Vývoj inhibitorů halogenalkandehalogenas Bakalářská práce Brno 2011 Tomáš Buryška Instituce

4. Cíle práce

1. 
   Experimentální stanovení inhibičních účinků první sady potenciálních inhibitorů halogenalkandehalogenas, které byly navrženy na základě znalostí získaných z literatury (fluorované analogy dobrých substrátů a halogenované látky, u kterých nebyla pozorována aktivita v předchozích studiích).
   
2. 
   Identifikace nových substrátů halogenalkandehalogenas pomocí virtuálního screeningu a experimentální ověření testováním specifické aktivity.
   
3. 
   Měření inhibičního účinku druhé sady potenciálních inhibitorů identifikovaných na základě virtuálního screeningu a experimentálních testů specifických aktivit.
   

5. Materiály a metody

5.1 Materiály
5.1.1 Chemikálie

• 
  Bradfordovo činidlo (Sigma-Aldrich)
  
• 
  Methanol 99% (Sigma-Aldrich)
  
• 
  Ethanol (Destilerie Kojetín)
  
• 
  Kyselina dusičná 35% (Sigma-Aldrich)
  
• 
  Destilovaná voda
  
• 
  Bromid sodný (Sigma-Aldrich)
  
• 
  Chlorid sodný (Sigma-Aldrich)
  
• 
  Jodid sodný (Sigma-Aldrich)
  

5.1.2 Plyny

• 
  Hélium 5.5 99.9995% (Siad)
  
• 
  Dusík 5.0 99.999% (Siad)
  

5.1.3 Enzymy

• 
  LinB (halogenalkandehalogenasa ze Sphingobium japonicum UT26)
  
• 
  DbjA (halogenalkandehalogenasa z Bradyrhizobium japonicum USDA110)
  

5.1.4 Seznam halogenovaných látek

Tabulka 3: První sada potenciálních inhibitorů.
Naše číslo	Látka
605	1-fluorcyklohexan
603	1-fluorhexan
604	1-fluorpentan
395	1-chloro-2,2-dimethylpropan (neopentyl chlorid)

Tabulka 4: Látky z virtuálního screeningu substrátů (Sigma-Aldrich).
Naše číslo	Látka	Naše číslo	Látka
4	1-chlorbutan	145	cyklopropyl bromid
16	bromethan	147	bromcyklobutan
17	brompropan	220	3-brom-1-propen
47	1,2-dibromethan	223	2,3-dibrompropen
55	2-chlorpropan	282r	2-chlorcyklopentanon
61	2-brompropan	608	neopentyl iodid
62	2-brombutan	609	2-bromethylamin hydrobromid
72	1,2-dibrompropan	610	3-chlorprop-1-yn
84	1-brom-2-methyl-propan	611	1-brombut-2-en
116	bromcyklopentan	613	N-(2-chlorethyl)benzylamin hydrochlorid
138	chlorcyklopentan	624	1,1,2-tribrompropan

5.1.5 Roztoky a pufry
Glycinový pufr (100 mM)

• 
  7,5 g glycinu rozmícháno v 1 L destilované vody
  
• 
  pH upraveno na hodnotu 8,6 pomocí 1 M NaOH
  

Iwasakiho činidlo I (Iwasaki, Utsumi et al. 1952) I (1,4 mM)

• 
  0,45 g thiokyanátu rtuťnatého rozpuštěno ve 150 mL etanolu
  

Iwasakiho činidlo II (69,5 mM)

• 
  18,48 g síranu železito-amonného rozpuštěno ve 108 mL koncentrované kyseliny dusičné a 192 mL destilované vody
  

• 
  Oba roztoky byly nakalibrovány pomocí NaBr, NaCl, NaI o koncentraci 3,2 M jako standardy pro detekci halogenovaných iontů
  

5.1.6 Přístroje a laboratorní vybavení

• 
  Spektrofotometr Sunrise® RC (Tecan, Rakousko)
  
• 
  Vodní lázeň Thermostatic Grant GLS400 (Grant, Spojené království)
  
• 
  Finnigan Trace GC (Thermo Scientific, USA)
  
• 
  Finnigan Trace MS (Thermo Scientific, USA)
  
• 
  Finnigan Autosampler A200 (Thermo Scientific, USA)
  
• 
  GC kolona Zebron ZB-5ms (Phenomenex, USA)
  
• 
  Spektropolarimetr Jasco J‐810 (Jasco, Japonsko)
  
• 
  SFM-20 (BioLogic, Francie)
  
• 
  Termostat Polyscience 9101 (Polyscience, USA)
  
• 
  Minitřepačka (Gilson, USA)
  
• 
  Pipety Gilson Pipetteman® (Gilson, USA)
  
• 
  Erlenmeyerovy baňky 25 mL s uzavíratelným septem
  
• 
  Plastové špičky (Eppendorf, Německo)
  
• 
  Zkumavky Eppendorf® (Eppendorf, Německo)
  
• 
  Mikrotitrační destičky 96 jamkové (P-Lab, Česká republika)
  

5.1.7 Software

• 
  AUTO DOCK 4.0 (The Scripps Research Institute, USA)
  
• 
  OriginPro© 8.5 (OriginLab Corporation, USA)
  
• 
  MassFrontier™ 1.0 (HighChem, Slovensko)
  
• 
  Xcalibur™ 1.0 (Thermo, USA)
  
• 
  Magellan™ 2.2 (Tecan, USA)
  
• 
  Spectra Manager (Jasco, USA)
  

5.2 Metody
5.2.1 Měření specifické aktivity substrátu

Specifická aktivita enzymů byla stanovena s vybranými substráty při koncentraci 1 mM a 5 mM. Tyto hodnoty jsou blízké koncentracím K_m známých substrátů studovaných enzymů. Všechna měření specifické aktivity byla provedena ve trojím opakování, ve vodní lázni při 37°C.

Do Erlenmeyerovy baňky bylo napipetováno 10 mL glycinového pufru, následně přidán substrát do výsledné koncentrace 1 mM (nebo 5 mM). Pro každý substrát byl změřen také abiotický rozklad, který byl od výsledných specifických aktivit odečten. Byly připraveny tři druhy kontrolních vzorků (Tabulka 5).
Tabulka 5: Složení jednotlivých slepých vzorků.

Vzorek	Složení
1	100 μL HNO3, 1 mL glycinového pufru
2	100 μL HNO3, 1 mL glycinového pufru, 200 μL enzymu
3	100 μL HNO3, 1 mL substrátu z Erlenmeyerovy baňky

Reakce byla zahájena přídavkem 200 μL enzymu. Koncentrace LinB 0,2 mgmL^-1, DbjA 0,5 mgmL^-1, DmbA 0,6 mgmL^-1 byly určeny na základě dřívějších měření specifických aktivit s 1-chlorbutanem, který byl použit jako standard. Reakce byla vzorkována periodicky v časech 7, 14, 21 a 28 minut odebráním 1 mL reakční směsi a smícháním se 100 μL HNO₃. Do kontrolních vzorků a vzorků z reakční směsi bylo napipetováno 100 μL Iwasakiho činidla I a 200 μL Iwasakiho činidla II (Iwasaki, Utsumi et al. 1952), která slouží ke stanovení volných halogenových aniontů v roztoku. Absorbance vzniklého barevného komplexu byla stanovena na mikrotitrační destičce při 460 nm na spektrofotometru Sunrise RC. Výsledná reakční rychlost byla vyhodnocena ze závislosti produkce halogenidových iontů na reakčním čase.

5.2.2 Měření enzymové aktivity za pomocí GC-MS

V případě, že stanovení halogenů Iwasakiho metodou je pod detekčním limitem, je vhodné využít přístupu s vyšší citlivostí. Proto bylo použito ke sledování pomalých reakcí měření reakčních produktů metodou GC-MS s vysokou koncentrací enzymu a s nižším limitem detekce než Iwasakiho metoda. Reakce byla provedena v objemu 1 mL v autosamplerové vialce. Rekace byla zahájena smícháním 0,5 mL roztoku enzymu LinB (4,3 mgmL^-1) s 0,5 mL substrátu (37,5 mM). Paralelně bylo provedeno kontrolní měření abiotické degradace měřeného substrátu v nepřítomnosti enzymu. Reakce byly monitorovány periodicky každých 56 minut s celkovým počtem 24 odebraných vzorků z každé autosamplerové vialky. Reakční směs byla analyzována přímým nástřikem (1 μL) do split/splitlessového injektoru plynového chromatografu Trace GC vybaveného chromatografickou kolonou ZB-5MS (30 m, 0,25 mm, 0,25 μm 5% fenyl, 95% dimethylpolysiloxan). Teplota injektoru byla 250°C, dělicí poměr 1:50. Jako nosný plyn bylo použito helium s počátečním průtokem 0,6 mLmin^-1 (1 min), který byl následován postupným zvyšováním průtoku rychlostí 0,1 mLmin^-1min^-1 na konečných 2,0 mLmin^-1. Teplotní program pece začínal na teplotě 40°C po dobu 1min, následován teplotní rampou 20°Cmin^-1 do 260°C. Separované fragmenty byly po ionizaci elektrosprejem analyzovány na hmotnostním spektrometru Trace MS (detektor – kvadrupól). Kalibrace byla provedena s roztoky substrátu v methanolu, kde 100% odpovídalo 5 mM koncentraci substrátu. K ověření fragmentace analyzovaných látek byl použit MassFrontier 1.0. Celkové vyhodnocení bylo provedeno v programu Xcalibur 1.0.

5.2.3 Měření inhibice enzymové aktivity

Měření probíhala za stejných podmínek jako měření specifické aktivity. Pro stanovení vlivu potenciálního inhibitoru byla změřena specifická aktivita enzymu s 1,2-dibromethanem za přítomnosti a nepřítomnosti testovaného potenciálního inhibitoru. Vyhodnocení bylo provedeno srovnáním specifické aktivity za přítomnosti potenciálního inhibitoru vůči specifické aktivitě bez potenciálního inhibitoru. Do tří Erlenmeyerových baněk byl přidán pouze substrát do koncentrace 11,6 mM (odpovídá přídavku 10 μL do 10 mL), do dalších tří byl navíc přidán potenciální testovaný inhibitor do výsledné koncentrace 10 mM. V sedmé baňce byl 1-chlorbutan (9,5 mM), jako standard.

5.2.4 Virtuální screening substrátů

Virtuální screeninng substrátů byl proveden pomocí softwaru AutoDock 4.0. Knihovna sloučenin, jejichž komplementarita s vazebným místem enzymu byla studována, byla extrahována z databáze EDULISS (Hsin, Morgan et al. 2011). Její základní parametry byly: halogen na sp3 uhlíku, logP < 4, relativní molekulová hmotnost < 500. Celkem bylo získáno přes 41000 potenciálních substrátů. LogP < 4 bylo zadáno z praktických důvodů, aby bylo možné látku otestovat bez použití nepolárních rozpouštědel. Zvolená relativní molekulová hmotnost má také empirické důvody. Většina známých ligandů jsou relativně malé molekuly (Lipinski, Lombardo et al. 1997). U molekul s relativní molekulovou hmotností větší než 500 je vysoké riziko, že se stericky do aktivního centra nevejdou a nedojde k vazbě. Pro posouzení reaktivity potenciálních substrátů byl použit model NAC (Bruice and Benkovic 2000; Shurki, Strajbl et al. 2002). Model popisuje vliv hydrofobního prostředí v aktivním centru enzymu na snížení aktivační energie. Vychází z toho, že hydrofobní aktivní centrum enzymu obsahuje minimum solventu a molekula ligandu je proto pevněji fixována v určité pozici. Omezením volnosti ligandu se snižuje energie potřebná na jeho reorganizaci, která je v normálním vodném prostředí vyšší. Z toho plyne, že spontánní hydrolýzy probíhají pomaleji a s menší pravděpodobností než za přispění enzymové katalýzy. Důležitou roli hrají 2 základní parametry: vhodná orientace molekuly substrátu vzhledem k halogenid-stabilizujícím residuím a vzdálenost od katalytických reziduí. Molekuly, které splňují dané podmínky, mají pak snadnější přechod do tranzitního stavu. Jako kritérium pro reaktivitu byly vybrány následující parametry: vzdálenost halogenovaný uhlík-nukleofilní kyslík < 3,3 Å a vazebný úhel halogen-halogenovaný uhlík-nukleofilní kyslík > 142° (Obrázek 14). Byly screenovány celkem tři enzymy z rodiny haloalkandehalogenas: LinB, DbjA. Sada nejlepších potenciálních substrátů pro všechny enzymy byla vybrána k experimentální validaci.

5.2.5 Analýza vazby ligandů pomocí metody zastaveného toku

Kinetika a rovnováha vazby vybraného ligandu do aktivního místa halogenalkandehalogenas byla hodnocena metodou zastaveného toku. K tomuto účelu byl monitorován fluorescenční signál halogenid-stabilizujícího tryptofanu v aktivním místě enzymu a jeho změny (Obrázek 15A) v čase při interakci s ligandem. Během analýzy jsou proti sobě míchány roztok proteinu a ligandu vysokou rychlostí, odkud pokračují do detekční cely (Obrázek 15 B).

Obrázek 14: Benzylbromid v aktivním místě enzymu LinB se vzdáleností k nukleofilnímu kyslíku a vazebným úhlem vymezený trojicí atomů: halogen, halogenovaný (elektrofilní) uhlík a nukleofilní kyslík.



Obrázek 15: A Změna fluorescenčního signálu po navázání ligandu do aktivního místa proteinu. B Zařízení pro rychlé míchání proteinu a ligandu.
Injekční stříkačka A byla naplněna enzymem LinB (4,34 mgml^-1), stříkačka B roztokem ligandu. Použité koncentrace ligandu byly: 0,00; 0,15; 0,30; 0,60; 1,84; 2,39; 3,06; 4,77; 5,10; 6,37; 8,49 a 9,07 mM. Počáteční koncentrace ligandu byla ověřena na GC-MS, koncentrace proteinu Bradfordovým roztokem při 595 nm. K rychlému míchání roztoků byl použit instrument SFM-20 generující zastavený tok. Mrtvý čas přístroje, tj. čas potřebný od smíchání roztoků po jejich průtok místem detekce, byl 2,2 ms. Objemy smíchaných vzorků byly 60 μL od každého, objem detekční cely činil 15 μL. Detekce fluorescenčního signálu při excitační vlnové délce 295nm byla prováděna na přístroji Spektropolarimetr Jasco. Jako zdroj záření sloužila Xenonová lampa s přívodním napětím 705 V. Optiku chránila dusíková atmosféra pro zajištění větší citlivosti signálu. Data byla sbírána po dobu 2s s hustotou 1000 bodů na 1s. Pro každou koncentraci ligandu bylo provedeno 10 opakování. Fluorescence byla vyhodnocena v programu Origin 8.5, kde byla také stanovena rovnovážná vazebná konstanta. Ke stanovení rovnovážné vazebné konstanty byla použita Stern-Volmerova rovnice (Rovnice 1).

Rovnice 1: Stern-Volmerova rovnice popisující pokles hladiny relativní fluorescence v závislosti na koncentraci ligandu a rovnovážné vazebné konstantě.

Kde F_rel je relativní fluorescence, K_eq rovnovážná vazebná konstanta, X koncentrace ligandu a f je fluorescence protein-ligandového komplexu.


6. Výsledky
6.1 Hodnocení inhibičního účinku první sady potenciálních inhibitorů
Inhibiční účinky byly testovány se třemi fluorovanými látkami, strukturními analogy dobrých substrátů popsaných v literatuře: 1-fluorpentan, 1-fluorhexan a 1-fluorcyklohexan. Jako čtvrtý kandidát pro testování inhibičního účinku byla zvolena látka 1-chlor-2,2-dimethylpropan (neopentyl chlorid), která nevykazuje s halogenalkandehalogenasami aktivitu vlivem stérického bránění nukleofilnímu ataku na sp3 uhlík (Obrázek 15).

Obrázek 15: Strukturní vzorce první sady potenciálních inhibitorů.
Specifické aktivity byly stanoveny s první sadou potenciálních inhibitorů. Všechny látky první sady vykazovaly schopnost inhibovat aktivitu testované dehalogenasy (Tabulka 6). Nejvyšší účinek měl neopentyl chlorid, který způsobil poklesem relativní specifické aktivity enzymu LinB s 1,2-dibrometanem o 80,3%.


Graf 1: Závislost koncentrace produktu v čase za přítomnosti a nepřítomnosti testovaného potenciálního inhibitoru. Všechny reakce byly provedeny s LinB.
Tabulka 6: Relativní specifické aktivity první sady potenciálních inhibitorů.

Látka	Rel. aktivita (%)
1-fluorhexan	27,2
1-fluorcyklohexan	37,5
1-fluorpentan	42,9
neopentyl chlorid	19,7

6.2 Experimentální stanovení specifických aktivit nových substrátů

Virtuálním screeningem bylo vybráno 102 molekul pro experimentální ověření. Některé identifikované molekuly obsahují dusíkové heteroatomy, které nejsou u známých substrátů přítomny.

Tabulka 7: Relativní specifické aktivity látek z virtuálního screeningu. ND – nad limitem detekce metody, NA – neaktivní, NM – nezměřeno.

#	název substrátu	enzym
		LinB (0,2 mg∙mL^-1)			DbjA (0,5 mg∙mL^-1)
		1mM		5mM	1mM	5mM
		[%]			[%]
4	1-chlorbutan	100	100		100	100
16	bromethan	224	933		170	1202
17	brompropan	583	894		349	771
47	1,2-dibromethan	330	806		313	1609
55	2-chlorpropan	20	30		20	41
61	2-brompropan	269	323		330	861
62	2-brombutan	77	87		339	491
72	1,2-dibrmopropan	614	694		153	1211
84	1-brom-2-methyl-propan	198	269		157	489
116	bromcyklopentan	ND	ND		300	691
138	chlorcyklopentan	91	167		174	503
145	cyklopropyl bromid	NA	NA		NA	NA
220	3-bromprop-1-en	738	NM		1993	NM
282r	2-chlorcyklopentanon	502	NM		604	NM
608	neopentyl jodid	ND	19		NM	34
610	3-chloroprop-1-yne	ND	ND		ND	54

Nejvyšší relativní specifická aktivita byla změřena s 3-bromoprop-1-enem, který byl zároveň rychle abioticky degradován, a proto u tohoto substrátu nebyla změřena specifická aktivita při 5 mM. Vysokou aktivitu vykazovaly také substráty 1,2-dibromethan a 1,2-dibrompropan. 1,2-dibromethan už byl dříve znám jako substrát s vysokou specifickou aktivitou (Kmunicek, Hynkova et al. 2005), proto byl použit při měření inhibice. Naopak velmi nízká relativní specifická aktivita byla stanovena u neopentyl jodidu a je zřejmá podobnost s nereaktivní molekulou neopentyl chloridu, kde dochází k prostorovému bránění reakci, ale díky delší vazbě uhlík-jód reakce probíhá. Ostatní látky se ukázaly být relativně dobrými substráty. Nově identifikovaným typem substrátu byl 2-chlorcyklopentanon. N-(2-chloroethyl)beznylamin hydrochlorid byl takřka nerozpustný v glycinovém pufru. 2-bromoethylamin hydrobromid, 1-brombut-2-en a 1,1,2-tribrompropan, bromocyklobutan měly samovolný abiotický rozklad tak vysoký, že za použitých podmínek by měření specifické aktivity byly těžko stanovitelné.

Během testování byla identifikována jedna halogenovaná látka, která nevykazovala žádnou aktivitu. Tato látka je bromocyklopropan. Abychom vyloučili, že se nejedná o velmi pomalou reakci, bylo provedeno vysoce citlivé měření aktivity pomocí GC-MS. Z výsledku měření aktivity po dobu více než 21 hodin (Graf 2) vyplývá, že cyklopropyl bromid nebyl působením halogenalkandehalogenasy LinB odbouráván.