T. C. Erciyes üNİversitesi eczacilik faküLtesi

Şekil 1: Rekombinant DNA’ların üretilmesi

Rekombinant DNA teknolojisindeki süratli gelişme gen aktiviteleri ile ilgili çalışmalar yapmak için yeni fırsatlar ortaya çıkarmıştır. Bununla birlikte moleküler biyoloji ve genetik mühendisliği alanında yapılan çalışmalarda, gen aktarım teknolojilerinin önemi gün geçtikçe artmaktadır. Çiftlik hayvan­larına gen transferi; elde edilen yavru sayısı, süt miktarı, yapağı miktar ve kalitesi, yemden yararlanma kabiliyeti ve hastalıklara direncin yükseltilmesi amacı ile yapılmaktadır. Önemli bir diğer hedef ise transgenik hayvanların organ vericisi haline getirilmesidir. Rekombinant DNA tekniği geliştirildiğinde, sadece genlerin organizasyonu, düzenlenmesi ve mutasyonlar gibi, temeli akademik çalışmalara dayanan araştırmalar için kullanılırdı. Bilim adamları, bu teknolojiden yararlanarak endüstriyel uygulamasını da bulmuşlar ve bugün biyoteknoloji adı altında tıp, kozmetik ve tarım gibi farklı alanla da ekonomiye milyarlarca liralık katkısı ile önemli bir endüstri doğmuştur (9).

Rekombinant DNA tekno­lojisi kullanılarak bir genin klonlanması 4 aşamada gerçek­leştirilebilir. Gen klonlanması ise şöyle tanımlanabilir: Önemli bir ürünün yani hedef DNA bölgesinin bir vektör ile birleştirilerek özel konak hücreler içinde çok sayıda kopyasını elde etme işlemidir (11,12).

3.1. Gen izolasyonu

a) mRNA'sından komplementer DNA (cDNA)’ nın sentezlenmesi,

b) Gen kütüphanelerinin kullanılması: Aranan genin etiketli kopyası ya da etiketli mRNA'sı elde mevcutsa tüm genomu parça parça içeren klonlar arasından aranan geni içeren klon tespit edilip, bol miktarda gen izolasyonunda kullanılabilir (9,10).

3.2. Uygun gen taşıma aracı (Vektör)

a) Plazmidler: Konak E.coli hücresi içerisinde çoklu kopyaları bulunan 2kb-200kb ebatlı küçük kromozomdan ayrı olarak bulunan dairesel moleküllerdir. En çok kullanılan pBR322 plazmiti Ampisilin ve Tetrasiklin antibiyotiklerine direnç bölgeleri içerir. Pek çok restriksiyon enzimi için tek bir kesme yerine sahip olup, 6000 bp'e kadar yabancı DNA parçaları taşıyabilir.

b) Virüsler: 1978’de yapılan Asimolar konferasınsında en az tehlikeli ve en çok incelenmiş virüs olarak ƛ-faji kullanılmaya karar verilmiştir.ƛDNA'sı 49 kb boyunda çift iplikli bir moleküldür. Her iki ucunda birbirlerine komplementer 12 nükleotitlik tek iplikli zincirlere sahiptir. Bu uçlara "cos" (cohesive = yapışkan) uçlar denir. Infekte olmuş hücrede DNA'ları cos bölgelerinden birbirine bağlı peşpeşe DNA zincirleri halinde sentezlenir ve sonra faj halinde paketlenirler.



Şekil 2: cDNA eldesi

c) Kozmidler: Plazmit ve fajların kullanışlı özelliklerini bünyesinde toplayan melez bir vektördür. 35000 - 45 000 bp'ye kadar DNA parçalarını klonlamada kullanılabilir. ƛ fajını paketleyen enzimlerin "cos" bölgelerini tanımasından yararlanılır. ƛ fajının "cos" bölgeleri örneğin pBR322'nin tet geni içine klonlanır. Amp¹ geni sağlam kalır. Yabancı DNA nispeten büyük parçalara kesilip her biri (biraz şans ile) "cos" bölgeli plazmit ile birleştirilir. Bakteriler ekilerek ampisiline dirençli, tetrasikline duyarlı olanlar seçilir.

d) Ekspresyon vektörleri: Yabancı genin ekleneceği bölgenin önünde tercihli bir promoter bölge içeren yapay plazmitlerdir. Klone edilecek genin ürünü olan proteinin sentezlenmesi arzu ediliyorsa ekspresyon vektörleri kullanılır (9,10).

3.3. Genin hücreye sokulması

1. 
   Plasmid ya da virüslerle,
   
2. 
   Kimyasal yöntemle: Ca₃(PO4)₂ kullanılarak DNA'yı tuzakladıktan sonra seçici bir ortamda ( ±tk geni ile seçerek),
   
3. 
   Fiziksel yöntem: Hücre çekirdeğine sokulacak cam (ya da plastik) mikro pipetlerle (uçları 0,1 - 0,5 mikron olmalı) DNA injeksiyonudur. Bu yöntemle herhangi bir DNA parçası herhangi bir hücreye direkt olarak sokulabilir.
   
4. 
   Füzyon ile: Lipozomlar ya da eritrosit hayaletler (içlerindeki hemoglobin ve diğer proteinler boşaltılmış, bütünlüğü korunmuş eritrosit membranları) kullanılarak içerdikleri DNA'nın hücre erimesi yöntemiyle diğer bir hücre ile birleştirilmesi yöntemidir (9,10).
   

3.4. Geni içeren hücrenin seçimi

a) Antibiyotiklere dirençlilik,

b) Seçici ortamlar (örneğin HAT: Hipoksantin, Aminopterin ve Timin) ortamında tk- hücreler üreyemez. Çünkü Aminopterin, dCTP ->dTDP yolunu bloke eder (9,10).

Yabancı geni içeren hücre seçildikten sonra uygun koşullarda saklanabilir ya da arzu edildiğinde adı geçen geni üreten bir fabrika gibi kullanılabilir. Günümüzde değerli proteinlerin genleri (insülin, büyüme hormonu vb.) ekspresyon vektörlerine klone edilmiş olarak mevcuttur. Hatta çeşitli firmalardan ücreti ödenerek temin edilebilir (9,10).

Rekombinant DNA teknolojisi uygulamaları özellikle genetik mühendisliği ve biyoteknolojide kullanılmaktadır. Dünya nüfusunun %3-5'nin genellikle tedavi olanağı bulmayan kalıtsal hastalıklardan etkilendiği bilinmektedir. Bu alandaki en büyük ümit ve beklenti genetik bozuklukların gen aktarımı yöntemleriyle düzeltilmesi ya da etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesidir. Kısa zamanda çok geniş bir uygulama alanı bulan bu yöntemin gerçek değeri önümüzdeki yıllarda çok daha iyi anlaşılacaktır (12).

4.İNSÜLİN

4.1.İnsülin nedir

İnsülin pankreastaki langerhans adacıklarının beta-hücreleri tarafından üretilen polipeptit yapıda 6000 dalton molekül ağırlığında bir hormondur. Molekülü 2 aminoasit zincirinden oluşmaktadır. Zincirler birbirlerine iki disülfür köprüsüyle ile bağlanmıştır. Bu hücreler pankreas kütlesinin yaklaşık %1’ini oluştururlar. İnsülin, dokular tarafından yakıtların kullanımını düzenleyen en önemli hormonlardan biridir. Metobolik etkileri anaboliktir, ör: glikojen, triaçilgliserol ve protein sentezini desteklemektedir (13).

Bunların dışında membran enzimlerini aktive ve inaktive edebilirler, birçok protein ve mRNA’nın sentez veya yıkım hızını değiştirebilir, hücre büyüme ve farklılaşmasını etkileyebilirler (14).

İnsülinin karbonhidrat özüştürmesinin birincil dengeleyicisi olmasının yanında, karbonhidrat metabolizması ile ilişki içinde bulunan yağ ve protein metabolizmaları üzerinde de önemi vardır ve kandaki insülin derişimi değişikliklerinin tüm bedende yaygın etkileri bulunmaktadır. Bu hormonun tam yokluğu, şeker hastalığının 1. tipine ; görece azlığı ya da insüline karşı direnç ya da her ikisinin birlikte olması ise 2. tip şeker hastalığına yol açar. Bu doğrultuda, endüstriyel olarak üretilmiş olan insülin, 1. tip şeker hastalığında ve başka ilaçların yetersiz kaldığı 2. tip şeker hastalığı vakalarında ilaç olarak da kullanılır. İnsülinin yapısı hayvanlar arasında görece küçük farklara bağlı bir çeşitlilik gösterir ve insan insülinine en benzer yapıdaki insülin, arada tek bir aminoasit biriminin farklı oluşuyla, domuz insülinidir. İnsülinin karbonhidrat metabolizması üzerindeki düzenleyici işlevinin etkinliği de insandan insana değişkenlik gösterebilmektedir (15).

4.2.İnsülinin tarihçesi

1869 yılında Langerhans pankreas adacıklarını islet Cell diye isimlendiriliyordu. 1889 da Minkowsky ve V. Mering total pankreatektomi yaptıkları köpeğin diyabet olduğunu göstermeleriyle şeker hastalığının merkezi organını tanımlamış oldular. 1909’da Jean de Mayer, pankreasın bu adacıklarının salgıladığı endojen salgıya İnsülin adını teklif ettiler. 1916’da Nicoulau Paulesco pankreasın bu ekstresine pencrein adını vererek, diyabetik hastalarda bunun kan şekerini düşürdüğünü yayınladılar (1,16).

1920’ler heyecan verici yıllardı. Gelişimin heyecan verici sürecinde ilk adım olarak dünyanın ilk insülini elde edildi. İnsülin tedavisi Danimarka’da başladı, Novo terapötik laboratuvarları ve Nordisk insülin laboratuvarları kuruldu.30 Ekim 1920 de Banting dış kanalı bağlı pankreasta adacıkları izole edildi. 1921’de Best, Banting, Mac Leod ve J. Collip pankreas ekstresiyle diyabetik köpeğin kan şekerini düşürüp, hipoglisemi ve şoka sokuldu ve böylelikle insülin keşfedilmiş oldu. 1922 yılı mayıs ayında Lilly ilaç firmasıyla Best Collip insülin üretim kontratı imzaladı ve insülin tedavi sahasına sokuldu (1).

Biyofarmasötik endüstrisi 1971 yılında Berkeley’deki Cetus’un kurulması ile başladı. 1975’de ilk monoklonal antikor üretildi.1976’da Genentech in kurulması ile DNA dizileme, replikasyon ve maya DNA’sının ekspresyonunun sunumu yapıldı. Bir sonraki yıl, insan geni bakteride ifade edildi ve tavşan insülin geni klonlandı. 1978 yılında Biogen kuruldu ve aynı yıl rekombinant insan insülini ve insan büyüme hormonu üretildi. Bakteriyal DNA başarılı bir şekilde maya kromozomuna sokuldu. 1979’da maya protoplastı bir hibrit E. coli/maya plazmidi ile transforme edildi. 1980’de Amgen kuruldu ve canlı organizmaların patentlenebileceği US yüksek mahkemesi ile kurallandırıldı. 1981’de ilk rekombinant diagnostik kit FDA tarafından onaylandı ve 3 şirket daha oluşturuldu: Genetics Institute, Chiron ve Genzyme. Rekombinant insan insülini 1982 yılında onaylandı (1,16).

4.3.İnsülinin yapısı kimyası ve biyokimyası

Kimyasal olarak insülin küçük basit bir proteindir. 30 tanesinin bir polipeptit zincirini ve 21 tanesinin de ikinci bir zinciri oluşturduğu 51 amino asitten oluşur. Bu iki zincir bir disülfit bağı ile bağlanır (şekil 3 ) (2).

Şekil 3: İnsülin zinciri

İnsüline ait genetik kod DNA içindeki on birinci kromozomun kısa kolunun üzerinde bulunmuştur. Bu, 153 azot kökü içerir (63 ü A zincirinde ve 90 tanesi de B zincirinde). İki uzun birbirine sarılı helisel içeren kromozomu oluşturan DNA, her biri bir şeker deoksiribozu bir fosfat ve azot kökünden oluşan bir nükleotidler zincirinden inşa edilir. Dört farklı azot kökü vardır; bunlar adenin, timin, sitozin ve guanindir. İnsülin gibi özel bir proteinin sentezi bu köklerin tekrar edildikleri bir zincir ile tespit edilir (Şekil 4 ) (17,18).

Şekil 4: B insülin zinciri için gerekli özel nükleotid zinciri ile birlikte sarılmış DNA

İnsülin molekülünün yapısı bakımından, türler arasında fark­lılıklar bulunmaktadır. Bu farklılığın klinik önemi vardır. Örneğin domuz, sığır, at ve memeli deniz hayvanlarının insülinlerindeki kimyasal olarak en büyük farklılık 8. 9. ve 10. amino asitteki değişikliktir. İnsan insülinine en yakın olan domuz insülinidir. Domuz insülinindeki tek fark B zincirinde karboksi terminalinde alanin treonin (threonine) olmasıdır. Başlangıç maddesi olarak domuz İnsülinin kullanılması yan sentetik olarak insan insülinin elde edilmesini nispeten kolaylaştırmıştır. 1983 yılında Frank ve Chance, E.coli DNA' sının klonlanması ile insan insülini elde etmişlerdir. Bu heyecan verici yeni teknolojik gelişme ile insan insülini üretilmiş, diyabet hasta­larının daha etkin ve memnuniyet verici bir şekilde tedavi edilmesi sağlanmıştır. İnsan insülininin bulunması diyabet hastalarının tedavisinde önemli bir yolun aşıldığı anlamını taşımaktadır. 1995 yılında rekombinant DNA (rDNA) teknolojisi ile bir başka ilk gerçek­leştirilmiştir. İlk kez insan insülini analogu elde edilmiştir. B zin­cirinin C terminalindeki prolin (B28) ile lizinin (B29); yer değiştirmesi sağlanarak insan insülin analogu elde edilmiştir. Bu gelişmelerden, açıkça izleneceği gibi diyabet hastalığının tedavisinde kullanılan insülinin, tedavi etkinliğini arttırmak amacı ile yapılan çalışmalar, keşfinden günümüze kadar aralıksız olarak devam etmiştir. Tedavide en iyi sonucun alınması ve sorunsuz olarak kullanılması ile ilgili olarak insülin molekülünün geliştirilmesi ile ilgili çalışmalarda sınır tanınmamıştır. Diyabet tedavisi ve insülin molekülünün geliştirilmesi ile ilgili olarak gelecekte erişilecek düzeyin bir gün hayal gücümüzü bile aşa­cağını düşünmek uzak bir tahmin olmayacaktır (19).

4.4.İnsülin sentezinin doğası ve amacı

Banting ve Best in 1921’de keşfettikleri hormon olan insülinden bu yana; bozulan insülin hormonuna bağlı olarak artan şeker düzeyleri olan diyabet hastaları (Şekil 5); mezbaha hayvanlarının pankreas bezelerinden (salgı bezi) türetilen insülin ile tedavi edilmektedir. Langerhans’ın pankreas adacıklarının beta hücrelerinden üretilen ve salgılanan bu hormon, yiyeceğin; özellikle karbonhidratların kullanımını ve depolanmasını düzenler (20,21).

Şekil 5 Diyabetik kişinin kan glikoz seviyesindeki yükselme ve alçalmalar (dalgalanmalar) sağlıklı bireyler ile karşılaştırıldı.

Sığır ve domuz insülini insan insülinine benzer olmasına rağmen bunların yapısı az da olsa farklıdır. Sonuç olarak bir seri hastanın bağışıklık sistemi buna karşı bunun faaliyetlerini nötrleştiren antikor üretir ve bu da enjeksiyon alanlarında iltihaplı tepkilerle sonuçlanır. Sığır ve domuz insülininin bu ters etkilerine ek olarak, yabancı bir maddenin düzenli olarak enjeksiyonundan sonra gelen uzun süreli komplikasyonlardan korkulmaktadır ve bu da hayvandan üretilen insülinin üretiminde azalma olarak yansımıştır (22). Bu faktörler; araştırmacıları, uygun bir vektör E. coli bakteriyel hücresi içine insülin geni yerleştirerek doğal olarak üretilen eşiyle kimyasal olarak aynı olan, insülin üretmek için, humulin sentezlemeyi düşünmeye yönlendirmiştir. Bu da rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak başarılmıştır. Bu metot mezbahadan yan ürününü çıkartmak ve bunu arıtmaktan çok daha güvenilir ve devamlı bir metottur (Şekil 6 ) (2).

Şekil.6: Rekombinasyon (yeniden birleştirme) işlemine genel bir bakış.

4.5.İnsülin üretimi

İnsülin genel olarak;

• 
  Sığır (Beef İnsülin) Sığırların pankreaslarından ekstraksiyon yöntemi ile elde edilir. 3 amino asidi insan insülininden faklıdır.
  
• 
  Domuz (Pork İnsülin) Domuzların pankreaslarından ekstraksiyon yöntemi ile sağlanır. İnsan insülininden bir amino asidi farklıdır.
  
• 
  Bakteriler/Mayalar(Biosentetik) Bakteri ve maya (mantar)'ların DNA yapıları değiştirilerek (rekombinasyon) insan insülini üretilir. (Rekombinant DNA teknolojisi) (23).
  

4.6.İnsan insülini sentezinin basamakları

1. 
   Nükleusta insulin kodlayan genlerden mRNA transkripsiyonu olur.
   
2. 
   mRNA stoplazmaya gelir ve kaba endoplazmik retikuluma bağlı polizom ile translasyona uğrar.
   
3. 
   Polipeptit sentezi, N-Terminal sinyal polipeptidi oluşumuyla başlatılır ve kaba endoplazmik retikulum membranı içine penetre olur.
   
4. 
   Polipeptit zinciri, kaba endoplazmik retikulum lumeni içine doğru uzar, sonuçta preproinsülin oluşur.
   
5. 
   Sinyal peptidi ayrılır ve sisternada proinsülin oluşur.
   
6. 
   Proinsülin kaba endoplazmik retikulumdan golgi kompleksine taşınır, orada proteazların etkisiyle c-peptit segmentini kaybederek insüline dönüşür. Dönüşüm golgi aparatından kopma sonucu oluşan insülin depo veziküllerinde devam eder.
   
7. 
   İnsülin parsiyel ekzositozla salgılanırken onunla birlikte ekimolar miktarda Cpeptitide salgılanır (13).
   

4.7.Rekombinant DNA teknolojisi ile insülin üretimi

DNA’nın on birinci kromozomunun çift ipliği insülin üretiminde özel olan eşleşmemiş azot köklerini açığa çıkararak ikiye bölünür (şekil 7 ) (21).

Şekil 7: İnsülinin B zincirinin kodlanması için gerekli olan ve açığa çıkan nükleotidler ile birlikte DNA 11. kromozomunun çözülme ipliği

Açığa çıkan DNA iplikçilerini şablon olarak kullanarak (Şekil 8 ) transkripsiyon (kopyalama) işlemindeki mesajcı RNA oluşur (şekil 9 ) (24).

Şekil 8:Açığa çıkan DNA iplikçiği.



Şekil 9 (m)RNA iplikçiği.

Urasil tarafından değiştirilen azot köklü timin üzerindeki mRNA iplikçiğinin rolü genetik bilgiyi taşımaktır. Mesela insüline ait olan bilgiyi çekirdekten sitoplazmaya, ribozoma bağlandığı yere, taşıması gibi (Şekil 10 ) (21,24).

Şekil 10: Ribozomdaki tercüme işlemi.

mRNA’nın azot kökleri kodonlar adı verilen ağaçlarda gruplanırlar. Taşıyıcı RNA (tRNA) molekülleri, üç eşlenmemiş azot kökü, toplu olarak mRNA üzerinde tamamlayıcı kökler olan kodonlar ile birlikte toplu olarak bir anti kodon çifti olarak bilinen özel bir amino aside bağlanırlar (Şekil 11) (21,24).

Şekil 11:Taşıyıcı RNA molekülleri kodonların bağlandığı özel amino asit

Ribozomda mRNA’nın tRNA tarafından okunması tercüme (yazma) olarak bilinir. tRNA tarafından oluşturulan özel bir amino asit zinciri mRNA tarafından tespit edilen kodu takip eder. mRNA’nın kök zinciri, insülin gibi özel proteinleri oluşturmak için bununla birlikte bağlanan amino asit zinciri içine yazılır (21,24).

4.7.1.Vektör (Gram Negatif E.coli)

E.coli adlı yaygın bakterinin zayıflamış iplikçiği insan sindirim sisteminin bir sakinidir ve bu; genetik insülin mühendisliği fabrikasıdır (Şekil 12) (2).



Şekil 12: E. coli hücresi içine insülin tanıtılması

Bakteri ürediğinde DNA’ nın sirküler bir kısmı olan plazmid ile birlikte insülin de kopyalanır (Şekil 13). E. coli insülin gibi yabancı maddeleri hızla azaltan enzimleri üretir. Bu enzimlerden yoksun mutant iplikçikleri kullanarak problemden kaçınılır (2).

Şekil 13: Vektörlerin plazmidlerinin elektron mikroskobu ile görünüşü

4.7.2.Genetik Mühendislerinin Araç Kutusu İçindekiler

Doğal olarak bakteri tarafından üretilen sınırlandırıcı enzimler, biyolojik cerrah bıçakları olarak rol oynarlar ve insülin kodları gibi sadece özel nükleotidlerin uzantılarını tanırlar. Bu belli azot kökü çiftlerini ayırmayı mümkün kılar ve organizmaya ait kromozomdan DNA’yı kodlayan insülin kısmını ayırır böylece insülini üretebilir (Şekil 14) (22,25). DNA ligaz açığa çıkan nükleotidleri yapışkan uçlarından birbirine kaynaklayan genetik bir yapışkan, olarak hizmet eden bir enzimdir (2).

Şekil 14: İnsülin üretimi

4.7.3.Humulin Üretimi

Birinci basamak insülinin A ve B polipeptit zincirlerini karakterize eden özel nükleotid zincirlerini taşıyan DNA zincirlerini kimyasal olarak sentezlemektir. (Şekil 15) (2).

Şekil 15: İnsan insülini yapısı. amino grup asit RNA’dan DNA’ya dönüşüm.

Gerekli DNA zinciri tespit edilebilir çünkü her iki zincirin amino asit içeriklerinin şifresi çözülmüştür. A zincirini sentezlemek için altmış üç nükleotid ve B zinciri içinde doksan nükleotid gereklidir. Bu zincirlerin her birinin ucuna protein sentezinin bitirildiğini işaret eden artı bir kolon eklenir. Daha sonra bakteri hücresinin amino asidinden insülin proteininin ayrılmasına izin vermek için amino asit ile işbirliği yapan bir anti-kodon da, methionin, her bir zincirin başına yerleştirilir. Bundan sonra vektörün plazmidi içine taşınan B-galaktosidaz, bakteri enzimi için, sentetik A ve B zinciri “genler” gen içine ayrıca yerleştirilir. Bu safhada, sentetik genlerin kodonlarının B-galaktosidazınkilerle uyumlu olması hayati önem taşır (Şekil 16) (2).

Şekil 16: A ve B zincirlerinin E.coli plazmidleri içine yerleştirilmesi.

Rekombinant plazmidler daha sonra E. coli hücrelerine tanıtılırlar. Rekombinant DNA teknolojisinin insan insülini sentezindeki uygulamasında insülin verebilmek için insülin geni ile birleşecek plazmidleri olan milyonlarca bakteri kopyası gerektirir. İnsülin geni hücre içinde mitosize maruz kalan B-galaktosidaz ile birlikte kopyalandığında tanımlanır (şekil 17) (2).

Şekil 17: Mitosiz İşlemi

Oluşan protein insülinin A veya B zinciri ile birleşen B-galaktosidazın bir kısmını içerir. Daha sonra B-galaktosidaz parçacığından A ve B zincirleri tanımlanır ve arıtılır (Şekil18) (2).



Şekil 18: A veya B zinciri ile birleşen beta-galaktosidaz

Bu iki zincir karıştırılır ve disülfit geçiş köprülerini oluşturan bir reaksiyonda yeniden bağlanırlar ki bu da saf Humulin sentetik insan insülini ile sonuçlanır (Şekil 19) (2).

Şekil 19: İnsan İnsülini Molekülü

4.8.Genetik Olarak İşlenen Rekombinant İnsan İnsülininin Biyolojik İçerikleri

İnsan insülini bu şekilde bakteriler içinde yapılan tek hayvan proteinidir ki yapısı doğal molekülünki ile tamamen aynıdır (26,27). Bu, antikor üretimi ile sonuçlanan komplikasyon ihtimalini azaltmaktadır. Kimyasal ve farmakolojik çalışmalarda ticari olarak elde edilebilen rekombinant DNA insan insülininin pankreas tarafından üretilen insan insülininden ayırt edilemediği kanıtlanmıştır. Burada yüz yüze gelinen ana sorun ev sahibi hücreler ile son ürünün kirletilmesiydi ki bu da fermantasyon suyunda kirlenme riskini arttırmaktaydı. Bu tehlike arıtma işleminin işleme konulması ile kökünden halledildi. Son insülin ürünü bir seri testlere maruz bırakıldığında, ki buna en ince radyo imüno ayar teknikleri de dâhildir, hiçbir kirlilik tespit edilemez. Şimdi tüm prosedür büyüme aracı olarak maya hücreleri kullanılarak yapıldı, çünkü bunlar mükemmel üç boyutlu yapıda neredeyse tamamen insan insülini molekülü salgılarlar. Bu da karışık ve maliyetli arıtma işlemlerine ihtiyacı en aza indirir (26).

4.9.İnsülin üretimi için biyoteknolojik tesisler

Sadece Almanya’da her gün 800,000 insan kan şekeri düzeyini korumak için insülin kullanmak zorundadır. Genetik teknolojisinin son 30 yıldaki hızlı gelişimi, genetiği değiştirilmiş mikroorganizmaları kullanarak sınırsız miktarda ve yüksek kalitede insülin ve insülin analoglarını üretmeyi mümkün hale getirmiştir. Yeni analogların glargin insülin gibi üretimi için ise son derece modern biyoteknolojik tesisler gerekmektedir. Farmasötik tesislerin planlanması ve kurulması Dresden’de bulunan Linde Plant Construction (LKCA)’ın yeni atıldığı bir iş sahasıdır. Buna rağmen LKCA son on yılda farmasötik ve biyoteknolojik tesislerin planlanması, dizaynı ve kurulumu konusunda lider firma konumuna gelmiş durumdadır. LKCA bu alandaki ilk rolünü Nisan 2000’de yeni bir biyoteknolojik tesisin kurulumu sürecinde ‘genel planlayıcı’ olarak üstlenmiştir. Tesis, Frankfurt’ta bulunan Aventis Pharma için kurulacaktı ve tesiste genetik mühendisliği kullanılarak bir insülin türevi olan glargin insülin üretimi yapılacaktı. LKCA tesisi Aventis’e sadece 29 ay sonra başarılı bir şekilde teslim etti. (şekil 20-21) (28).