Predgovor

---

Oznaka: 0098092
GENSKO LIJEČENJE TUMORA KOREKCIJOM TUMOR-SUPRESORSKIH GENA

TUROM GENE THERAPY – CORRECTION OF ONCOSUPPRESSOR GENES
Voditeljica projekta: dr. sc. Jasminka Pavelić

Tel. ++385 1 4560 926   e-mail: [e-mail]

Suradnici
Silva Hećimović, doktorica biol. znanosti, znanstvena suradnica
Maja Herak Bosnar, doktorica biol. znanosti, znanstvena suradnica od 7.4.2005.
Jelena Knežević, magistrica biol. znanosti, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju asistentice
Marijeta Kralj, doktorica biol. znanosti, znanstvena suradnica
Tanja Matijević, dipl. ing. biologije, znanstvena novakinja u suradničkom zvanju asistentice
Jasminka Pavelić, doktorica biol. znanosti, znanstvena savjetnica
Neda Slade, doktorica biol. znanosti, znanstvena suradnica
Ranko Stojković, doktor vet. znanosti, znanstveni novak u suradničkom zvanju višeg asistenta
Lidija Šuman, doktorica biol. znanosti, znanstvena suradnica

Program rada i rezultati na projektu:

Tijekom 2005. godine nastavljena su istraživanja genskog liječenja upotrebom supresorskih gena p53 i p21. Mehanizam inhibicije proliferacije stanica tumora (in vitro) zaraženih sa spomenutim terapeutskim genima osniva se na pokretanju programirane stanične smrti, apoptoze. Učinkovitost gena p53 i p21CIP1/WAF1dokazana je i in vivo. Stanice tumora miševa Renca zaražene spomenutim vektorima uštrcane su potkožno u nogu miševa. Kao kontrola korištene su nezaražene stanice. Stanice tumora bubrega zaražene s Ad-p53 i Ad-p21 nisu razvile tumorsku masu, dok su one zaražene s kontrolnim vektorom, kao i nezaražene stanice, razvile tumor. Također, intratumoralno injiciranje vektora Ad-p53 i Ad-p21 dovelo je do statistički značajne inhibicije rasta tumora u odnosu na učinak kontrolnog vektora ili samog pufera. Posebno je zanimljiv jači inhibitorni učinak gena p21 od gena p53 u stanicama miša, što je u suprotnosti s rezultatima dobivenim na stanicama čovjeka.

Gen p73. Različite izoforme proteina p73 imaju potpuno različite funkcije. Istraženo je da li razlike u N-, odnosno C-kraju proteina p73 utječu na njegovu stabilnost. U ekspresijske plazmide za različite izoforme p73 ukloniran je biljeg Flag tag. Potom su plazmidom transfecirane stanice H1299 (nemaju divlji tip gena p53). Metodom pulse chase određen je poluživot proteina različitih izoformigenap73 (TAp73, Ex2Delp73, Ex2/3Delp73 iDNp73, svi u a i b varijanti). Ustanovljeno je daDNp73 a ima najdulji poluživot (4 satauodnosunaostale, poluživota 45 minutado 2 sata). To je potvrđeno i za endogene proteine u stanicama RKO koje imaju relativno visoku endogenu razinu ekspresije proteina p73a. Prethodno je metodom ko-imunoprecipitacije dokazana fizička interakcija, odnosno formiranje heterotetramera između anti-onkogenih i onkogenih izoformi (TAp73-tumorsupresorskigen, iDNp73-onkogen). Luciferaznim testom potvrđeno je da je DNp73 dominantnonegativniinhibitortranskripcije i TAp73 i p53. Međutim, kad su DNp73 i TAp73 kotransfecirani, dolazi do značajne stabilizacije TAp73a i b proteina, što je dokazano na stanicama H1299, U20s i Phoenix. Značajna stabilizacija potvrđena je i u tet-inducibilnim stanicama (Hela tet-on i SaOs-2 tet off) koje imaju stabilno transfeciran DNp73a pod kontrolom tetraciklinskog promotora. Koristeći proteine s mutacijom u tetramerizirajućoj domeni, nađeno je da sposobnost tetramerizacije uvelike ovisi o sposobnosti stvaranja tetramera i u korelaciji je s funkcijom inhibitoraTAp73. Dakle, premdajeDNp73 dominantno negativni inhibitor TAp73, ustvar i istovremeno i i naktivira i stabilizira TAp73 stvaranjem heterotetramera.

Nadalje, rađena je opsežna klinička studija i pokazana je pojačana ekspresija (mRNA, real timePCR ) DNp73 u95% uzoraka karcinoma jajnika čovjeka u usporedbi s ekspresijom u normalnim tkivima. U trećini tumora također je nađena i povišena ekspresijaTAp73. Međutim, dominantno negativni oblicigena(DTAp73) doprinose pojačanoj ekspresijiTAp73, ali ga funkcionalno inhibiraju.

Nastavljeni su i pokusi utvrđivanja uloge gena nm23 u nastanku tumora glave i vrata. U svrhu istraživanja genskog liječenja manipuliranjem s genom nm23 umnoženi su konstrukti pcDNA3 s cDNA odsječkom gena nm23-H1 i nm23-H2 te nm23-H1 s mutacijom u aktivnom mjestu enzima. Odsječci cDNA navedenih gena subklonirani su u vektor EGFPC3 koji sadrži gen za zeleni fluorescentni protein i pyRedC1 koji sadrži gen za crveni fluorescentni protein. Time su dobiveni konstrukti s fuzijskim genima koji nakon transfekcije omogućuju praćenje smještaja novonastalog fuzijskog (fluorescentnog) proteina u stanici. Transfekcija spomenutim konstruktima provedena je na staničnim linijama tumora glave i vrata čovjeka različitog stupnja diferenciranosti i invazivnosti: Hep-2, CAL 27, CAL 33 i CAL 166. Fuzijski proteini detektirani su u citoplazmi, i u ponekim jezgrama u stanicama koje se nalaze u kasnoj fazi G1 te u G2/M fazi staničnog ciklusa. Time su po prvi puta i vizuelno potvrđena predviđanja da proteini Nm23-H1 i Nm23-H2 imaju neku funkciju u jezgri. Utjecaj pojačane ekspresije gena nm23-H1 i nm23-H2 na proliferaciju stanica tumora glave i vrata proučena je uz pomoć protočne citometrije. Analizom staničnog ciklusa stanica Hep-2 i CAL 33 nakon transfekcije konstruktima pEGFPC1-nm23 ili pak kotransfekcije konstruktima pcDNA3-nm23 i pEGFPC1 utvrđeno je da oba gena stimuliraju proliferaciju navedenih stanica u kulturi.

Research programme and results:

During the year 2005 we proceeded with the experiments in tumor gene therapy by exploring the therapeutic suppressor genes p53 and p21. The inhibition of tumor cells proliferation in vitro was caused by programmed cell death (apoptosis). The activity of p53 and p21^CIP1/WAF1 genes was also proven in vivo. Murine Renca tumor cells transfected with therapeutic genes were not able to develop tumor mass, opposite than control nontransfected cells. In addition, intratumoral injection of either Ad-p53 or Ad-p21 vectors into tumor mass developed by nontransfected tumor cells caused statistically significant inhibition of tumor growth. An interesting observation was that p21 gene had more pronounced effect than p53.

Gene p73. Different isoforms of p73 protein have completely different functions. We have explored whether differences in N- and C-terminus of p73 protein influence protein stability. For this purpose H1299 cells (without wild type p53 gene) were transfected with plasmid expression vectors for different isoforms of p73 with Flag tag. By the method of pulse chase we determined the half live of different p73 protein isoforms (TAp73, Ex2Del p73, Ex2/3Del p73 and DNp73, all of them in a and b form). DNp73a had the longest half live. This was additionally proven for endogenous proteins in RKO cells which have relatively high endogenous expression of p73a protein. Using luciferase reporter assay we have shown that DNp73 acts as a dominant negative inhibitor of TAp73 and p53 transcription. However, cotransfection of DNp73 and TAp73 in H1299, U20s and Phoenix cells cause stabilization of TAp73a and b proteins. Stabilization of TAp73a and b proteins was also shown in tet-inducible cells (Hela tet-on and SaOs-2 tet off) stably transfected with DNp73a under the control of tetracycline promoter. Therefore, although DNp73 acts as a dominant negative inhibitor of TAp73, at the same time he inactivates and stabilizes TAp73 by forming heterotetramers. Later on, in a clinical study we have shown increased expression (mRNA, real time PCR ) of DNp73 in 95% of samples of human ovarian carcinoma (correlated to the DNp73 expression in healthy tissues). In one third of tumors we have also noticed the increased expression of TAp73. However, although dominant negative forms of DTAp73 contribute to the increased expression Tap73, at the same time they inhibit its functional activity

We also proceeded with the experiments in tumor gene therapy exploring the role of nm23 genes in development of head and neck tumors. For this purpose we subcloned nm23-H1, nm23-H2 and the mutated form of nm23-H1 cDNA fragments from pcDNA3 constructs into EGFPC3 vectors containing the gene for green fluorescent protein and pyRedC1 with a gene for red fluorescent protein. The construction of fusion nm23-GFP genes/proteins enabled us to follow the subcellular localization. The transfection was conducted on head and neck tumor cell lines of different differentiation and invasivenes: Hep-2, CAL 27, CAL 33 i CAL 166. The GFP-labeled proteins localized in the cytoplasm and in some of the late G1 and in G2/M phase nuclei. With these experiments we confirmed that Nm23 conduct some of his numerous functions in the nucleus. The impact of increased expression of nm23-H1 and nm23-H2 genes on proliferation of head and neck tumor cells was explored by flow cytometry. Analyzing the cell cycle distribution of Hep-2 and CAL 33 cells transfected with pEGFPC1-nm23 construct or by cotransfection with pcDNA3-nm23 and pEGFPC1 constructs, we have shown that both genes stimulate proliferation of these cells in vitro.