşime geçerek, daha fazla demir alımına neden olabileceği varsayımında bulunabiliriz. Bu asidik koşullar altında kas proteinleri/peptitlerin çoğunlukla aynı kalması olasıdır, bu da sindirimin nispeten yumuşak koşullarını gösterir.
Şekil 2’deki bulgular et ile hem-içermeyen demir bulunabilirliğinin artırılmasında yer alan mekanizmayla ilgili bazı değerli ipuçları verebilir. Elde edilen bulgular etin artırıcı etkisinin ferröz demir miktarının artmasından kaynaklanmadığına işaret etmektedir. Bu nedenle, AA’nın tersine, balığın ferrik demiri daha fazla bulunan ferröz duruma indiregeyerek demir alımını artırdığı görülmemektedir. Etin tahminen ferrik demiri ferröz forma indirgeyebilecek sistein gibi faktörler nedeniyle bağırsak lümeninde daha fazla bulunabilir ferröz demir yaratarak hem-içermeyen demiri artırdığı öne sürüldüğünden bu bulgular ilginçtir (19). Yemeklerle birlikte sistein tüketilmesi insanlarda yaklaşık 2 katı demir alımı sağladı, ama büyük bir olasılıkla pişirmek sisteini sistine okside ettiğinden yemeden önce yemekle karıştırılıp, pişirildiğinde bir etki yaratmadı (19,20). Bizim balık örneğimiz sindirim öncesinde pişirildi; bu nedenle faktörlerin bir dereceye kadar pişirilmeye dirençli olduğu ya da pişirme süreci sırasında ortaya çıktıkları görülmektedir. Bu yüzden, indirgeme bileşikleri genelde yüksek sıcaklıklarda stabil olmadıklarından faktörün bir indirgeme maddesi olması olası değildir. Ayrıca, et faktörünün(lerinin) lüminal yüzeyde nakil amaçlı mevcut bulunan çözülemeyen ferrik demiri demir taşıyıcısı ya da başka bir mekanizma yoluyla bağırsaklardaki mukoza hücresine dönüştürmeye yaraması olasıdır. Yakın zamanda Simovich ve ark. (62) demir taşıyıcısının (yani, divalent taşıyıcı-1 ve mobil ferrin) büyük bir oranının hücredışı olarak lüminal müsinle (bağırsaklardaki goblet hücreleri tarafından üretilen glikosilatı yüksek moleküller) bağlantılı olduğunu ve müsinin yüzey alanını artırıp, başka türlü emici yüzeyin ötesine geçebilecek olan temel besleyici maddeleri yakalamak için lüminal boşluğa yayılabileceğini bildirdi. Buna bağlı olarak, et faktörü(leri) Caco-2 hücre sistemimizde müsin gibi hareket edip, hücrelerin daha fazla demiri, büyük bir olasılıkla başka türlü demir taşıyıcısına ulaşmayacağı, çözünemeyen ferrik demiri almasına olanak sağlayabilir. Ayrıca, insan sütünden bebeklere geçen demirin biyoyararlanımı fraksiyonel açıdan inek sütününkinden daha fazladır. İnsan sütünde inek sütüne kıyasla demir biyoyararlanımının daha fazla olmasından sorumlu faktör(ler) her ne kadar henüz saptanamamış olsa da, insan sütündeki artırıcı faktörün temel olarak düşük-moleküler-ağırlıklı kesik süt suyu fraksiyonunda (<10 kDa) bulunduğuna dair kanıt mevcuttur, bu fraksiyon insan sütü oligosakaritlerinin çoğunu içerebilir (63). Belki de bu oligosakaritler de demir alımı yapmaktadır, bu da insan sütünde yüksek fraksiyonel demir emilimi olduğunu açıklayacaktır.
Sonuç olarak, bu çalışma “et faktörü” araştırmaları konusunda farklı bir yaklaşım sunmaktadır. Kas dokusunun demir alımı üzerindeki geliştirici etkisinin midenin düşük pH koşulları tarafından başlatıldığını gözlemledik. Bu gözlem etteki faktörün(lerin) saptanmasını güçleştiren çeşitli engelleri etkin bir şekilde ortadan kaldırabilir. Aktif bileşiklerin yapısal temeli belli olmasa da, söz konusu bulgularımız caco-2 hücrelerinde hem-içermeyen demir alımının artışından kas dokusunun düşük-moleküler-ağırlıklı karbonhidratlarının sorumlu olduğunu güçlü bir şekilde ortaya koymaktadır. Aktif bileşiklerin yapısını belirlemek ve bileşiklerin hem-içermeyen demir emiliminin artırılmasında nasıl bir rol oynadığını araştırmak amacıyla başka çalışmalar yapılmaktadır. Bu çalışmalar son 35 yıldır gizemini koruyan “et faktörü”nde yer alan mekanizma(lar) konusunda değerli bilgiler sağlayabilir.

Kullanılan kısaltmalar: AA, askorbik asit; ACN, asetonitril; AMMS, anyon mikro-membran supresör; FBS, fetal bovine serum; F_H-1, HPAEC-Pad fraksiyonu; F_R , C18 RP-HPLC fraksiyonu; F_S , Sephadex G-25 fraksiyonu; HLGAG, heparin-benzeri glikozaminoglikan; HMBC, heteronükleer çoklu bağ korelasyonu; HPAEC-PAD, puls amperometrik detektörlü yüksek performanslı anyon-değişim kromatografi; RP-HPLC, ters-evre HPLC; TFA, trifluoroasetik asit.

Referanslar: