Vývoj inhibitorů halogenalkandehalogenas Bakalářská práce Brno 2011 Tomáš Buryška Instituce

Graf 2: Úbytek koncentrace cyklopropyl bromidu v čase. Šedá barva byla použita pro abiotický rozklad, černá pro reakci s LinB.
V první fázi byly otestovány komerčně dostupné látky (Tabulka 4). Seznam nejlepších substrátů obsahoval také látky, které nejsou komerčně dostupné. Některé z nich byly vyhledány v databázi NCI (Národní rakovinný institut USA), objednány a jejich testování v současné době probíhá. Zbylé látky bude nutné připravit organickou syntézou.

6.3 Hodnocení inhibičního účinku druhé sady potenciálních inhibitorů
Z předchozích měření vyplývá, že cyklopropyl bromid nelze enzymaticky pomocí halogenalkandehalogenas odbourat. Pro vysokou podobnost s molekulami běžných substrátů lze předpokládat vazbu do aktivního místa enzymů, čímž by mohla inhibovat enzymatickou reakci. Proto byl cyklopropyl bromid otestován stejným způsobem (Graf 3) jako molekuly první sady, aby bylo možné provést porovnání.
Z experimentálního hodnocení specifických aktivit látek virtuálního screeningu (Tabulka 7) je dále patrné, že jedním ze substrátů s nejvyšší specifickou aktivitou je 1,2-dibrompropan. Je známo, že dibromované krátké alkany jsou substráty s vysokou specifickou aktivitou (Koudelakova, Chovancova et al. 2011). Dalším otestovaným potenciálním inhibitorem byl 1,3-difluorpropan, který je nereaktivním analogem tohoto typu sloučenin. Naměřený pokles specifické aktivity za přítomnosti 1,3-difluorpropanu je statisticky nevýznamný a pravděpodobně nezpůsobuje hledaný inhibiční účinek (Graf 3).

Graf 3: Specifická aktivita LinB za přítomnosti a nepřítomnosti 1,3-difluorpropanu, respektive cyklopropyl bromidu.
Tabulka 8: Relativní aktivity LinB za přítomnosti druhé sady potenciálních inhibitorů.

Látka	Relativní aktivita (%)
1,3-difluorpropan	87,1
cyklopropyl bromid	67,6

6.4 Hodnocení vazby cyklopropyl bromidu pomocí metody zastaveného toku
Cílem měření bylo zjistit, zda se cyklopropyl bromid váže do aktivního místa enzymu a interaguje s halogenid-stabilizujícími rezidui. Tento fakt se projevuje jako pokles fluorescenčního signálu tryptofanů s rostoucí koncentrací cyklopropyl bromidu v aktivním místě enzymu. Koncentrace saturovaného roztoku cyklopropyl bromidu byla ověřena pomocí GC-MS. Experimenty ukázaly (Graf 4), že přítomnost cyklopropyl bromidu ovlivňuje fluorescenci.

Graf 4: Relativní fluorescence tryptofanů v aktivním místě LinB za přítomnosti cyklopropyl bromidu.
Fluorescenční data získaná metodou zastaveného toku byla proložena Stern-Volmerovým modelem s využitím programu OriginPro 8.5. Vypočtená hodnota rovnovážné vazebné konstanty cyklopropyl bromidu byla 1,4 ± 0,4 mM^-1. Relativně nízká vazebná konstanta koresponduje se slabým inhibičním účinkem této látky na aktivitu haloalkandehalogenasy LinB (Graf 3).

7. Diskuze
První částí této práce bylo měření reziduálních aktivit první sady potenciálních inhibitorů. Tři z těchto potenciálních inhibitorů jsou fluorované analogy dobrých substrátů. Využívají neschopnosti halogenalkandehalogenas štěpit kovalentní vazbu uhlík-fluor. Problémem by mohla být krátká vzdálenost atomu fluoru od uhlíku, čímž by nemuselo dojít k dostatečně silné interakci s nukleofilním kyslíkem aspartátu. Čtvrtá látka využívá konceptu prostorového uspořádání substituentů na uhlíkové kostře, které předpokládá bránění nukleofilnímu ataku. Všechny látky ukázaly významnou inhibici specifické aktivity halogenalkandehalogenas (Graf 5), nicméně s ohledem k vysokým koncentracím potřebným k pozorované inhibici lze předpokládat slabou vazbu těchto prvních inhibitorů do aktivního místa těchto enzymů.

Graf 5: Srovnání relativních reziduálních aktivit potenciálních inhibitorů.
Následně byl proveden virtuální screening k nalezení nových substrátů. Nejlepší potenciální substráty byly experimentálně otestovány s enzymy DbjA a LinB na jejich specifickou aktivitu. V případě, že se látka ukázala nereaktivní, bylo provedeno kontrolní měření na GC-MS pro detekci velmi pomalé enzymatické reakce. Do druhé sady experimentálně testovaných potenciálních inhibitorů byly zahrnuty dvě látky. První z nich byl nereaktivní cyklopropyl bromid. Druhou látkou je odpovídající nereaktivní strukturní analog nejlepších substrátů– 1,3-difluorpropan. Stejně jako v případě první sady inhibitorů nebyly pozorovány dostatečné silné inhibiční účinky (Graf 5). Jejich rovnovážná vazebná konstanta je odhadována v jednotkách až desítkách mM^-1. Rovnovážné konstanty vazby používaných léčiv na jejich cílové receptory se pohybují v řádech nM^-1 až pM^-1 (Babine and Bender 1997; Livnah, Bayer et al. 1993). Tyto první identifikované inhibitory haloalkandehalogenas nesplňují parametry účinných léčiv, proto bude nutné pokračovat v navazajících projektech v hledání dalších možných kandidátů nebo modifikaci kandidátů stávajících.

8. Shrnutí

• 
  Byl ověřen koncept založený na designu inhibitoru vycházejícího z fluorovaných analogů nejlepších substrátů. Nejvyšší relativní inhibice bylo dosaženo s 1-fluorhexanem, kde specifická aktivita testované dehalogenasy poklesla o 73%.
  
• 
  Měřením specifické aktivity s neopentyl chloridem ukázalo na vazbu této nereaktivní molekuly do aktivního místa enzymu. Relativní specifická aktivita LinB poklesla v přítomnosti neopentyl chůloridu o 81%, což byl nejsilnější inhibiční účinek ze všech testovaných látek.
  
• 
  Nové substráty identifikované s použitím virtuálního screeningu vykazovaly relativně vysoké specifické aktivity. Nejvyšší specifické aktivity vykazovaly dibromované ethany a propany.
  
• 
  Potenciální inhibiční účinek byl testován s fluorovaným strukturním analogem těchto dobrých substrátů, 1,3-difluorpropanem. Pokles specifické aktivity za přítomnosti 1,3-difluorpropanu o 13% není významný, což ukazuje na velmi slabou inhibici.
  
• 
  Nereaktivní substrát cyklopropyl bromid byl taktéž otestován jako potenciální inhibitor. Výsledná reziduální aktivita testované dehalogenasy v přítomnosti cyklopropyl bromidu byla 67%. Měření fluorescence zastaveného toku s cyklopropyl bromidem ukázalo, že rovnovážná vazebná konstanta je 1,4 mM^-1.
  
• 
  Tato práce identifikovala pět inhibitorů halogenalkandehalogenas. Jedná se o vůbec první inhibitory těchto enzymů. Jejich účinek zatím nedosahuje dostatečných hodnot pro uplatnění ve farmaceutickém průmyslu. Proto je nutné pokračovat v hledání a designu novýh účinnějších inhibitorů.
  

9. Reference

Abbas, A. K. and A. H. Lichtman (2010). Basic immunology : functions and disorders of the immune system. Philadelphia, Pa., Saunders/Elsevier.

Abbas, A. K., A. H. Lichtman, et al. (2010). Cellular and molecular immunology. Philadelphia, Pa., Saunders.

Albert, K., M. Krucker, et al. (2002). Hyphenated techniques. Anal Bioanal Chem 372: 25-26.

Allen, E. E. and D. H. Bartlett (2002). Structure and regulation of the omega-3 polyunsaturated fatty acid synthase genes from the deep-sea bacterium Photobacterium profundum strain SS9. Microbiology 148: 1903-1913.

Armfield, S. J., P. J. Sallis, et al. (1995). Dehalogenation of haloalkanes by Rhodococcus erythropolis Y2. Biodegradation 6: 237-246.

Babine, R. E. and S. L. Bender (1997). Molecular recognition of proteinminus signligand complexes: applications to drug design. Chem Rev 97: 1359-1472.

Berman, H. M., J. Westbrook, et al. (2000). The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research 28: 235-242.

Bogunia-Kubik, K. and M. Sugisaka (2002). From molecular biology to nanotechnology and nanomedicine." Biosystems 65: 123-138.

Bohac, M., Y. Nagata, et al. (2002). Halide-stabilizing residues of haloalkane dehalogenases studied by quantum mechanic calculations and site-directed mutagenesis. Biochemistry 41: 14272-14280.

Bosma, T., J. Damborsky, et al. (2002). Biodegradation of 1,2,3-trichloropropane through directed evolution and heterologous expression of a haloalkane dehalogenase gene. Applied and Environmental Microbiology 68: 3582-3587.

Boyd Donald, B. (1999). Is rational design good for anything? Rational Drug Design, American Chemical Society. 719: 346-356.

Bruice, T. C. and S. J. Benkovic (2000). Chemical basis for enzyme catalysis. Biochemistry 39: 6267-6274.

Coyne, A. G., D. E. Scott, et al. (2010). Drugging challenging targets using fragment-based approaches. Curr Opin Chem Biol 14: 299-307.

Craig, P. N. and H. M. Ebert (1969). Eleven Years' Experience with S K & F Structure Fragment Code. Journal of Chemical Documentation 9: 141-146.

Cramer, R. D., G. Redl, et al. (1974). Substructural analysis. Novel approach to the problem of drug design. Journal of Medicinal Chemistry 17: 533-535.

Crooks, G. P., L. Xu, et al. (1995). Exploration of possible mechanisms for 4-chlorobenzoyl CoA dehalogenase: Evidence for an aryl-enzyme intermediate. Journal of the American Chemical Society 117: 10791-10798.

Curragh, H., O. Flynn, et al. (1994). Haloalkane degradation and assimilation by Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13064. Microbiology 140: 1433-1442.

Curtis, A. and C. Wilkinson (2001). Nantotechniques and approaches in biotechnology. Trends in Biotechnology 19: 97-101.

Damborsky, J. (1997). Quantitative structure-function relationships of the single-point mutants of haloalkane dehalogenase: A multivariate approach. Quantitative Structure-Activity Relationships 16: 126-135.

Damborsky, J. and J. Koca (1999). Analysis of the reaction mechanism and substrate specificity of haloalkane dehalogenases by sequential and structural comparisons. Protein Engineering 12: 989-998.

Damborsky, J., M. G. Nyandoroh, et al. (1997). Some biochemical properties and classification of a range of bacterial haloalkane dehalogenases. Biotechnology and Applied Biochemistry 26: 19-25.

Damborsky, J., E. Rorije, et al. (2001). Structure-specificity relationships for haloalkane dehalogenases. Environmental Toxicology and Chemistry 20: 2681-2689.

de Mello, A. (2002). Miniaturization. Analytical and Bioanalytical Chemistry 372: 12-13.

deSouza, M. L., J. Seffernick, et al. (1998). The atrazine catabolism genes atzABC are widespread and highly conserved. Journal of Bacteriology 180: 1951-1954.

Dewar, M. J. S. and D. M. Storch (1985). Alternative view of enzyme reactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82: 2225-2229.

DeWitte Robert, S. and I. Shakhnovich Eugene (1999). SmoG: A Ligand Design Method Based on Knowledge-Based Parametrization of a Solvent Reorganization Model. Rational Drug Design, American Chemical Society. 719: 70-86.

Endo, R., Y. Ohtsubo, et al. (2006). Growth inhibition by metabolites of gamma-hexachlorocyclohexane in Sphingobium japonicum UT26. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 70: 1029-1032.

Fetzner, S. (1998). Bacterial dehalogenation. Applied Microbiology and Biotechnology 50: 633-657.

Fromm, H. J. and D. R. Nelson (1962). Ribitol dehydrogenase. III. Kinetic studies with product inhibition. J Biol Chem 237: 215-220.

Ghose Arup, K., N. Viswanadhan Veharkad, et al. (1999). Adapting structure-based drug design in the paradigm of combinatorial chemistry and high-throughput screening. Rational Drug Design, American Chemical Society. 719: 226-238.

Goldman, P. (1965). The enzymatic cleavage of the carbon - fluorine bond in fluoroacetate. Journal of Biological Chemistry 240: 3434-3438.

Goldman, P., G. W. Milne, et al. (1968). Carbon-halogen bond cleavage. III. Studies on bacterial halidohydrolases. Journal of Biological Chemistry 243: 428-434.

Guetens, G., K. Van Cauwenberghe, et al. (2000). Nanotechnology in bio/clinical analysis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 739: 139-150.

Gund, P., J. D. Andose, et al. (1980). Three-dimensional molecular modeling and drug design. Science 208(4451): 1425-1431.

Hedstrom, L. (2002). Serine protease mechanism and specificity. Chem Rev 102: 4501-4524.

Heppel, L. A., B. Highman, et al. (1948). Toxicology of 1,2-dichloropropane (propylene dichloride) effects of repeated exposures to a low concentration of the vapor. J Ind Hyg Toxicol 30: 189-191.

Heppel, L. A. and V. T. Porterfield (1948). Enzymatic cleavage of organic halides. Fed Proc 7(1 Pt 1): 159.

Heppel, L. A. and V. T. Porterfield (1948). Enzymatic dehalogenation of certain brominated and chlorinated compounds. J Biol Chem 176: 763-769.

Hsin, K. Y., H. P. Morgan, et al. (2011). EDULISS: a small-molecule database with data-mining and pharmacophore searching capabilities. Nucleic Acids Res 39: D1042-1048.

Hughes, I. and D. Hunter (2001). Techniques for analysis and purification in high-throughput chemistry. Current Opinion in Chemical Biology 5: 243-247.

Chan, W. Y. Y., Alexander; Edwards, Elizabeth A.; Pai, Emil F. (2008). Breaking carbon-fluorine bonds – crystal structure of defluorinase. Canadian Light Source.

Chopra, I. J. and G. N. Chua Teco (1982). Characteristics of inner ring (3 or 5) monodeiodination of 3,5-diiodothyronine in rat liver: evidence suggesting marked similarities of inner and outer ring deiodinases for iodothyronines. Endocrinology 110: 89-97.

Chovancova, E., J. Kosinski, et al. (2007). Phylogenetic analysis of haloalkane dehalogenases. Proteins-Structure Function and Bioinformatics 67: 305-316.

Imai, R., Y. Nagata, et al. (1991). Molecular cloning of a Pseudomonas paucimobilis gene encoding a 17-kilodalton polypeptide that eliminates HCl molecules from gamma-hexachlorocyclohexane. Journal of Bacteriology 173: 6811-6819.

Irwin, J. J. and B. K. Shoichet (2005). ZINC--a free database of commercially available compounds for virtual screening. Journal of Chemical Information and Modeling 45: 177-182.

Ito, M., Z. Prokop, et al. (2007). Degradation of beta-hexachlorocyclohexane by haloalkane dehalogenase LinB from gamma-hexachlorocyclohexane-utilizing bacterium Sphingobium sp. MI1205. Archives in Microbiology 188: 313-325.

Iwasaki, I., S. Utsumi, et al. (1952). New colorimetric determination of chloride using mercuric thiocyanate and ferric ion. Bulletin of the Chemical Society of Japan 25: 226.

Janssen, D. B. (1994). Degradation of halogenated aliphatic compounds: the role of adaptation. BioEngineering 4: 55-56.

Janssen, D. B. (2004). Evolving haloalkane dehalogenases. Current Opinion in Chemical Biology 8: 150-159.

Janssen, D. B. (2007). Biocatalysis by dehalogenating enzymes. Advances in Applied Microbiology 61: 233-252.

Janssen, D. B., J. Gerritse, et al. (1988). Purification and characterization of a bacterial dehalogenase with activity toward halogenated alkanes, alcohols and ethers. European Journal of Biochemistry 171: 67-72.

Janssen, D. B., F. Pries, et al. (1996). Mechanism and specificity of haloalkane dehalogenase, an enzyme capable of hydrolyzing chlorinated aliphatic hydrocarbons. European Journal of Biochemistry 224: 47.

Janssen, D. B., F. Pries, et al. (1994). Genetics and biochemistry of dehalogenating enzymes. Annual Review of Microbiology 48: 163-191.

Janssen, D. B., J. R. van der Ploeg, et al. (1994). Genetics and biochemistry of 1,2-dichloroethane degradation. Biodegradation 5: 249-257.

Jones, G., P. Willett, et al. (1999). Further Development of a Genetic Algorithm for Ligand Docking and Its Application to Screening Combinatorial Libraries. Rational Drug Design, American Chemical Society. 719: 271-291.

Kaneko, T., Y. Nakamura, et al. (2000). Complete genome structure of the nitrogen-fixing symbiotic bacterium Mesorhizobium loti. DNA Research 7: 331-338.

Kaneko, T., Y. Nakamura, et al. (2002). Complete genomic sequence of nitrogen-fixing symbiotic bacterium Bradyrhizobium japonicum USDA110. DNA Research 9: 189-197.

Kettle, A. J. (1996). Neutrophils convert tyrosyl residues in albumin to chlorotyrosine. FEBS Lett 379: 103-106.

Keuning, S., D. B. Janssen, et al. (1985). Purification and characterization of hydrolytic haloalkane dehalogenase from Xanthobacter autotrophicus GJ10. Journal of Bacteriology 163: 635-639.

Kier, L. B. (1967). Molecular orbital calculation of preferred conformations of acetylcholine, muscarine, and muscarone. Mol Pharmacol 3: 487-494.

Kmunicek, J., K. Hynkova, et al. (2005). Quantitative analysis of substrate specificity of haloalkane dehalogenase LinB from Sphingomonas paucimobilis UT26. Biochemistry 44: 3390-3401.

Knight, J. (2002). Microfluidics: Honey, I shrunk the lab. Nature 418: 474-475.

Knipfer, N., A. Seth, et al. (1999). Species variation in ATP-dependent protein degradation: protease profiles differ between mycobacteria and protease functions differ between Mycobacterium smegmatis and Escherichia coli. Gene 231: 95-104.

Kohler, R., A. Brokamp, et al. (1998). Characteristics and DNA-sequence of a cryptic haloalkanoic acid dehalogenase from Agrobacterium tumefaciens RS5. Current Microbiology 36: 96-101.

Koudelakova, T., E. Chovancova, et al. (2011)."Substrate specificity of haloalkane dehalogenases. Biochemical Journal 435: 345-354.

Krantz, A. (1992). A classification of enzyme inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2: 1327-1334.

Kricka, L. J. (1998). Miniaturization of analytical systems. Clinical Chemistry 44: 2008-2014.

Kricka, L. J. (2001). Microchips, microarrays, biochips and nanochips: personal laboratories for the 21st century. Clinica Chimica Acta 307: 219-223.

Kyranos, J. N., H. Cai, et al. (2001). High-throughput high-performance liquid chromatography/mass spectrometry for modern drug discovery. Curr Opin Biotechnol 12: 105-111.

Kyranos, J. N., H. Cai, et al. (2001). High-throughput techniques for compound characterization and purification. Curr Opin Drug Discov Devel 4: 719-728.

Laval, J. M., P. E. Mazeran, et al. (1999). Nanobiotechnology and its role in the development of new analytical devices. Analyst 125: 29-33.

Lipinski, C. A., F. Lombardo, et al. (1997). Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Advanced Drug Delivery Reviews 23: 3-25.

Livnah, O., E. A. Bayer, et al. (1993). Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proc Natl Acad Sci USA 90: 5076-5080.

Luckner, S. R., C. A. Machutta, et al. (2009). Crystal structures of Mycobacterium tuberculosis KasA show mode of action within cell wall biosynthesis and its inhibition by thiolactomycin. Structure 17: 1004-1013.

Mandal, S., M. Moudgil, et al. (2009). Rational drug design. Eur J Pharmacol 625: 90-100.

Marek, J., J. Vevodova, et al. (2000). Crystal structure of the haloalkane dehalogenase from Sphingomonas paucimobilis UT26. Biochemistry 39: 14082-14086.

Mattos, C. and D. Ringe (1996). Locating and characterizing binding sites on proteins. Nat Biotechnol 14: 595-599.

Meßmer, M., S. Reinhardt, et al. (1996). Studies on methyl chloride dehalogenase and O-demethylase in cell extracts of the homoacetogen strain MC based on a newly developed coupled enzyme assay. Archives of Microbiology 165: 18-25.

Meßmer, M., G. Wohlfarth, et al. (1993). Methyl chloride metabolism of the strictly anaerobic, methyl chloride-utilizing homoacetogen strain MC. Archives of Microbiology 160: 383-387.

Michne, W. F. (1996). Hit-to-lead chemistry: a key element in new lead generation. Pharmaceut. News 3: 3.

Miranker, A. and M. Karplus (1991). Functionality maps of binding sites: a multiple copy simultaneous search method. Proteins 11: 29-34.

Motosugi, K., N. Esaki, et al. (1982). Bacterial assimilation of D- and L-2-chloropropionates and occurrence of a new dehalogenase. Arch Microbiol 131: 179-183.

Motosugi, K., N. Esaki, et al. (1982). Purification and properties of a new enzyme, DL-2-haloacid dehalogenase, from Pseudomonas sp. J Bacteriol 150: 522-527.

Muller, R., R. H. Oltmanns, et al. (1988). Enzymatic dehalogenation of 4-chlorobenzoate by extracts from Arthrobacter sp. SU DSM 20407. Biol Chem Hoppe Seyler 369: 567-571.

Nagata, Y., A. Futamura, et al. (1999). Two different types of dehalogenases, LinA and LinB, involved in gamma-hexachlorocyclohexane degradation in Sphingomonas paucimobilis UT26 are localized in the periplasmic space without molecular processing. Journal of Bacteriology 181: 5409-5413.

Nagata, Y., K. Miyauchi, et al. (1997). Purification and characterization of haloalkane dehalogenase of a new substrate class from a gammahexachlorocyclohexane-degrading bacterium, Sphingomonas paucimobilis UT26. Applied and Environmental Microbiology 63: 3707-3710.

Newman, J., T. S. Peat, et al. (1999). Haloalkane dehalogenases: Structure of a Rhodococcus enzyme. Biochemistry 38: 16105-16114.

Nienaber, V. L., P. L. Richardson, et al. (2000). Discovering novel ligands for macromolecules using X-ray crystallographic screening. Nat Biotechnol 18: 1105-1108.

Nierman, W. C., T. V. Feldblyum, et al. (2001). Complete genome sequence of Caulobacter crescentus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98: 4136-4141.

O'Hagan, D. and J. W. Schmidberger (2010). Enzymes that catalyse SN2 reaction mechanisms. Nat Prod Rep 27: 900-918.

Okai, M., K. Kubota, et al. (2009). Crystallization and preliminary X-ray analysis of gamma-hexachlorocyclohexane dehydrochlorinase LinA from Sphingobium japonicum UT26. Acta Crystallographica Section F-Structural Biology and Crystallization Communications 65: 822-824.

Oprea, T. (2002). Current trends in lead discovery: Are we looking for the appropriate properties? Journal of Computer-Aided Molecular Design 16: 325-334.

Otyepka, M., P. Banas, et al. (2008). Second step of hydrolytic dehalogenation in haloalkane dehalogenase investigated by QM/MM methods. Proteins-Structure Function and Bioinformatics 70: 707-717.

Pal, R., S. Bala, et al. (2005). Hexachlorocyclohexane-degrading bacterial strains Sphingomonas paucimobilis B90A, UT26 and Sp., having similar lin genes, represent three distinct species, Sphingobium indicum sp. nov., Sphingobium japonicum sp. nov. and Sphingobium francense sp. nov., and reclassification of [Sphingomonas] chungbukensis as Sphingobium chungbukense comb. nov. International Journal of Systematic Evolution and Microbiology 55: 1965-1972.

Patani, G. A. and E. J. LaVoie (1996). Bioisosterism: A rational pproach in drug design. Chem Rev 96: 3147-3176.

Pavelka, A., E. Chovancova, et al. (2009). HotSpot Wizard: a web server for identification of hot spots in protein engineering. Nucleic Acids Research 37: W376-W383.

Poelarends, G. J., R. Saunier, et al. (2001). trans-3-chloroacrylic acid dehalogenase from Pseudomonas pavonaceae 170 shares structural and mechanistic similarities with 4-oxalocrotonate tautomerase. Journal of Bacteriology 183: 4269-4277.

Prokop, Z., M. Monincova, et al. (2003). Catalytic mechamism of the haloalkane dehalogenase LinB from Sphingomonas paucimobilis UT26. Journal of Biological Chemistry 278: 45094-45100.

Prudnikova, T., T. Mozga, et al. (2009). Crystallization and preliminary X-ray analysis of a novel haloalkane dehalogenase DbeA from Bradyrhizobium elkani USDA94. Acta Crystallographica Section F-Structural Biology and Crystallization Communications 65: 353-356.

Reddy, M. R. and L. Parrill Abby (1999). Overview of rational drug design. Rational Drug Design, American Chemical Society. 719: 1-11.

Sallis, P. J., S. J. Armfield, et al. (1990). Isolation and characterization of a haloalkane halidohydrolase from Rhodococcus erythropolis Y2. Journal of General Microbiology 136: 115-120.

Sato, Y., M. Monincova, et al. (2005). Two rhizobial strains, Mesorhizobium loti MAFF303099 and Bradyrhizobium japonicum USDA110, encode haloalkane dehalogenases with novel structures and substrate specificities. Applied and Environmental Microbiology 71: 4372-4379.

Shuker, S. B., P. J. Hajduk, et al. (1996). Discovering high-affinity ligands for proteins: SAR by NMR. Science 274: 1531-1534.

Shurki, A., M. Strajbl, et al. (2002). How much do enzymes really gain by restraining their reacting fragments? Journal of American Chemical Society 124: 4097-4107.

Schanstra, J. P. (1996). Haloalkane dehalogenase engineering: kinetics and specificity, University of Groningen. Groningen.

Schanstra, J. P. and D. B. Janssen (1996). Kinetics of halide release of haloalkane dehalogenase: evidence for a slow conformational change. Biochemistry 35: 5624-5632.

Schanstra, J. P., J. Kingma, et al. (1996). Specificity and kinetics of haloalkane dehalogenase. Journal of Biological Chemistry 271: 14747-14753.

Schanstra, J. P., I. S. Ridder, et al. (1996). Kinetic characterization and X-ray structure of a mutant of haloalkane dehalogenase with higher catalytic activity and modified substrate range. Biochemistry 35: 13186-13195.

Scholtz, R., T. Leisinger, et al. (1987). Characterization of 1-chlorohexane halidohydrolase, a dehalogenase of wide substrate range from an Arthrobacter sp.. Journal of Bacteriology 169: 5016-5021.

Simpson, A. J., F. C. Reinach, et al. (2000). The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. The Xylella fastidiosa Consortium of the Organization for Nucleotide Sequencing and Analysis. Nature 406: 151-157.

Slater, J. H., A. T. Bull, et al. (1995). Microbial dehalogenation. Biodegradation 6: 181-189.

Smith, J. M., K. Harrison, et al. (1990). Purification and Characterization of D-2-haloacid Dehalogenase from Pseudomonas putida strain AJ1/23. Journal of General Microbiology 136: 881-886.

Song, J.-S. and C.-K. Kim (unpublished). X. flavus UE-15 dhlA gene and insertion element.

Stahl, M., W. Guba, et al. (2006). Integrating molecular design resources within modern drug discovery research: the Roche experience. Drug Discov Today 11: 326-333.

Sweedler, J. V. (2002). The continued evolution of hyphenated instruments. Anal Bioanal Chem 373: 321-322.

Vannelli, T., A. Studer, et al. (1998). Chloromethane metabolism by Methylobacterium sp. strain CM4. Applied and Environmental Microbiology 64: 1933-1936.

Verschueren, K. H. G., J. Kingma, et al. (1993). Crystallographic and fluorescence studies of the interaction of haloalkane dehalogenase with halide ions. Studies with halide compounds reveal a halide binding site in the active site. Biochemistry 32: 9031-9037.

Vezzi, A., S. Campanaro, et al. (upublished). Genome analysis of Photobacterium profundum reveals the complexity of high pressure adaptations.

Weightman, A. J., A. L. Weightman, et al. (1982). Stereospecificity of 2-monochloropropionate dehalogenation by the two dehalogenases of Pseudomonas putida PP3: evidence for two different dehalogenation mechanisms. J Gen Microbiol 128: 1755-1762.

Willett, P. (2000). Chemoinformatics - similarity and diversity in chemical libraries. Current Opinion in Biotechnology 11: 85-88.

Winterbourn, C. C. (1985). Comparative reactivities of various biological compounds with myeloperoxidase-hydrogen peroxide-chloride, and similarity of the oxidant to hypochlorite. Biochim Biophys Acta 840: 204-210.

Winterbourn, C. C. and S. O. Brennan (1997). Characterization of the oxidation products of the reaction between reduced glutathione and hypochlorous acid. Biochem J 326: 87-92.

Winterbourn, C. C. and A. J. Kettle (2000). Biomarkers of myeloperoxidase-derived hypochlorous acid. Free Radic Biol Med 29: 403-409.

Wood, E. J. (1996). Harper's biochemistry 24th edition : by R K Murray, D K Granner, P A Mayes and V W Rodwell. pp 868. Appleton & Lange, Stamford, CT. 1996. Biochemical Education 24: 237-237.

Yan, Z. Y. and Z. H. Ding (2009). Genome-wide identification of exported proteins of the novel bacterium Phenylobacterium zucineum HLK1(T) using a consensus computational strategy. Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 38: 174-180.

Yokota, T., T. Omori, et al. (1987). Purification and properties of haloalkane dehalogenase from Corynebacterium sp. strain m15-3. Journal of Bacteriology 169: 4049-4054.