Raport final Popescu 2008

HEMATOLOGIE, ONCOLOGIE



Prevalenţele unor profiluri metilice ale Promotorului genei p15 la persoane sănătoase şi printre pacienţii cu leucemii acute

Victor Popescu¹, Ion Corcimaru², Cristina Butovscaia¹, Anastasia Zuieva¹,

Sanda Buruiană², Eugen Simionică³

Laboratorul de Genetică al USMF „Nicolae Testemiţanu”¹

Catedra Hematologie şi Oncologie a USMF „Nicolae Testemiţanu”²

Catedra Biochimie şi Biochimie Clinică a USMF „Nicolae Testemiţanu”³

Summary

Prevalences of some methylic profiles of p15 gene promoter

in healthy persons and patients with acute leukemias

In this study we have obtained some methylic profiles in DNA extracted from venous blood of healthy persons and patients with acute leukemias. Some methylic profiles could act as molecular markers in the acute leukemias monitoring (prognosis, differencial-epigenetic diagnosis and personalized treatment). We have also obtained preliminary results on some methylic profiles prevalences in DNA of healthy persons and patients with acute leukemias. The conclusion consists of MM methylic profile of p15 gene promoter which can be used as candidate molecular marker with low-risk for the examined person who can be affected with acute leukemia immediately after the blood sample collection.



Rezumat

În cadrul studiului dat au fost obţinute unele profiluri metilice la nivelul ADN-ului extras din sânge venos la persoane sănătoase şi la pacienţi cu leucemii acute. Unele profiluri metilice ar putea servi în calitate de markeri moleculari pentru monitorizarea leucemiilor acute (prognosticul, diagnosticul diferenţiat-epigenetic şi tratamentul individual). S-au înregistrat, inclusiv, rezultatele preliminare privind prevalenţele diferitor profiluri metilice la nivelul ADN-ului persoanelor sănătoase şi printre persoanele afectate de leucemii acute. S-a conchis că, aparent, profilul metilic MM al promotorului genei p15 ne poate servi ca marker molecular candidat al riscului minim către leucemii acute a persoanei investigate, în perioada imediată a prelevării probei de sânge.

Introducere

În anumite celule ale persoanelor ce suferă de diverse forme de cancer au fost inregistrate alterări ale profilurilor epigenetice şi genetice [Wong I., 2001]. Acestea includ hipometilarea la nivelul întregului genom, hipermetilarea locală a genelor supresoare de tumori sau a genelor responsabile de reparaţia ADN, precum şi a genelor inhibitoare ale metastazării, mutaţii punctiforme (substituţia 5-metilcitozinei cu timina) din cadrul insuliţelor CpG ale genei p53.

În cele mai multe cazuri de cancer la om este stabilită producerea unor dereglări în cadrul cascadei ciclina D / retinoblastom (Rb), implicate în reglarea ciclului celular [Ewen M., 1993]. Cu toate acestea, însă, în neoplaziile hematologice, inactivarea genei Rb este rar întâlnită [Hangaishi A., 1996]. Genele p16 şi p15 sunt gene supresoare în multe tumori solide sau neoplazii hematologice [Wong I., 1998]. Aceste gene codifică proteine-inhibitoare ale kinazelor ciclin-dependente care, la rândul lor, servesc drept reglatori ai fosforilării proteinei pRb.

În diverse tumori umane a fost detectată metilarea aberantă a genei p16 [Wong I., 2000]. Gena p15, adiacentă genei p16 pe cromozomul 9p21, la fel se caracterizează, adeseori printr-un grad avansat al metilării în neoplazmele hematopoetice umane [Wong I., 1998, Gronbaek K., 1998].

A fost stabilită [Wong I. et al, 1998, Gonzalgo M., 1998] asocierea dintre hipermetilarea promotorului genelor p15 / p16 cu stoparea transcripţiei în celulele neoplazice. Aceşti autori au pus in evidenţă metilarea aberantă a promotorului genei p16 din carcinom hepatocelular (HCC) şi anume: celule diferenţiate (67%), moderat diferenţiate (73%) şi slab diferenţiate (75%) la pacienţi care prezentau tumori în stadiile T1 (40%), T2 (68%), T3 (69%) şi T4 (100%) [Wong I., Johnson P. et al., 2000]. În total, 92% din pacienţii cu HCC au prezentat metilarea genelor p16 şi/sau p15 la nivelul tumorii [Wong I., Lo Y. et al, 2000]. Aceste date sugerează faptul că metilarea genelor p16 şi p15 survine precoce în dezvoltarea carcinomului hepatocelular.

Metilarea aberantă a promotorului genei p15 a fost stabilită cu ajutorul MSP în proporţie de 58% din cazuri de leucemie mieloidă acută (AML – engl. Acute Myeloid Leukemia), leucemie limfoblastică acută (ALL – engl. Acute Lymphoblastic Leukemia) şi leucemie bifenotipică acută (ABL - engl. Acute Biphenotypic Leukemia) [Wong I., Ng M., et al., 2000]. Aceşti autori au identificat unele profiluri metilice ale genei p15 caracteristice pentru cele mai multe subtipuri morfologice care apar în diferite stadii ale diferenţierii şi susţin că metilarea frecventă a genei p15 este un eveniment crucial şi precoce în leucemiile acute. Cercetările acestor autori sugerează că metilarea p15 survine în mod universal, de novo, în timpul transformării / progresiei leucemice a precursorilor hematopoietici din linia mieloidă / limfoidă sau în celulele stem primitive, pluripotente. Totuşi, deocamdată, nu au fost găsite diferenţe semnificative între profilurile metilice ale tumorilor din diferite stadii [Costello J. et al. 2000], sugerându-se că alterările epigenetice au loc în stadiile precoce ale dezvoltării cancerului sau în momentul iniţierii tumorilor. Dereglarea unor căi critice precum Rb/p16 şi p53/p14/MDM2, sau altele, pot adeseori fi cauza creşterii neoplazice [Wong, 2001].

Perturbarea precoce a controlului ciclului celular prin metilarea p16/p15, alterarea factorilor de transcripţie, pierderea aderenţei intercelulare în urma hipermetilarii genei E-caderina, depăşirea punctelor de control al ciclului celular în urma hipermetilarii genei p53, pot contribui la proliferarea necontrolată şi imortalizarea celulară [Baylin S. et al. 2000].

Scopul studiului

Stabilirea prevalenţelor profilurilor metilice ale promotorului genei p15 la persoane sănătoase şi printre pacienţii cu leucemii acute în vederea stabilirii unor markeri molecular-epigenetici noi de diagnostic presimtomatic al leucemiilor acute.

Materialul biologic, metodele şi echipamentele utilizate

În acest studiu au fost investigate două loturi de persoane care au fost de acord cu includerea lor în prezenta cercetare ştiinţifică, inclusiv: lotul I – 20 persoane sănătoase din populaţia generală au servit în calitate de lot martor şi lotul II – 35 persoane afectate de leucemii acute (diverse variante) fiind, anterior, diagnosticate primar şi internate la Centrul Hematologic al Institutului Oncologic din Republica Moldova.

Medoda de bază utilizată în cercetarea dată a fost studiul molecular al metilării ADN la nivelul promotorului genei p15, supresoare a tumorilor, prin conversia citozinei nemetilate în uracil (tratarea ADN) bisulfit de sodiu şi amplificarea porţiunilor genice cu ajutorul perechilor de praimeri nonmetil-specifici şi metil-specifici prin tehnica MSP (methylation specific polymerase chain reaction).

Detaliat, metodele şi accesoriile utilizate în proiect au fost specifice fiecărei etape de lucru, după cum urmează:

1) Recoltarea sângelui venos la pacienţii diagnosticati în prealabil cu diverse forme de leucemii acute. Metoda: Venepuncţie; Accesoriile: Seringi jetabile, Eprubete cu anticoagulant K3EDTA.

2) Extracţia ADN genomic uman din sânge. Metoda: Protocol Qiagen Blood Mini; Accesoriile: Sânge cu K3EDTA, Set de reactivi (kit) tip Qiagen Blood Mini, Pipete, Eprubete tip Eppendorf, Centrifugă 13000 rot/min, Termostat 56ºC, Congelator, Frigider.

3) Modificarea ADN-ului prin conversia citozinei în uracil. Metoda: Protocol “Qiagen” EpiTect Bisulfite Kit; Accesoriile: ADN genomic uman purificat cu ajutorul setului de reactivi “Qiagen” DNA Blood Mini Kit, Set de reactivi “Qiagen” EpiTect Bisulfite Kit, Etanol absolut, Pipete cu volum variabil, Eprubete din plastic tip Eppendorf, Centrifugă 13000 rot/min, Vortex, Congelator, Frigider.

4) Amplificarea prin tehnica MSP a ADN-ului conţinând uracil. Metoda: Protocol PCR -“Fermentas”, Accesoriile: ADN purificat după conversia lui cu bisulfit de sodiu, PCR Master Mix „Fermentas”, Primeri- Ws, Was, Us, Uas, Ms, Mas, Pipete cu volum variabil, Eprubete din plastic “Eppendorf”, Centrifugă la 13.000 rot/min, Baie cu gheaţă, Aparat automat pentru amplificarea ADN (Termocyclor)-„Crocodile III Appligene”, Congelator, Frigider.

Mersul lucrărilor

Pentru a putea analiza profilul metilic la nivelul ADN, care este principalul obiectiv al prezentului studiu, am planificat umătoarele etape de lucru:

1. Recoltarea materialului biologic;

2. Extracţia ADN-ului genomic uman din sânge venos;

3. Modificarea ADN-ului prin conversia citozinei în uracil;

4. Amplificarea prin MSP a ADN-ului modificat, conţinând uracil;

5. Analiza produşilor de amplificare;

6. Prelucrarea matematică a datelor şi formularea concluziilor.

Amplificarea ADN-ului modificat (aparţinând aceloraşi 20 persoane sănătoase şi 35 pacienţi diagnosticaţi cu leucemii acute), conţinând uracil, a fost realizată cu ajutorul protocolului ce urmează.

a) Pregătirea amestecului pentru reacţia de amplificare în lanţ (PCR)

Într-o eprubetă Eppendorf de 200 µl cu pereţi subţiri (se menţine pe gheaţă) se adaugă componentele necesare în ordinea dată pentru a petrece reacţia controlului-pozitiv de amplificare a ADN:

- Apă deionizată sterilă - volum variabil;

- tampon PCR 1× (Echivalent Fermentas) – 5 µl soluţie 10× ;

- dNTPs câte 0.2 mM/L din fiecare tip – 5 µl soluţie 2mM;

- ^{N 1} praimer p15W(s)- 300 ng, volum variabil; 5'- CGCACCCTGCGGCCAGA -3 '

- ^{N 1} praimer p15W(as)- 300 ng, volum variabil; 5'- AGTGGCCGAGCGGCCGG -3 '

- Taq ADN-polimeraza – 1,25 U/50 µl, volum variabil

- MgCl₂ - 3 mM/L – 6 µl soluţie 25 mM;

Volumul amestecului de mai sus: 40 µl

- ^{N 4} ADN modificat prin conversie ≈50 ng, 10 µl ADN soluţie 5 ng/µl

Volumul total al amestecului: 50 µl
^{N 1} Notă: În eprubete separate (variantele “^{N 2}” sau “^{N 3}”) se introduc aceleaşi componente ale reacţiei de amplificare, cu excepţia praimerilor. Aceştia se introduc în corespundere cu varianta reacţiei adică, perechea “^{N 2}” pentru reacţia nonmetil-specifică sau “^{N 3}” în reacţia metil-specifică [Herman J., 1996]:
^{N 2} praimer p15U(s)- 300 ng, volum variabil; 5'- TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT- 3'

^{N 2} praimer p15U(as)- 300 ng, volum variabil; 5'- CCATACAATAACCAAACAACCAA- 3'

^{N 3} praimer p15M(s)- 300 ng, volum variabil; 5'- GCGTTCGTATTTTGCGGTT -3'

^{N 3} praimer p15M(as)- 300 ng, volum variabil; 5'- CGTACAATAACCGAACGACCGA -3'
^{N 4} Notă: În reacţia pentru controlul pozitiv al amplificării se introduce ADN neconvertit (≈50 ng). În prealabil, într-un tub separat au fost introduşi 11 µl ADN matriţă (5 ng/µl). Tubul a fost introdus în termociclor unde a fost denaturat 6 min la 95 °C. Apoi, din matriţa denaturată, s-au luat 10 µl şi s-au adăugat în amestecul de reacţie. Tubul a fost apoi vortexat şi centrifugat 30 sec. În final, tubul a fost introdus în termociclor pentru a se asigura regimul de temperatură şi timpi după cum urmează.

Dacă aparatul termociclor nu este prevăzut cu capac termoactiv, se cere acoperirea amestecului de reacţie cu ulei mineral.

b) Tratarea termică pentru realizarea PCR

Reacţia PCR incepe cu tratarea termică programată a amestecului de reacţie 3 min, 95 °C, după care demarează programul de 35 cicluri în regimul următor: 30 s denaturare la 95 °C; 30 s alinierea praimerilor la 60 °C şi 30 s elongare (se asigură cu 1 s mai mult pentru fiecare ciclu subsecvent) la 72 °C; după decurgerea celor 35 cicluri, se asigură etapa finală de elongare - 4 min la 72 °C.

c) Analiza produşilor de amplificare

Pentru separarea electroforetică a ampliconilor generaţi cu ajutorul metodei MSP noi am găsit posibilitatea utilizării gelurilor prefabricate de tip EL-600 („Elchrom Scientific”) destinate separării fragmentelor de ADN cu dimensiunile cuprinse între 40-600 perechi de nucleotide. Aceste geluri sunt relativ rezistente la acţiuni mecanice, inerte din punct de vedere chimic, rezistente la temperaturi de până la 95 ⁰C au capacitatea de rezoluţie a fragmentelor de ADN ce diferă prin ±1 pb (pereche de nucleotide), sunt înalt transparente şi non-toxice. Ele au costuri mai joase în comparaţie cu gelurile din agaroză de înaltă rezoluţie (high resolution), cu capacităţi de rezoluţie echivalente.

Luând în considerare dimensiunile ampliconilor obţinuţi cu ajutorul praimerilor redaţi de Herman J. şi colaboratorii săi (1996), care constituie 160 şi 147 pb, noi am utilizat un marker-standard al greutăţii moleculare al ADN (Ladder) care determină aceste două valori – markerul tip M3 („Elchrom Scientific”) care reprezintă 50 de fragmente de ADN cu lungimi cuprinse între 75-622 pb şi, totodată, este compatibil cu gelul EL-600.

Pentru a determina mobilitatea ampliconilor în gelul EL-600 care nu a fost până în prezent utilizat în analizarea profilului metilic al promotorului genei p15, am realizat electroforeza cu introducerea în gel, în godeuri separate, a ampliconilor generaţi cu ajutorul praimerilor non-metil-specifici „U” (reacţia PCR a avut loc în eprubete separate) şi, respectiv, şi a ampliconilor generaţi cu ajutorul praimerilor metil-specifici „M”. În rezultatul electroforezei cu utilizarea gelului EL-600, care a decurs 110 min. (25 ⁰C), ampliconii s-au repartizat diferit faţă de modul expus în articolul publicate de Herman J. şi colaboratorii săi (1996). În electroforegrama obţinută în laboratorul nostru, se evidenţiază dimensiunea mai mare a benzii metil-specifice (M) fiind situată mai proximal (98 pb) faţă de godeurile gelului. În articolul redat mai sus, autorii prezintă banda non-metil-specifică (U) ca fiind cea majoră după dimensiuni. S-a confirmat, totuşi, în laboratorul nostru diferenţa de 3 pb între benzile „M” şi „U” înregistrată de aceşti autori. Odată ce aceste benzi de 98 pb şi 95 pb au apărut distincte în repetate rânduri, noi am decis utilizarea unei şi aceleiaşi linii de migrare (track) pentru identificarea concomitentă a celor doi ampliconi după amplificarea separată cu primeri M-specifici şi U-specifici şi amestecarea lor (ADN-ul aceleiaşi persoane) în timpul preparării mixturii pentru încărcarea ei în gel.

d) Protocolul pentru electroforeză

1. 
   În tuburi Eppendorf de 0,2 ml am preparat amestecul pentru încărcare în gel, în modul următor: 2 µl soluţie 5× Loading dye (albastru de bromfenol, zaharoză, xilencianol), 4 µl soluţie conţinând ampliconi generaţi cu primeri M-specifici, 4 µl soluţie conţinând ampliconi generaţi cu primeri U-specifici. Această proporţie a fost constituită şi pentru controlul pozitiv cu exeptia soluţiei conţinând ampliconi generaţi cu primeri W-specifici (8 µl). În paralel, am preparat şi ADN-ul – marker de greutate moleculară: 2 µl soluţie 5× Loading dye, 8 µl apă ultrapură. Pentru obţinerea controlului negativ, ciclurilor de temperaturi a fost supus amestecul Master mix, fără ADN genomic. Acest amestec în proporţie de 8 µl şi Loading dye - 2 µl au fost adăugaţi într-un tub de 0,2 ml pentru a constitui controlul negativ.
   
2. 
   Am preparat 350 ml soluţie TAE (0,5×) din soluţie TAE (50×) prin diluarea cu apă bidistilată.
   
3. 
   Am introdus gelul Spreadex în cuva aparatului de electroforeză şi am turnat în această cuvă soluţie TAE (0,5×) până când nivelul acestei soluţii deasupra gelul a constituit 3-4 mm.
   
4. 
   Am încărcat godeurile gelului cu amestecurile (10 µl) preparate după cum am descris mai sus.
   
5. 
   Am fixat capacul cuvei şi am conectat aparatul de electroforeză la 350 V, durata – 110 min.
   

După expirarea timpului electroforezei am îndeplinit colorarea gelului în soluţie bromură de etidiu (0,5 µg/ml), 45 min, asigurând agitarea periodică a cuvei pentru colorare.

Ulterior, am introdus gelul în apă bidistilată pentru spălare, 10 min, asigurând agitarea periodică a cuvei pentru spălare.

După spălare, gelul a fost amplasat pe suprafaţa transiluminatorului cu ajutorul căruia am iradiat gelul cu lumină UV, lungimea de undă 254 nm. În lumină UV moleculele de ADN colorate cu bromură de etidiu emit fluorescenţă şi au fost inregistrate prin fotografiere cu ajutorul unui aparat foto digital (Exemple, Fig. 1A, 1B).

Fotografiile-electroforegrame astfel obţinute au fost stocate în calculator şi au servit pentru interpretarea rezultatelor amplificării.
Figura 1. Unele profiluri metilice la nivelul ADN-ului persoanelor sănătoase (A)

şi la pacienţii cu leucemii acute (B)

(Foto, original)

A.

B.

În baza datelor din electroforegramele obţinute (exemple, Fig. 1A, 1B), au fost obţinute rezultatele preliminare privind prevalenţele diferitor profiluri metilice la nivelul ADN-ului persoanelor sănătoase (Fig. 2) şi persoanelor afectate de leucemii acute (Fig. 3).

Rezultate şi discuţii

În vederea formulării răspunsului la ipoteza fixată în scopul proiectului, adică, stabilirea prevalenţelor profilurilor metilice ale promotorului genei p15 la persoane sănătoase şi printre pacienţii cu leucemii acute, am aplicat datele din electroforegramele obţinute pentru a construi histogramele ce indică proporţiile procentuale (prevalenţele) profilurilor UU, UM, MM atât la persoane sănătoase (Fig. 2) cât şi la persoanele afectate de leucemii acute (Fig. 3).

Figura 2. Prevalenţele profilurilor metilice epigenetice UU, UM, MM

la persoanele sănătoase



Figura 3. Prevalenţele profilurilor metilice epigenetice UU, UM, MM

la persoanele afectate de leucemii acute

Din histogramele obţinute, rezultă că cele două loturi diferă (rezultatele se referă la un numar restrâns de subiecţi analizaţi), în primul rând, prin incidenţa profilului MM (ADN este metilat la nivelul ambelor alele ale genei p15) şi anume, în lotul persoanelor sănătoase aceasta constituie 15% (3/20), pe când în lotul pacienţilor afectaţi de leucemii acute (35 subiecţi) prevalenţa profilului MM este 0 (zero) sau în acest lot constatăm lipsa subiecţilor care ar prezenta metilarea concomitentă a ADN în ambele alele la nivelul genei p15, adică, persoanele afectate de leucemii acute se caracterizează fie prin profilul UU sau UM.

Profilul UU se găseşte atât printre persoanele afectate de leucemii acute – 26% (9/35), cât şi la persoanele sănătoase – 30% (6/20), semnificând starea nemetilată a ambelor alele în toate celulele probei biologice analizate, atât la persoane afectate de leucemii acute, cât şi la persoane sănătoase. Această constatare conduce către două ipoteze: 1) în stare nemetilată la nivelul promotorului său gena p15 este inactivă; 2) gena p15 nu are un aport direct la supresia transformării maligne în cazul leucemiilor acute.

Profilul UM, deocamdată, nu ne permite să stabilim, dacă în proba dată de sânge au fost prezente celule cu profiluri UU şi MM în amestec sau constituţiile U şi M aparţin concomitent aceloraşi celule şi acestea posedă câte o alelă metilată şi o altă alelă nemetilată.

Concluzii

1. 
   În cadrul studiului au fost obţinute unele profiluri metilice preliminare la nivelul ADN-ului persoanelor sănătoase şi la cele afectate de leucemii acute care pot servi în calitate de candidaţi ai markerilor moleculari pentru monitorizarea leucemiilor acute (prognosticul, diagnosticul diferenţiat-epigenetic şi tratamentul individual).
   
2. 
   Au fost obţinute rezultatele preliminare privind prevalenţele unor profiluri metilice la nivelul ADN-ului persoanelor sănătoase şi persoanelor afectate de leucemii acute.
   
3. 
   Rezultatele obţinute sunt preliminare şi necesită completarea cu subiecţi investigaţi pentru a realiza interpretarea statistică desfăşurată a semnificaţiei diferenţelor între prevalenţele diferitor profiluri metilice ale ADN.
   
4. 
   Profilurile UM şi UU nu s-au evidenţiat clar ca markeri moleculari pentru un risc major către leucemiile acute.
   
5. 
   Spre deosebire de persoanele sănătoase, în lotul pacienţilor diagnosticaţi primar cu leucemii acute nici unul dintre subiecţi nu prezintă metilarea tuturor moleculelor de ADN din proba analizată la nivelul promotorului genei p15.
   
6. 
   Profilul metilic MM poate servi ca marker molecular al riscului minim către leucemii acute, din ziua prelevării probei de sânge.
   

Această lucrare a fost realizată în baza finanţării din partea Consiliului Suprem pentru Ştiinţă şi Dezvoltare Tehnologică al Academiei de Ştiinţe a Moldovei, Contractele de finanţare nr. 12/ind din 02.01.2007, nr. 13/ind din 31.01.2008, nr.27/ind din 26.01.09.

Bibliografie

1. 
   Bielas J., Loeb L. Mutator phenotype in cancer: Timing and perspectives. Enviromental and Molecular Mutagenesis 45: 206-213, 2005.
   
2. 
   Esteller M., Herman J. Generating mutations but providing chemosensityvity: the role of O6-methylguanine DNA methyltransferase in human cancer. Oncogene, 23: 1-8; 2004.
   
3. 
   Hangaishi A. Inactivation of multiple tumor-suppressor genes involved in negative regulation of the cell cycle, MTS1/p16INK4A/CDKN2, MTS2/p15INK4B, p53, and Rb genes in primary lymphoid malignancies. Blood 87: 4949-4958, 1996.
   
4. 
   Herman J. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for metylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 93, pp. 9821-9826, 1996.
   
5. 
   Hoon D. Profiling epigenetic inactivation of tumor suppressor genes in tumors and plasma from cutaneous melanoma patients. Oncogene, 23: 4014-22, 2004.
   
6. 
   Issa J. Phase 1 study of low-dose prolonged exposure schedules of the hypomethylating agent 5-aza-2'-deoxycytidine (decitabine) in hematopoietic malignancies. Blood, 103: 1635-40, 2004.
   
7. 
   Jahr S. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin apoptotic and necrotic cells. Cancer Res., 1:1659-65, 2001.
   
8. 
   Kantarjian H. Results of decitabine (5-aza-2'deoxycytidine) therapy in 130 patients with cronic myelogenous leukemia. Cancer, 98: 522-8, 2003.
   
9. 
   Miyamoto K., Ushijima T. Diagnostic and Therapeutic Applications of Epigenetics. Jpn. J.Clin. Oncol., 35 (6), 293-301, 2005.
   
10. 
    Van Steensel B., Henikoff S. Epigenomic profiling using microarrays. BioTechniques 35: 346-357, 2003.
    
11. 
    Wong I. Aberrant p15 promoter methylation in adult and childhood acute leukemias of nearly all the morphologic subtypes: potential prognostic implications. Blood, 95: 1942-1949, 2000.
    
12. 
    Wong I. Detection of aberrant p16 metylation in the plasma and serum of liver cancer patients. Cancer Res., 59: 71-3, 1999.
    
13. 
    Wong I. Frequent p15 promotor methylation in tumor and peripheral blood from hepatocellular carcinoma patients. Clin. Cancer. Res., 6: 3516-21, 2000.
    
14. 
    Wong I. Methylation profiling of human cancers in blood: molecular monitoring and prognostication (Review). International Journal of Oncology 19: 1319-1324, 2001.
    
15. 
    Wong I. Quantitative analysis of tumor-derived methylated p16INK4a sequences in plasma, serum, and blood cells of hepatocellular carcinoma patients. Clin. Cancer. Res., 9: 1047-52, 2003.
    

REZULTATELE NEMIJLOCITE ALE TRATAMENTULUI

leucemiEI mieloidE cronicE CU Imatinib Mesilat

Vasile Musteaţă, Ion Corcimaru, Larisa Musteaţă, Maria Robu,

Maria Chiu, Sanda Buruiană

Catedra Hematologie şi Oncologie a USMF „N. Testemiţanu”,

IMSP Institutul Oncologic
Summary

The short–term results of treatment of chronic

myeloid leukemia with imatinib mesylate

Imatinib Mesylate is an inhibitor of tyrosine kinase activity of chimeric BCR-ABL gene, situated at chromosome 22, and has been considered as a “targeted therapy” in the management of chronic myeloid leukemia . Complete hematologic response was achieved in chronic and accelerated phases in 39 (90.6%) patients within 1 – 2 months of the therapy with Imatinib Mesylate. In patients with complete hematologic response the repeated cytogenetic examination of the bone marrow revealed the decrease of myeloid cells bearing Ph-chromosome up to 0 – 35%, that certified the major or complete cytogenetic remission.

Rezumat

Imatinib Mesilat este inhibitor al activităţii tirozinkinazice a genei himerică BCR-ABL situate pe cromozomul 22 şi se consideră ca „terapia în ţintă” în managementul leucemiei mieloide cronice. Răspunsul clinico-hematologic complet a fost obţinut în faza cronică şi accelerată la 39 (90,6%) pacienţi peste 1 – 2 luni de terapie cu Imatinib Mesilat. La bolnavii cu remisiunea clinico-hematologică completă analiza citogenetică repetată a măduvei osoase a demonstrat scăderea ratei celulelor medulare pozitive la Ph-cromozom pînă la 0 – 35%, ce indică obţinerea remisiunii citogenetice majore sau complete.
Leucemia mieloidă cronică (LMC) reprezintă un proces tumoral clonal al sistemului de hematopoieză, fiind rezultat al transformării maligne a celulei stem pluripotente, cu menţinerea diferenţierii pe toate liniile celulare. LMC constituie o patologie oncologică relativ frecvent întîlnită în structura morbidităţii prin hemoblastoze, constituind 15 – 20% din toate leucemiile la adulţi şi fiind una dintre cele grave şi invalidizante maladii umane (1,3,10,12). Patologia se caracterizează în special prin multiplicarea necontrolată a celulelor seriei mieloide, cu creşterea masei granulocitare totale şi a celei circulante. Translocaţia t (9; 22), sau cromozomul Philadelphia se evidenţiază în 100% din celulele medulare în diviziune, constituie marcherul citogenetic al bolii şi contribuie la diagnostic şi evaluarea rezultatelor tratamentului (1,2,3,4,5,6,11,12). Identificarea genei de fuziune BCR/ABL şi a proteinei himerice p210 cu activitatea tirozin-kinazică conturează LMC la nivel molecular (1,3,12). Tratamentul contemporan al LMC cuprinde chimioterapie, imunoterapie şi transplant medular alogenic (1,2,3,4,10,11,12). Imatinib Mesilat sau Glivec^® este inhibitor al tirozinkinazei, produse de gena himerică BCR-ABL situată pe cromozomul 22 şi se consideră ca „terapia în ţintă” (5). Imatinib Mesilat se aplică cu succes în toate fazele LMC, cel mai înalt răspuns clinico-hematologic şi citogenetic fiind atins în faza cronică a patologiei. Totodată cercetările demonstrative privitor la eficacitatea nemijlocită şi inofensivitatea medicaţiei cu Glivec^® sunt reflectate în literatura periodică pe specialitate insuficient, majoritatea din aceste fiind bazate pe numărul neînsemnat de cazuri. Nu este relatată dinamica clinico-hematologică pe fond de terapie cu Imatinib Mesilat în raport cu chimioterapie convenţională. Nu s-au elaborat definitiv principiile de dozare a medicamentului în funcţie de eficacitatea şi durata chimioterapiei anterioare şi de datele examinărilor citogenetice şi moleculare ale măduvei osoase. Se întreprind studiile clinice pentru evaluarea răspunsului la doze înalte de Imatinib Mesilat (2). Cele expuse au servit ca argumente întemeiate pentru realizarea studiilor în domeniul diagnosticului şi tratamentului cu Glivec^® al LMC.
Obiectivele cercetării

Studierea rezultatelor nemijlocite şi efectelor secundare ale medicaţiei cu Imatinib Meslat în LMC.
Material şi metode de cercetare

În studiul au fost încluşi 43 bolnavi (bărbaţi – 22, femei – 21) în vîrstă cuprinsă între 15 – 61 ani (media de vârstă – 41,8 ani), cu diferite faze ale LMC, care s-au aflat sub supravegherea Centrului Hematologic al Institutului Oncologic din Moldova în perioada anilor 2007 – 2009. Tipul procesului mieloproliferativ cronic a fost identificat în conformitate cu Clasificarea Internaţională a Neoplazmelor Mieloide propusă de O.M.S. în anul 2001 (9). Stadiul cronic al LMC a fost diagnosticat în 30 (69,8%) cazuri, stadiul de accelerare – în 6 (13,9%) şi cel acut (criza blastică) – în 7 (16,3%). Pacienţii au fost calificaţi şi aprobaţi pentru Glivec^® International Patient Assistance Program (GIPAP) după efectuarea examinărilor citogenetice şi moleculare ale măduvei osoase (7,8). Rata celulelor medulare pozitive la Ph cromozom a variat între 20 – 100%, fiind în majoritatea absolută de cazuri (74,7%) în peste 75% de elemente celulare ale măduvei osoase. Gena himerică BCR-ABL p210 s-a detectat în celulele medulare la toţi bolnavii, la 3 (6,9%) din ei fiind determinată şi gena BCR-ABL p190. În cadrul GIPAP pacienţii au urmat medicaţie cu Imatinib Mesilat (7,8). Doza medicamentului a fost selectată în funcţie de stadiul clinico-hematologic evolutiv al bolii, constituind 400 mg în faza cronică, 600 mg în faza de accelerare şi 800 mg în criza blastică (4,5,6,7,11,12). Medicaţie de start cu Imatinib Mesilat au primit 7 (16,2%) pacienţi primari. În 36 (83,8%) cazuri Imatinib Mesilat a fost administrat în lipsa răspunsului clinico-hematologic complet sau a celui citogenetic la chimioterapie convenţională şi la recidiva procesului leucemic. În scopul monitorizării răspunsului citogenetic la pacienţi peste 6 – 8 luni de tratament se efectua examinarea repetată a celulelor medulare la Ph-cromozom şi gena BCR-ABL p210 (4,6,10,12).

Rezultate obţinute şi discuţii

Simptomele clinice şi aspectele hematologice ale bolii au fost determinate de faza LMC şi răspunsul la tratament anterior în cazurile secundare. Totodată semnele care au condus la depistarea patologiei s-au datorat splenomegaliei şi modificărilor specifice la examenul sângelui periferic. În grupul pacienţilor înrolaţi în GIPAP perioda de la stabilirea diagnosticului de LMC pînă la începutul medicaţiei cu Imatinib Mesilat a oscilat între 1 – 59 luni (media – 24,7 luni). La 5 (11,6%) bolnavi LMC s-a diagnosticat incidental în timpul examenului clinico-hematologic profilactic sau adresării la medic din cauza complicaţiilor infecţioase sub formă de pneumonie acută. Dimensiunile splinei au variat de la palparea polului lienal inferior la nivelul rebordului costal stâng pînă la crista iliacă. În 2 cazuri splenomegalia s-a evidenţiat numai la examenul cu ultrasunete al organelor cavităţii abdominale. Splina la palpare a fost puţin doloră, cu suprafaţa netedă şi consistenţa dur-elastică. La 14 (32,6%) bolnavi s-a depistat şi hepatomegalia, marginea inferioară a ficatului fiind palpabilă cu 0,5 – 5 cm de sub rebordul costal drept.

În hemogramă numărul de leucocite a variat între 12,2 – 315,0 x 10⁹/l, de trombocite – 180,0 – 2340,0 x 10⁹/l. În aspiratele medulare seria granulocitară a fost cuprinsă între 34,0 – 86,4%, celulele blastice – 1 – 69%.

Răspunsul clinico-hematologic complet a fost obţinut în faza cronică tardivă şi accelerată la 39 (90,6%) pacienţi peste 1 – 2 luni de terapie cu Imatinib Mesilat. Micşorarea splenomegaliei, scăderea leucocitozei şi trombocitozei s-a dovedit mai rapidă în raport cu chimioterapia anterioară cu Busulfan, atingînd 50% din valorile dimensionale iniţiale în perioada de 7 – 10 zile. În cazurile de medicaţie cu Glivec^® tendinţa spre atingerea precoce a remisiunii complete a fost observată în faza cronică a LMC, cu perioada scurtă de la debutul maladiei pînă la confirmarea diagnosticului, cu leucocitoză şi trombocitoză moderate. Într-un caz cu criza blastică de tip limfoblastic cu remisiunea clinico-hematologică completă şi răspunsul citogenetic minor după polichimioterapie pe fond de Imatinib Mesilat s-a obţinut răspunsul citogenetic şi molecular complet. La 1 (2,5%) bolnav cu criza blastică de tip monoblastic s-a constatat remisiunea clinico-hematologică parţială. Numai în 3 (6,9%) cazuri de criză blastică a LMC nu s-a obţinut răspunsul clinico-hematologic la tratament. La bolnavii cu remisiunea clinico-hematologică completă analiza citogenetică repetată a măduvei osoase, efectuată peste 6 – 8 luni de medicaţie cu Glivec^®, a demonstrat scăderea ratei celulelor medulare pozitive la Ph-cromozom pînă la 20 – 35%, ce indică obţinerea remisiunii citogenetice majore. În 3 (6,9%) cazuri peste 12 luni de tratament s-a constatat eradicarea completă a clonei celulare medulare purtătoare de Ph-cromozom. S-a ameliorat semnificativ calitatea vieţii pacienţilor, ce a permis continuarea activităţii profesionale la cei plasaţi în cîmpul muncii. De menţionat, că la bolnavii trataţi cu chimioterapie convenţională pînă la medicaţie cu Glivec^® s-a obţinut răspunsul citogenetic minimal, ce s-a confirmat prin examinarea citogenetică a măduvei osoase în procesul încluderii lor în GIPAP.

Efectele secundare uzual înregistrate au fost mialgiile, xerostomia, pruritul cutanat, angioedemul, greţurile, dispepsia, abdominalgiile, neutropenia şi trombocitopenia, apărute în diferite combinaţii la 15 (34,9%) bolnavi. În general aceste efecte secundare s-au dovedit a fi nepronunţate sau moderate în intensitate şi tranzitorii. Totodată la 5 (11,6%) pacienţi, supuşi anterior monochimioterapiei cu Busulfan, s-au dezvoltat neutropenia şi trombocitopenia profundă, care s-a prelungit 3 – 5 luni, ce a servit ca indicaţie pentru suspendarea temporară a tratamentului cu Glivec^® şi efectuarea transfuziilor de concentrat eritrocitar deplasmatizat si concentrat trombocitar la apariţia respectiv a sindromului anemic marcant şi hemoragic. La restabilirea indicilor hemogramei a fost reluat tratamentul cu Imatinib Mesilat în doză de 300 mg/zi, cu ajustarea ulterioară a dozei la stadiul LMC în lipsa citopeniilor profunde. Un pacient, care a evoluat cu hematotoxicitate de gradul 4 pe fond de terapie cu Glivec^® nemonitorizată adecvat la domiciliu, a decedat din cauza complicaţiilor infecţioase şi hemoragice. De subliniat, că la bolnavii, trataţi cu Glivec^® în calitate de prima opţiune curativă, hematotoxicitatea de gradul 3 – 4 nu s-a înregistrat.

Concluzii

Medicamentul Imatinib Mesilat constituie opţiune terapeutică de prima linie în faza cronică şi de accelerare a LMC, fiind net superioară în raport cu chimioterapie convenţională prin posibilitatea atingerii răspunsului clinico-hematologic complet rapid şi a răspusului citogenetic complet. Incidenţa scăzută de efecte secundare atestă tolerabilitatea satisfăcătoare a medicamentului, ce permite administrarea lui atît în condiţii de staţionar cît şi de ambulator. Pacienţii cu LMC, supuşi iniţial medicaţiei cu Busulfan, necesită monitorizare mai frecventă (1 – 2 ori în săptămînă) a indicilor hematologici pentru depistarea precoce a pancitopeniei şi preîntîmpinarea dezvoltării hematotoxicităţii de gradul 3 – 4 prin ajustarea dozei de Imatinib Mesilat.