Yazar : SÜmer aras
Yüklə 129,05 Kb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- ABSTRACT
- II. Amaç ve Kapsam
- III. MATERYAL VE YÖNTEM
- ITS BÖLGESİ ANALİZLERİ
- IV. Analiz ve Bulgular
TÜRKİYE’DE yayılış gÖsteren BAZI ASPICILIA (Massal.) LİKEN TÜRLERİNİN MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLERLE TANIMLANMASI IDENTIFICATION OF SOME ASPICILIA (MASSAL.) SPECIES GROWING IN TURKEY BY MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS ÖZETBu proje kapsamında beşi manna grubuna ait olan yedi farklı Aspicilia türü RAPD analizi ile, 16 Aspicilia cinsine ait örnek de rDNA ITS (internal trancribed spacer) bölgesi dizi analizi ile incelenmiştir. Likenlerden mantar izolasyonu ile DNA izole edilmiştir. Moleküler belirteç (markır) çalışmaları için öncelikle geliştirilen mantar kültürü protokolü DNA izolasyonu için kullanılmıştır (Cordeiro ve ark., 2004; Yamamoto ve ark., 1985; Ahmadijan, 1974). RAPD analizlerinde kullanılan likenlerin manna grubu Aspicilia esculenta, A. aspera, A. fruticulosa, A. hispida, A. desertorum Anadolu’dan farklı yerlerden toplanmıştır. Benzer gruplar olarak değerlendirilen A. contorta subsp. hoffmanniana ve A. calcarea ise manna grubu ile filogenetik ilişkilerini incelemek için çalışmalarda kullanılmıştır. Çalışmalarımızın 2. bölümü daha kapsamlı ve detaylı veriler elde etmek için ITS bölgesi dizi analizi yönünde devam etmiştir. RAPD analizlerinde incelenmiş olan 7 türde dahil olmak üzere değişik lokalitelerden toplanmış 16 Aspicilia cinsine ait örnekde dizi analizi çalışmaları yapılmıştır. RAPD verilerinden elde edilen sonuçlar dizi analizi verilerini destekler nitelikde olup ITS bölgesi dizi analizi verilerine göre Anadolu’da bulunan Aspicilia sp.’nin bu ekolojiye ait karakteristikleri ile kendi başına bir grup oluşturduğu söylenebilir. Aspicilia cinsinin moleküler belirteçler ve ITS dizi analizi incelenmesini içeren bu çalışma bilgilerimiz dahilinde bir ilkdir. Çalışmada kullanılan türlere ait örneklerde, genetik mesafelerin hesaplanması ve ayrıca genotiplerin belirlenmesi üzerinde yoğunlaşılmıştır. ITS dizi analizi ve RAPD belirteçleri ile elde edilen bilgiler Aspicilia cinsinin, özellikle manna grubu likenlerin, taksonomisine katkıda bulunmaktadır. ABSTRACTIn this project seven different species of Aspicilia which five of them regarded as manna lichens were studied with RAPD analysis and 16 specimens from Aspicilia genus were investigated by sequence analysis of rDNA ITS (internal transcribed spacer) region. DNA was isolated with mycobiont isolation. For DNA isolation from mycobiont cultures a previously improved protocol for molecular marker studies, was used (Cordeiro ve ark., 2004; Yamamoto ve ark., 1985; Ahmadijan, 1974). The manna group of lichens used in RAPD analysis ; Aspicilia esculenta, A. aspera, A. fruticulosa, A. hispida, A. desertorum collected from various parts of Anatolia were included into the study. Samples of A. contorta subsp. hoffmanniana and A. calcarea which were regarded as related groups to manna lichens, were also used in the examinations. In the second part of the studies in order to obtain more comprehensive and more detailed data ITS sequence analysis were conducted. Including 7 species used in RAPD analysis 16 Aspicilia specimens were included to sequence analysis studies. Results obtained from RAPD analysis supported the data from ITS region sequence analysis. According to ITS region sequence analysis data it could be interpreted that Aspicilia sp. found in Anatolia forms a group of its own with the characteristics unique to that ecology. This is the first study with molecular markers and ITS sequence analysis on Aspicilia genus to our knowledge and focused on revealing the genetic distances and also defining genotypes of the specimens of the species used in the study. The information obtained by ITS sequencing and RAPD analysis constitutes a contribution to the taxonomy of Aspicilia genus, especially within manna group of lichens. II. Amaç ve KapsamLikenlerde ki sistematik çalışmalar, bitki gruplarında olduğu gibi klasik olarak daha çok morfolojik karakterlere dayalı tanımlamaya dayanmaktadır. Morfolojik karakterlerin yanında, kemotaksonomik yöntemler de kullanılmaktadır. Bunlar arasında kortekse uygulanan bazı reaktiflerin renk reaksiyonları ya da ince tabaka kromatografisidir. Son yıllarda bu amaçla moleküler taksonomik yöntemler de kullanılmasına rağmen konusu likenler açısından ülkemiz için yeni bir çalışmadır. Aspicilia Manna grubu (besin değeri olan, insanlar ve hayvanlar tarafından yenilebilir özellikte olan) birbirine morfolojik olarak çok benzeyen türleri içermektedir. Bu nedenle bu proje ile morfolojik yöntemlerle bile çok zor ayrılan bu grubu moleküler biyolojik yöntemlerle sınıflandırılması amaçlanmıştır. Aspicilia liken cinslerinin manna grubu olarak adlandırılan Aspicilia hispida, Aspicilia desertorum, Aspicilia esculentum, Aspicilia fruticulosa türleri ile Aspicilia calcarea ve A. contorta subp. hoffmannii taksonlarına ait örnekler RAPD analizi ile incelenmiş ayrıca çalışmayı daha kapsamlı ve ileri boyutlara götüreceği düşünülerek manna grubu likenleri de içeren 16 Aspicilia cinsi örneklerinde rDNA ITS bölgesi dizi analizi çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalarla Aspicilia cinsine ait bir çok türün liken sistematiğindeki konumlarına bir başka boyut getirilmiştir. III. MATERYAL VE YÖNTEM:Liken Materyali (RAPD Analizi) Projenin konusunu oluşturan liken cinslerine ait türler daha önce araziden farklı lokalitelerden ve farklı substratlardan, liken toplama kurallarına uygun biçimde toplanmıştır ve laboratuvara getirilerek oda sıcaklığında kurutulmuştur. Mevcut bu örneklerden yeteri kadarı laboratuvar çalışmaları için alınarak ve birer dublet ANK Herbaryum ve Anadolu Üniversitesi herbaryumunda, herbaryum materyali haline getirilerek koruma altına alınmıştır. İstasyon bilgileri Tablo 1’de verilmiştir. Şekil 1-5’de liken örneklerine ait resimler gösterilmektedir. Tablo 1: RAPD analizi için Aspicilia liken örneklerinin toplandığı bölgeler.
 
Şekil 1. Aspicilia hispida Mereschk. Şekil 2. Aspicilia desertorum (Krempelh.) Mereschk.  
Şekil 3. Aspicilia esculenta (Pallas) Flagey Şekil 4. Aspicilia fruticulosa (Eversmann) Flagey 
Şekil 5. Aspicilia calcarea (L.) Mudd. Mantar İzolasyonu Materyalden DNA izolasyonuna geçmeden önce likeni oluşturan alg ve mantarı birbirinden ayırmak gereklidir. RAPD çalışmalarında primerler spesifik olmayıp tüm genomu çoğaltıldığı için likenlerden DNA izolayonu yapabilmek için once mantar kısmının izolasyonu için doku kültürü yapılmıştır. Bu işlem için Ahmadijan (1974) ve (Yamamoto ve ark., 1985)’nın kullandığı yöntem uygulanmıştır. Mantar kültürleri askosporlardan (Ahmadijan, 1974) ve tallus parçalarından (Yamamoto ve ark., 1985) sağlanmıştır (Aspicilia’nın 6 türünde A. esculenta, A. fruticulosa, A. calcarea, A. desertorum, A. contorta subsp. hoffmaniana’da askosporlardan, A. hispida’da da ise tallusun alg içermeyen kısmından mantar kültürü elde edilmiştir. DNA İzolasyonu ve RAPD Analizi İzole edilecek DNA mantar kültürlerinden eşit oranda (yaklaşık 5 mg) olacak şekilde alınmıştır. Bu işlem için GFX PCR ve Promega Jel bant purifikasyon kiti kullanılmıştır. Öncelikle örnekler önceden soğutulmuş içinde sıvı nitrojen olan 1.5 ml PCR tüpü içerisine konulmuştur. Bunun üzerine 100 µl tampon solusyonu eklenmiştir ve örnekler 60 °C’de 10 dakika inkübe edilmiştir. Diğer tüm devam eden aşamalar üretici firmanın yönlendirdiği şekilde izlenmiştir. Sonuçta DNA örnekleri üzerine 50 µl; pH’ı 8 olan 10mM’lık Tris tamponu eklenerek sulandırılmıştır. Bu aşamadan sonar DNA örnekleri NanoDrop-1000 ile miktarı ölçülmüştür. 100 bp DNA ladder (Promega) kullanılarak ethidyum bromürlü agaroz jelde koşturulmuştur (Şekil 6). 1 2 3 4 5 6 7 
Şekil 6. Aspicilia genusuna ait örneklere ait DNA bantlarının agaroz jelde gösterimi 1- Aspicilia contorta subsp. hoffmanniana, 2- A. calcarea, 3-Aspicilia esculenta, 4- A. desertorum, 5- A. aspera, 6- A. fruticulosa, 7- A. hispida
200 ng DNA 2.5 µl 10x reaksiyon tamponu 3.5 µl 2.5 mM MgCl2 2 µl 2.5 mM dNTPs 200 ng primer 0.5 unite Taq Polimeraz (Promega)
94 oC 3 dk 94 oC 30 sn-36 oC 1 dk-72 oC 1dk.45 sn 35 döngü Uzama evresi de 72 oC’de 8 dk yapılmıştır. Çoğaltılmış örnekler % 1.2’lik agoroz jele (%50 agoroz %50 Nusive GTC agaroz ) yüklenmiş ve 4 saat 100 V’da yürütülmüştür. Herhangi bir kontaminasyon olup olmadığını belirlemek için kalıp DNA olmaksızın PCR karışımı negatif kontrol olarak konulmuştur. Kullanılan 16 primerin dizileri Tablo 2’de verilmiştir ve PCR sonuçları Şekil 7’de verilmiştir. Tablo 2. Çalışmada kullanılan primerlerin dizisi.
1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 
Şekil 7. Çalışmada kullanılan Aspicilia türlerinin PCR ürünlerinin agaroz jelde görünümü. 1- A. fruticulosa, 2- A. hispida 3- Aspicilia esculenta, 4- A. desertorum, 5- A. aspera, 6- Aspicilia contorta subsp. hoffmanniana, 7- A. calcarea.
rDNA ITS bölgesini ve ayrıca 5.8 S rDNA bölgesini içine alacak şekilde oluşturulmuş primerlerden mantara özgü ITS-1F ve evrensel ITS-4 primerleri kullanılarak bu bölgenin amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen PCR ürünleri MspI, Hinf I, Pvu II, Alu I, Eco RI BamHI,, ScaI, PdmI, XceI enzimleri (Fermentas) ile üretici firmanın yönlendirmeleri doğrultusunda kesilmiştir. Yaklaşık 680 kb’lık bantların elde edilmesine karşın kullanılan restriksiyon enzimlerinin bazılarının sadece birkaç örnekte kesim bölgesi yakalayabildiği gözlenmiştir. Restriksiyon enzim kesimlemeleri sonucunda polimorfik bir patternin ortaya çıkmaması nedeniyle bu örnekler resimlendirilmemiş ve değerlendirilmeye alınmamıştır. Ancak 680 bç lik bir bölge de enzimlerin bir kısmının farklı kesim noktaları bulabilmesi, bu bölgenin dizi analizi yapıldığında farlılıkların ortaya çıkabileceğini işaret ediyor olması ve dünya literatüründe çalışmaların yoğunlukla bu yönde yapıldığı göz önünde bulundurularak bu bölgeler proje kapsamında olmamasına karşın diğer bir projeden (Biyoteknoloji Enstitüsi Proje No:171) sağlanan destek ile de dizi analizine tabii tutulmuştur. Dizi Analizi Liken materyali RAPD analizlerinde incelenmiş olan 7 türde dahil olmak üzere değişik lokalitelerden toplanmış 16 Aspicilia türünde (tablo 3) dizi analizi çalışmaları yapılmıştır. Bazı liken örnekleri Anadolu Üniversitesi Herbaryumunda bulunan daha önceden toplanmış materyalden temin edilmiştir. DNA ekstraksiyonu ve PCR amplifikasyonu DNA ekstraksiyonu daha önce laboratuvarımızda belirlenen yöntemlere göre gerçekleştirilmiştir (Aras ve Cansaran, 2007). rDNA genine ait ITS bölgesi mantara özgü ITS1F (Gardes and Bruns, 1993) ve evrensel ITS4 (White et al., 1990) primerleri kullanılmıştır. PCR amplifikasyonları daha önce belirlenmiş metotlara göre yapılmıştır. DNA Dizi Analizi PCR ürünleri dye terminator cycle sequencing kit ve OpenGeneÒ automated DNA sequencing system (Visible Genetics, Canada) (Amersham Pharmacia, USA) ile üretici tarafından belirlenmiş protocol doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. ITSF1 and ITS4 primerleri ile çoğaltılmış ve küçük alt ünitenin 3’ son bölgesi, ITS 1, ITS 2 ve büyük alt ünitenin 5’ terminal bölgesini içeren fragmanlar dizi analizine tabii tutulmuştur. Okuma hatalarından kaynaklanan kararsızlıklar Clustal W 1.83 programı ile komplementer dizilerle kıyaslamak suretiyle çözülmüştür. Diziler ayrıca aynı program kullanılarak sıralanmış (alignment) ve görsel ayarlama yapılmıştır. Kararsızlık yaratan sıralanmış bölgeler çıkartılmış ve kayıp veri olarak değerlendirilmiştir. Aspicilia cinsine ait 16 örnek, Gen Bankasından çıkartılmış olan Leconora cinsine ait 11 örnek, 1 Pertusaria türü,1 Megaspora türü, 1 Lecidea and 2 Aspicilia (Tablo 4) çoklu sıralamalara dahil edilmiştir (Fig 1). 684 nukleotid posizyonunda olan dizi matriksi incelenmiş (korunmuş, 38; değişken, 627) ve 528 parsimoni bilgilendirici bölge tayin edilmiştir. Tüm veriler MEGA 3 (Kumar et al., 2004) istatistik analiz programı ile incelenmiş ve bootstrap’li (saç topla testi) dendogram elde edilmiştir. Tablo 3 ITS bölgesi dizi analizi çalışmalarında kullanılan liken örneklerinin toplanma bölgeleri
Tablo 4. DNA dizi analizi sonucu sıralanan türler, lokaliteleri, GenBank ulaşım numaraları
IV. Analiz ve BulgularRAPD Analizi Aspicilia genusuna ait olan iki tür ve manna grubuna ait olan beş türün tümü analiz edilmiştir. Test edilen 32 primerden temiz ve çoğalabilen bant ürünü veren 16’sı reaksiyonlar için seçilmiştir. RAPD analizinden toplam 181 bant elde edilmiştir ve bu bantlardan 32’si polimorfik olarak belirlenmiştir. Çoğaltılmış parçalar 150 bp ile 1000 bp arasındadır ve her bir primer için bantların sayısı 10 ila 20 arasındadır. Var (1) yok (0) skorlaması ile elde edilen veri matriksi SAHN (Rohlf, 2000) yöntemi ile UPGMA dendogramı kullanılarak elde edilmiştir (Şekil 8). 
Şekil 8. RAPD analizlerine göre çalışılan türlere ait dendogram Principle Component Analiz (PCA) ile incelenen verilerde RAPD çalışmalarından elde edilen bantlara gore üç ayrı grup oluşmuştur (Şekil 8).
Çalışmanın dizi analizi bölümünde Manna grubuna ait toplam sekiz tür ve Aspicilia cinsinden benzer türler kullanılmıştır. Aspicilia örneklerinde elde edilen dizi bilgileri Gen Bankası’na verilmiştir. (Tablo 4). ITS bölgeleri için elde edilen veriler GenBank’dan alınan örneklerdeki verilerle sıralanmıştır. PCR amplifikasyonu ile elde edilen hedef diziler iki yönlü dizi analizine tabii tutulmuştur. Aspicilia türlerinde dizi analizi reaksiyonları sonucunda sıralanabilir 684 nükleotid uzunluğunda diziler elde edilmiştir. Bu diziler içerisinde 38 korunmuş and 627 değişken bölge olduğu ve 528 bölgenin parsimoni bilgilendirici olduğu gözlenmiştir. En fazla dokuz parsimonous ağaç elde edilmiş ve bunlar benzer gruplarla, özellikle Leconora ile sıralandırılmıştır. Bu ağaçlardan bir tanesi olan minimum evolusyon ile edilen ağaç şekil 9 da gösterilmektedir. Elde edilen değişik ağaçlar sadece gruplar içerisinde küçük rearajmanlar gösterip, genelde benzer topolojiler sergilemişlerdir. Maximum parsimony ve Neighbor joining analizleri ile elde edilen ağaçlar grup içi ve gruplar arası küçük değişiklikler ile çok yakın topolojiler göstermişlerdir.
ITS dizi analizi verileri daha kapsamlı ve detaylı bir çalışma olduğu için araştırmalarımız bu yönde devam etmiştir. RAPD verileri dizi analizi verilerini destekler nitelilkde olup ITS bölgesi dizi analizi verilerine göre Anadolu’da bulunan Aspicilia sp.’nin bu ekolojiye ait karakteristikleri ile kendi başına bir grup oluşturduğu söylenebilir (Şekil 9). Sadece Anadolu’dan toplanmış Aspicilia türleri incelendiği zaman Manna grubuna ait örneklerin ağaç içerisinde bir grup oluşturduğu gözlenmektedir (Şekil 10). Anadolu’da bulunan Aspicilia türleri daha uzun dal uzunlukları ile genetik çeşitliliğin fazla olduğunu ifade etmişlerdir (Şekil 9). Yani, benzer cinslerde gözlenen monofiletik yapı ve düşük genetik çeşitliliğin tersine Aspicilia polifiletik bir yapı göstermiştir. VI. Kaynaklar ARAS S, CANSARAN D. 2006. Isolation of DNA for sequence analysis from Herbarium material of some lichen specimens. Turkish Journal of Botany,; 30:449-453. AHMADIJAN V. 1974. The Lichens. In: Methods of isolating and culturing lichen symbionts and thalli. (Eds. Ahmadjian V. and Hale M.E.). pp. 653-659. Academic Pres, New York. CANSARAN D, ARAS S, KANDEMIR İ, HALICI MG, 2006. Phylogenetic Relations of Rhizoplaca Zopf. From Anatolia Inferred from ITS Sequence Data. Zeitschrift für Naturforschung, 61c, 405-412. CORDEIRO LMC, IACOMINI M and WORGOTTER SE. 2004. Culture studies and secondary compounds of six Ramalina species. Mycol. Res. 108 (5): 489-497. GARDES M, BRUNS TD. 1993. ITS primers with enhanced specifity for basidiomycetes-application to the identification of mycorrhizae and rusts. Mol. Ecol. 2, 113-118. KUMAR S, TAMURA K, NEI, M, 2004. MEGA 3. Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics 5, 150-163. ROHLF JF. 2000 NTSYSpc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) Version 2.1 Copyright 2000 by Applied Biostatistics Inc. 10 Inwood Road, Port Jefferson, New York 11777. WHITE TJ, BRUNS, T.D., LEE, S., TAYLOR J., 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., White, T.J. (Eds.), PCR Protocols. Academic Press, San Diego, pp. 315-322. YAMAMOTO Y, MIZUGUCHI R and YAMADA Y. 1985. Tissue cultures of Usnea rubescens and Ramalina yasudae and production of usnic acid in their cultures. Plant Cell Physiology 28: 1421-1426. VII. Ekler
Proje Bütçesi: 20.000.000 TL (2.8.2004) 19.4.2005 Saat 16:30 da yapılmış olan ihale sonucunda proje kapsamında istenmiş olan sarf malzemesinin tamamı temin edilmiştir. Proje kapsamında herhangi bir cihaz (demirbaş) talep edilmemiş ve alınmamıştır.
Proje kapsamında herhangi bir makina ve teçhizat (demirbaş) talep edilmemiş ve alınmamıştır.
Tüm analizler ve ayrıntılar rapor içerisinde sunulmuştur.
Aras, S., Cansaran D. Resolving Genetic Relationships in Manna Group of Lichen from Genus Aspicillia Massal. and Related Allies (Leconoraceae and Hymenyleceae). XV FESBP
16 adet Aspicilia türüne ait dizi verileri GenBank (www.ncbi.nilm.nih.gov) veri bankasına verilmiştir.
1. Demet Cansaran Duman, Sümer Aras, İrfan Kandemir and Mehmet Candan. ‘Genetic Variation of Manna group of Aspicilia A. Massal Species in Anatolia Investigated by RAPDs' by. Acta Biologica Cracoviensia (SCI) dergisine değerlendirilmesi için sunulmuştur (2007).
Resolving genetic relationships in manna group of lichens from genus Aspicilia. African Journal of Biotechnology (SCI), 6 (9); 1154-1160. 3. Aras, S., Cansaran, D. 2006. Isolation of DNA for sequence analysis from herbarium material of some lichen specimens. Turkish Journal of Botany (Uluslararası hakemli dergi), 30: 449-453. 4. Cansaran, D. Aras, S., Kandemir, İ., Halıcı, M.G. 2006. Phylogenetic Relations of Rhizoplaca Zopf. From Anatolia Inferred from ITS Sequence Data. Zeitschrift für Naturforschung (SCI) 61c: 405-412. Yüklə 129,05 Kb. Dostları ilə paylaş:
|
