Vývoj inhibitorů halogenalkandehalogenas Bakalářská práce Brno 2011 Tomáš Buryška Instituce

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Ústav biochemie

Vývoj inhibitorů halogenalkandehalogenas

Bakalářská práce

Brno 2011 Tomáš Buryška

Instituce: Loschmidtovy laboratoře, Ústav experimentální biologie,

Přírodovědecká fakulta, Masarykova Universita, Brno

Vedoucí práce: RNDr. Zbyněk Prokop, Ph.D.

Konzultant: Doc. Mgr. Jiří Damborský, Dr.

Tato práce byla upravena, aby neobsahovala citlivá data.

Tímto stvrzuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval sám s použitím citované literatury.

V Brně dne ……………..…………. ………………..

Tomáš Buryška

Poděkování

Rád bych poděkoval RNDr. Zbyňkovi Prokopovi, PhD. za spoustu cenných rad, trpělivost při opravování této práce a přátelskou spolupráci. Doc. Mgr. Jiřímu Damborskému, Dr. za umožnění práce v tak skvělé skupině jakou Loschmidtovy laboratoře jsou. Lukáši Danielovi, Bc. děkuji za velkou pomoc s virtuálním screeningem a zábavné chvilky při experimentálním měření. Děkuji celému kolektivu Loschmidtových laboratoří za příjemnou pracovní atmosféru a spolupráci. Také chci poděkovat rodině za podporu a pochopení časové náročnosti mého studia.

Obsah
1. Abstrakt 3

2. Abstract 3

3. Teoretická část 4

3.1 Úvod 4

3.2 Původ halogenalkandehalogenas 5

3.3 Mechanismus dehalogenačních reakcí 8

3.3.1 Reakční mechanismus halogenalkandehalogenas 10

3.3.1.1 Nukleofilní substituce 12

3.3.1.2 Nukleofilní adice 12

3.4 Substrátová specifita halogenalkandehalogenas 13

3.5 Hledání a design inhibitorů 17

3.5.1 Vysokoprůchodý screening 18

3.5.2 Virtuální screening 20

3.5.3 Racionální design 20

4. Cíle 25

5. Materiál a metody 26

5.1 Materiál 26

5.1.1 Chemikálie 26

5.1.2 Plyny 26

5.1.3 Enzymy 26

5.1.4 Seznam halogenovaných látek 26

5.1.5 Roztoky a pufry 27

5.1.6 Přístroje a laboratorní vybavení 27

5.1.7 Software 28

5.2 Metody 29

5.2.1 Měření specifické aktivity enzymu 29

5.2.2 Měření enzymové aktivity za pomocí GC-MS 29

5.2.3 Měření inhibice enzymové aktivity 30

5.2.4 Virtuální screening 30

5.2.5 Analýza vazby ligandu pomocí metody zastaveného toku 31

6. Výsledky 33

6.1 Hodnocení inhibičního účinku první sady potenciálních inhibitorů 33

6.2 Experimentální stanovení specifických aktivit nových substrátů 36

6.3 Hodnocení inhibičního účinku druhé sady potenciálních inhibitorů 38

6.4 Hodnocení vazby cyklopropyl bromidu pomocí metody zastaveného toku 39

7. Diskuze 41

8. Shrnutí 43

9. Reference 44

1. Abstrakt

Tato bakalářská práce se věnuje hledání inhibitorů halogenalkandehalogenas. Haloalkandehalogenasy jsou známé z aplikací degradace toxických látek. Dosavadní studie halogenalkandehalogenas se proto zabývají převážně zvyšováním jejich aktivity. Tato práce je vůbec první, která se zabývá vývojem inhibitorů těchto enzymů.

2. Abstract

This Thesis is focused on searching for inhibitors of the haloalkane dehalogenases. The haloalkane dehalogenase are well known for their application in the decomposition of toxic compounds. Studies on haloalkane dehalogenases are mainly devoted to the improvement of their catalysic activity. This Thesis is the very first study aimed at development inhibitors of these enzymes.

3. Teoretická část

3.1 Úvod
Lidé se stále častěji zajímají o současný stav životního prostředí. Chtějí se aktivně podílet na likvidaci antropogenních látek, které způsobují v životním prostředí vážné problémy. Antropogenní látky uvolněné do prostředí jsou špatně biologicky odbouratelné a jejich přirozený rozklad může trvat desítky, stovky někdy i tisíce let. Mezi četné a nebezpečné antropogenní látky patří také některé halogenované látky. Skupiny enzymů, které jsou schopné tento typ látek odbourávat, se nazývají dehalogenasy a jsou v posledních 30 letech intenzivně zkoumány (Janssen 2007). Ve své práci se budu detailně zabývat vybranou skupinou dehalogenačních enzymů, halogenalkandehalogenasami, které mají vysoký vědecký i aplikační potenciál.

Halogenalkandehalogenasy pochází zejména z bakterií schopných utilizovat halogenované uhlovodíky a aktivně se podílejí na jejich biodegradaci (Janssen, Gerritse et al. 1988, Keuning, Janssen et al. 1985, Nagata, Miyauchi et al. 1997). Dehalogenační enzymy se podle Enzymové Komise dělí do jedenácti základních skupin: alkylhalidasy (Heppel, Highman et al. 1948; Heppel and Porterfield 1948; Heppel and Porterfield 1948), (S)-2-haloaciddehalogenasy (Goldman, Milne et al. 1968; Motosugi, Esaki et al. 1982), haloaciddehalogenasy (Goldman 1965; Goldman, Milne et al. 1968), thyroxin-5'-dejodinasy (Chopra and Chua Teco 1982), halogenalkandehalogenasy (Keuning, Janssen et al. 1985; Scholtz, Leisinger et al. 1987; Yokota, Omori et al. 1987), 4-chlorobenzoátdehalogenasy (Muller, Oltmanns et al. 1988), 4-chlorobenzoyl-CoA-dehalogenasy (Crooks, Xu et al. 1995), atrazinchlorohydrolasy (deSouza, Seffernick et al. 1998), (R)-2-haloaciddehalogenasy (Smith, Harrison et al. 1990), 2-haloaciddehalogenasy (konfiguraci převracející) (Motosugi, Esaki et al. 1982; Motosugi, Esaki et al. 1982) a 2-haloaciddehalogenasy (zachovávající konfiguraci) (Weightman, Weightman et al. 1982).

3.2 Původ halogenalkandehalogenas
Data nejsou veřejně přístupná.

3.3 Mechanismus dehalogenačních reakcí
Odbourání halogenovaných sloučenin může probíhat samovolnou hydrolýzou nebo enzymaticky. Enzymatická dehalogenace probíhá několika možnými mechanismy, jako jsou oxidace, redukce, substituce, dehydrodehalogenace, hydratace nebo přenos metylové skupiny. Oxidační dehalogenace slouží zejména pro odbourávání halogenovaných aromátů a alifatických řetězců. Oxidací, která je prováděna enzymy nespecificky, se produkují nestabilní intermediáty, které posléze samovolně uvolní halogenový atom. Mezi enzymy schopné provádět tyto reakce patří monooxygenasy a dioxygenasy (Obrázek 2), které vyžadují kofaktor (NADH).



Obrázek 2: Oxidační dehalogenace. Probíhá za přítomnosti kofaktoru NADH.
Redukce probíhá za anaerobních podmínek, kdy dochází buď k nahrazení halogenu vodíkem (hydrogenolýza) nebo eliminaci dvou atomů halogenu za současného vzniku dvojné vazby (dihalogeneliminace). Těmito způsoby jsou odbourávány například polychlorované bifenyly, tetrachlorethen nebo pentachlorfenol (Damborsky, Rorije et al. 2001; Bohac, Nagata et al. 2002).


Obrázek 3: Redukční dehalogenace. U monohalogenovaného alkenu slouží k přenosu elektronů kofaktor NADH.
Dehydrodehalogenace vede eliminací HCl přímo ke vzniku dvojné vazby na substrátu (Fetzner 1998). Tato reakce je například prvním krokem v degradaci Lindanu - γ-hexachlorocyklohexanu (HCH) (Imai, Nagata et al. 1991).


Obrázek 4: Dehydrodehalogenace. Reakce probíhá bez přenosu elektronů.
Hydratace je mechanismus probíhající na nenasycených uhlíkových atomech. Haloacid-dehalogenasy s aromatickými halokyselinami produkují hydroxyaromatické kyseliny (Muller, Oltmanns et al. 1988).



Obrázek 5: Hydratace. Hydroxylový kyslík je během dehydrogenační reakce generován z vody.



Obrázek 6: Hydrolytická dehalogenace. Reakci probíhá mechanismem nukleofilní substituce.
Posledním známým mechanismem je přenos metylové skupiny, který probíhá u striktně anaerobních bakterií rodu Acetobacterium (Meßmer, Wohlfarth et al. 1993; Meßmer, Reinhardt et al. 1996; Vannelli, Studer et al. 1998).



Obrázek 7: Přenos metylové skupiny. Tetrahydrofolát FH4 se váže na chlormethan, vzniká methyltetrahydrofolát a uvolňuje se chloridový anion.
3.3.1 Reakční mechanismus halogenalkandehalogenas
Halogenalkandehalogenasy, kterými se ve své práci detailně zabývám, katalyzují dehalogenaci hydrolytickým mechanismem. Zásadní roli pro funkci halogenalkandehalogenas má pět aminokyselin aktivního místa (Janssen 2004). Tři z nich, tzv. katalytická triáda, zajišťují tvorbu a štěpení kovalentní vazby meziproduktu. Dále jsou v aktivním místě přítomny dvě halogenid-stabilizující rezidua, vytvářející vodíkové můstky, které slouží ke stabilizaci komplexu udržováním správné orientace a vzdálenosti atomů během transitního stavu. Celkem tři z pěti aminokyselin jsou konzervované – nukleofilní atak provádějící aspartát, katalytická báze histidin a halogenid-stabilizující tryptofan (Pavlova, Klvana et al. 2007; Damborsky and Koca 1999). Reakce halogenalkandehalogenas začíná vazbou substrátu a tvorbou Michaelisovského komplexu, po kterém následuje nukleofilní atak (1) karboxylátové skupiny aspartátu na halogenovaný uhlík v sp³ hybridizaci. Vznikající alkyl-enzymový meziprodukt (2) je poté hydrolyzován (3) vodou aktivovanou histidinem, který slouží jako obecná báze. Posledním krokem je uvolnění produktů (4), alkoholu a halogenidového aniontu (Obrázek 8). Pozitivní náboj imidazolového kruhu histidinu je během hydrolýzy stabilizován druhým kyselým reziduem, aspartátem (respektive glutamátem). Detailní kinetické studie ukázaly, že rychlost-limitující krok reakce se mezi jednotlivými halogenalkandehalogenasami liší (Prokop, Monincova et al. 2003). Studie transitních kinetik DhlA z rodu Xanthobacter autotrophicus GJ10 ukázaly, že nejpomalejším krokem je uvolnění halogenidového produktu (Schanstra and Janssen 1996; Schanstra, Kingma et al. 1996). U enzymu DhaA z Rhodococcus sp. Y2 je také nejpomalejším krokem uvolnění produktu, ale zde se jedná o uvolnění alkoholu (Bosma, Damborsky et al. 2002). Studie kinetického mechanismu LinB z Sphingomonas paucimobilis UT26 ukazuje, že nejpomalejším krokem je hydrolýza alkyl-enzymového meziproduktu (Prokop, Monincova et al. 2003). Naopak nedochází k žádné limitaci při uvolňování produktů, což by mohlo být vysvětleno relativně větším a dostupnějším aktivním centrem v porovnání s výše studovanými enzymy. Kinetické studie ukazují na různé mechanismy přirozené inhibice těchto dehalogena

ních enzymů (Schanstra 1996; Schanstra and Janssen 1996; Schanstra, Ridder et al. 1996; Prokop, Monincova et al. 2003). Vazby produktů v aktivním místě způsobují kompetitivní inhibici, inhibiční konstanty pro halogenidy se pohybují v řádech stovek mM, u alkoholů v jednotkách až desítkách mM. Znalosti o mechanismu a kinetice produktové inhibice by mohly být užitečné z hlediska designu nových účinných inhibitorů těchto enzymů. Jednou z možností by bylo zabránit disociaci produktu z komplexu a znemožnění regenerace proteinu. Další možností je akumulace již uvolněného produktu a prostorové bránění přístupu substrátu. Dalším možným přístupem je vytvoření koncového komplexu v některém z kroků než dojde k oddělení samotného produktu. Tento mechanismus byl poprvé ukázán u Klebsielly na ribitoldehydrogenase, vznikem neproduktivního komplexu enzym-koenzym-substrát (Fromm and Nelson 1962).

Obrázek 8: Reakční mechanismus halogenalkandehalogenas. V části A je kompletní reakční schéma. Část B znázorňuje nukleofilní atak na molekulu substrátu. Část C zobrazuje nukleofilní adici působením katalytické báze a uvolnění produktů z aktivního místa.
U halogenalkandehalogenas je častá také substrátová inhibice, což je vazba více molekul substrátu do většího aktivního místa halogenalkandehalogenas, které si pak vzájemně brání v rekci. Například pro 1,2-dibromethan je hodnota substrátové inhibice (K_si) v jednotkách mM (Prokop, Monincova et al. 2003).
3.3.1.1 Nukleofilní substituce

V procesech, kde je reakčním mechanismem S_N2 substituce, nukleofil napadá sp³ hybridizovaný uhlíkový atom. Kromě klasických nukleofilů jako je síra, kyslík nebo dusík existují i neobvyklejší jako kobalt v oxidačním stavu I. Obecně platí, že kyselé zbytky aminokyselin jsou orientovány tak, aby podpořily tvorbu nukleofilu a pomohly odstupující skupině k odstoupení. Ve většině případů probíhá napadení primárního uhlíku, výjimku tvoří 2-haloaciddehalogenasy, některé epoxidhydrolasy a invertující sulfatasy, které atakují sekundární uhlíky substrátů. Mezi enzymy, o kterých v současnosti víme, že jejich reakční mechanismus zahrnuje nukleofilní substituce, patří: SAM-dependentní methyltransferasy, SAM synthasy, fluorinasy a chlorinasy, S-adenosyl-L-methionin hydroxid adenosyltransferasy, haloaciddehalogenasy, haloalkoholdehalogenasy, epoxidhydrolasy, invertující sulfatasy, corrinoidní adenosyltransferasy a halogenalkandehalogenasy (O'Hagan and Schmidberger 2010).

3.3.1.2 Nukleofilní adice

Nukleofilní adice (Ad_N) je u enzymů běžná reakce. U enzymů s hydrolázovým foldem je typická katalytická triáda. Ta se skládá z nukleofilu (aspartát, serin nebo cystein), báze (histidin) a katalytické kyseliny (aspartát nebo glutamát). Nejznámější skupinou, kde se katalytická triáda vyskytuje, jsou serinové proteasy. Hydroxylová skupina serinu je zodpovědná za štěpení peptidických vazeb. Dalším reziduem katalytické triády je histidin, který akceptuje hydroxylový vodík a stabilizuje atak na peptidickou vazbu (Hedstrom 2002). Podobně probíhá stabilizace u halogenalkandehalogenas. Mechanismus adice je způsoben bazickou povahou imidazolového kruhu u histidinu. Histidin deprotonuje katalytickou vodu a vzniklý hydroxylový nukleofil okamžitě napadá aspartát, vedoucí ke vzniku a následnému rozpadu tetraedrického intermediátu (Otyepka, Banas et al. 2008).

3.4 Substrátová specifita halogenalkandehalogenas
Data nejsou veřejně přístupná.
3.5 Hledání a design inhibitorů
Halogenalkandehalogenasy jsou známé především díky své schopnosti odbourávat toxické polutanty. Dosavadní studie se zaměřují především na zvyšování aktivity halogenalkandehalogenas a tím i navýšení jejich potenciálu pro využití v biodegradačních technologiích. V současné době nejsou známy žádné inhibitory halogenalkandehalogenas a tato práce je podle mých znalostí první, která se tématem hledáním inhibitorů halogenalkandehalogenas zabývá.

Metody hledání vhodného inhibitoru lze rozdělit na teoretické a experimentální. Teoretické přístupy používají výpočetní techniku a experimentální jsou založeny na laboratorních měřeních. V současné době se oba přístupy kombinují a vhodně doplňují zejména u racionálního designu léčiv (Mandal, Moudgil et al. 2009).

3.5.1 Vysokovýkonný screening

Screening je tradiční přístup, který se používá k hledání nových inhibitorů metodou pokusu a omylu déle než 50 let (Craig and Ebert 1969; Cramer, Redl et al. 1974; Gund, Andose et al. 1980; Coyne, Scott et al. 2010). Základní princip, spočívající v otestování velkého počtu látek, se během let příliš nezměnil, zahrnuje hledání ligandu, který je rozpoznán biomolekulou. Tento takzvaný farmakofor zahrnuje soubor elektrických a stérických interakcí, které jsou nezbytné k vytvoření ideálních supramolekulárních interakcí a zajištění patřičné biologické odpovědi (Kier 1967; Michne 1996). K již dříve používaným metodám jako nukleární magnetická rezonance (Shuker, Hajduk et al. 1996), rentegenovou krystalografie (Miranker and Karplus 1991; Mattos and Ringe 1996; Nienaber, Richardson et al. 2000) nebo povrchová plasmová rezonance přibyly hlavně nové metody, které výše uvedené přístupy kombinují (Sweedler 2002; Albert, Krucker et al. 2002). Stručný přehled těchto technik, které využívají nových trendů v hmotnostní spektrometrii a kapalinové chromatografii, shrnuje Tabulka 2.

Tabulka 2: Kombinované techniky používané ve vysokovýkonných analýzách. Použité zkratky: GC – plynová chromatografie, LC – kapalinová chromatografie, HPLC – vysokovýkonná kapalinová chromatografie, MS – hmotnostní spektrometrie, CE – kapilární elektroforéza, NMR – nukleární magnetická rezonance, ICP – indukčně vázaná plazma, ESI – ionizace elektrosprejem, FT – Fourierova transformace, SFC – chromatografie v nadkritické kapalině (Hughes and Hunter 2001; Kyranos, Cai et al. 2001; Kyranos, Cai et al. 2001).

Zkratka techniky	Název
CE-ICP-MS	CE s ICP pro MS detekci
CE-NMR	CE pro NMR
ESI-FT-ICR-MS	ESI FT iontová cyklotronová rezonance s MS detekcí
GC-ECD/ICP-MS	GC s párovým detektorem ECD a ICP pro MS
HPLC-CLND	HPLC s chemiluminiscencí dusíku
HPLC-ELSD	HPLC s měřením rozptylu světla při vypařování vzorku
HPLC-NMR	HPLC pro NMR
HPLC-UV/MS	HPLC s detekcí v UV oblasti a MS
LC/LC-TSP/MS/MS	2D LC s nástřikem termosprejem a 2D MS
LC-NMR-MS	LC s kombinací NMR a MS
MALDI-FT-MS	Laserová desorpce/ionizace na matrici s FT pro MS detekci
SFC-MS	SFC s detekcí MS
SFC-UV	SFC s detekcí v UV oblasti

K otestování většího množství látek a zvýšení reprodukovatelnosti prováděných experimentů se v poslední době často zavádí robotická automatizace. Důležitým zlepšením je miniaturizace ať už se jedná o mikrofluidní techniky (Kricka 1998; Kricka 2001; de Mello 2002; Knight 2002), tzv. laboratoře na čipu, nebo ještě menší nanotechnologické zařízení (Laval, Mazeran et al. 1999; Guetens, Van Cauwenberghe et al. 2000; Curtis and Wilkinson 2001; Bogunia-Kubik and Sugisaka 2002). Screeningy obecně, zahrnují ohromná množství látek, řádově miliony (Obrázek 12), které se za rok otestují, což je spojeno s velkou finanční náročností při takovémto způsobu hledání léčiv (Oprea 2002).

Obrázek 12: Proces selekce u vysokoprůchodého screeningu. Počty molekul jsou orientační (Oprea 2002).
Hlavní nevýhodou klasického přístupu je, že neposkytuje informace o tom, proč je daná látka aktivní či neaktivní, či jak by měla být dále upravena. Dalším faktem, který nelze zjistit je, zda daná látka nemá nežádoucí účinky na jiné enzymy, protože ty při experimentálním testování nejsou přítomny. Obecně bývá nutné testovat alespoň 20 000 látek na nalezení jednoho vhodného kandidáta. V neposlední řadě je třeba zmínit značné finanční nároky na laboratorní techniku, ať už se jedná o krystalografii, hmotnostní spektrometrii, nukleární magnetickou rezonanci nebo vysokoúčinnou chromatografii. I přes tyto zjevné nevýhody se tento postup používá nadále a zahrnuje největší množství objevených léčiv. Hlavní výhoda tohoto přístupu spočívá v získání experimentálních dat pro každý testovaný ligand.
3.5.2 Virtuální screening

Trendy ve zvyšování výpočetního výkonu, snižování dopadu na životní prostředí a snaha otestovat co nejvíce látek vedly k zavedení metod virtuálního screeningu. Za pomoci počítačů a výpočtů na serverech probíhá prohledání databází možných ligandů. Čím přesnější metoda a algoritmus prohledávání, tím delší je výpočetní čas. Prohledáváním velkých knihoven, např. nejčastěji je používané databáze ZINC (Irwin and Shoichet 2005), lze získat mnoho potenciálních kandidátů. Kandidáti, látky s nejlepšími požadovanými parametry, se pak použijí pro experimentální testování. Výhodou tohoto přístupu je nastavení relativně malého množství parametrů a především takřka neomezené možnosti, co se prohledávaných knihoven týká. Nevýhodou je absence experimentálních dat. Přejde-li se k experimentálnímu testování, vybírají se pouze nejlepší kandidáti. Hodnoty z virtuálního screeningu jako například změny Gibbsovy energie, disociační konstanty nebo změny entropie se nemusí shodovat s experimentálně naměřenými daty. Virtuální screening umožňuje prohledávání ohromných knihoven v relativně krátkém čase, nicméně existuje reálná možnost, že bude opomenut kandidát s hledanými vlastnostmi (Stahl, Guba et al. 2006).

3.5.3 Racionální design

Racionální design se obecně dělí na dvě kategorie. První je vývoj nových malých molekul s požadovanými účinky na cílenou biomolekulu (receptor, nukleová kyselina, enzym), u které je známa její 3D struktura. Taková biomolekula se nazývá makromolekulární receptor. Tento přístup se často používá ve farmaceutických firmách (Obrázek 13 A).

Znalosti receptoru: genová ontologie, biologické procesy, molekulární funkce, buněčné kompartmenty, domény, metabolické cesty
3D struktura

Vysokovýkonný screening chemických knihoven

Virtuální screening

Prototyp léčiva

Hledání podobných struktur

Vylepšení ke zvýšení vazebné afinity

Vyhodnocení biologického vlivu

Biologický screening / Identifikace účinných molekul

Analýza globální exprese genu

- návrh databáze

- bioinformatika

- receptoru

- validace receptorů

Receptory objevené dokováním účinných léčiv do knihoven receptorů

A

B

Receptory s 3D strukturou

Receptory bez 3D struktury

Homologní model

Vyhodnocení vazebných afinit dokováním

Úprava požadovaných vlastností

Biologické vyhodnocení

C

C
C

Vyhodnocení

- QSAR

- působení

- vazebných skóre

- multilineární regresní analýza

Vyhodnocení reaktivity

- elektrofilní atak

- nukleofilní atak

- radikálový atak

Zlepšení bio-přístupnosti a parametrů léčiva

- in vitro experimenty

- profilace genové exprese

- toxicita

- rezistence proti léčivům

- metabolismus

- imunosuprese

A, B
Obrázek 13: Postup při racionálním designu. A Postup při návrhu léčiva, jestliže je znám makromolekulární receptor. B Postup, když makromolekulární receptor není znám. C Vyhodnocení vlastností za účelem zlepšení výsledného léčiva k preklinickým testům.
U makromolekulárních receptorů se známou 3D strukturou jsou používány databáze PDB (Berman, Westbrook et al. 2000) a NCI (Národní institut pro rakovinu, USA), dále DTP (Program vývoje léčiv), 3D MIND a ZINC pro 3D struktury molekul (Irwin and Shoichet 2005). Obsahují totiž experimentálně stanovené struktury nejen samotných proteinů, nukleových kyselin, ale také komplexů protein-léčivo, léčivo-nukleová kyselina a protein-nukleová kyselina (Mandal, Moudgil et al. 2009).

Druhou metodou je vývoj malých molekul s definovanými vlastnostmi pro makromolekulární receptory, jejichž strukturu a přesnou funkci neznáme (Obrázek 13 B). Informace o makromolekulárním receptoru lze získat analýzou obecných kandidátů pomocí pokročilých výpočetních nástrojů (Mandal, Moudgil et al. 2009). Jakmile se stanoví receptor pro léčivo, použije se jednoho ze zmíněných přístupů k vývoji malé molekuly, u které je třeba experimentálně stanovit různé parametry. Patří sem především: vyhodnocení vazebných skóre (afinity a specifity); poměr hydrofobnosti a hydrofilnosti; absorpce, distribuce, metabolismus a vylučování (anglická zkratka ADME); elektrofilní, nukleofilní a radikálový atak; toxicita včetně možných metabolitů a kvantitativní strukturně aktivitní vztahy (QSAR) (Patani and LaVoie 1996). V současné době je možné návrh molekuly a vyhodnocení některých parametrů provést výpočetními nástroji. Po identifikaci prvotního kandidáta na léčivo se zkoumá jeho vliv na genovou expresi. Ta může pomoci vylepšit (Obrázek 13 C) léčivo tak, aby se minimalizovaly nežádoucí účinky, toxicita, rychlejší vymizení choroby, rezistence k léčivům nebo zlepšení imunitní odpovědi. Zkoumání reaktivity umožňuje další modifikace omezující nežádoucí metabolické cesty léčiva. Důležitou roli hrají takzvané farmakokinetické parametry, jako logP, molekulární hmotnost nebo počet akceptorů a donorů vodíku. Předpovědi toxicity a metabolických drah mohou být také modelovány pomocí počítačů (Lipinski, Lombardo et al. 1997; Willett 2000; Boyd Donald 1999; DeWitte Robert and Shakhnovich Eugene 1999; Ghose Arup, Viswanadhan Veharkad et al. 1999; Jones, Willett et al. 1999; Reddy and Parrill Abby 1999). Dalším možným přístupem ke hledání vhodného léčiva je možnost využít experimentální znalosti enzymové substrátové specifity. U enzymů, které mají více vazebných míst, je možné navrhnout inhibitor na obě vazebná místa najednou, čímž se docílí významnější vazebné afinity (≥2 kcal mol^-1). Tyto takzvané multisubstrátové inhibitory se již používají například k inhibici HIV proteas nebo serinových a cysteinových proteas (Krantz 1992). Mnoho silných inhibitorů proteas také tvoří kovalentní vazbu s nukleofilním atomem proteinu, čímž se snaží napodobit vazbu s peptidem v tranzitním stavu (Babine and Bender 1997). Halogenalkandehalogenasy mají sice jen jedno aktivní místo, ale také tvoří kovalentní meziprodukt vazbou substrátu na nukleofil. Dá se tedy předpokládat, že by mohla existovat skupina inhibitorů, která by kopírovala specifitní a strukturní vlastnosti nejlepších substrátů. Jednou z možností by mohly být fluorované látky, u kterých zatím nebylo prokázáno, že by halogenalkandehalogenasy byly schopny rozštěpit vazbu.