15 Familia Orthomyxoviridae

15 Familia Orthomyxoviridae

Virusurile acestei familii sunt unice prin capacitatea lor de a determina epidemii recurente şi reale pandemii, în timpul cărora determină boli respiratorii acute, febrile, care afectează orice grupă de vârstă, iar mortalitatea cea mai mare se înregistrează la vârstele extreme.

Istoric: gripa evoluează, probabil, din antichitate; nu există însă, ca în variolă sau holeră, dovezi incontestabile. “Catarul febril”, în Marea Britanie, ar fi evoluat încă de la începutul secolului al XVI-lea. Evoluţia pandemică a gripei s-a semnalat mai târziu; creşterea populaţiei globului şi mijloacele moderne de transport ar putea fi explicaţiile apariţiei lor. Animalele par a juca un rol important în epidemiile de gripă; în secolele al XVIII-lea şi al XIX-lea, izbucnirile epidemice în rândul cailor erau repede urmate de epidemii în colectivităţi umane. Nu există dovezi directe privind transmiterea cal-om; hergheliile numeroase din jurul colectivităţilor umane au făcut din cai, candidaţi “atractivi” ca intermediari ai transmiterii. Recent, porcii au devenit “favoriţii” teoriei în ceea ce priveşte posibilul lor rol de “recipient” care permite recombinări genetice între diferite tulpini de virus gripal, animale şi umane.

Seroarheologia: ramură nouă a medicinii, ce urmăreşte, pe baza “amprentei imunologice” a populaţiei în vârstă, circulaţia virusurilor gripale; Ac inhibitori ai hemaglutinării persistă la niveluri decelabile zeci de ani; prin investigaţii serologice faţă de tulpini de colecţie ale persoanelor foarte în vârstă, se pot pune în evidenţă Ac faţă de virusurile gripale cu care aceste persoane au venit în contact de-a lungul timpului.

Astfel:

1. 
   în perioada 1889- 1898, a circulat virusul gripal A/H2N2;
   
2. 
   în perioada 1899 – 1917: A/ H3N8;
   
3. 
   în perioadă 1918 - 1957: A/ H1N1.
   

In ultimii ani, au circulat mai ales virusurile gripale A/H3N2 şi A/H1N1, în paralel cu virusul gripal B. Importanţa practică deosebită: formula vaccinului gripal va conţine, până la reapariţia unui virus vechi sau la apariţia unui nou virus, subtipurile predominant circulante.

Izolarea virusului gripal

In 1901, un “agent filtrabil”, aşa cum erau iniţial cunoscute virusurile, a fost izolat de la păsări (tipul A/H7N7) ce sufereau de aşa-numita „ciumă a păsărilor”; acest virus a fost descris ulterior de Schäfer (1955) ca fiind virusul gripal. In 1933, Smith şi colaboratorii au inoculat animale de laborator, intranasal, cu lichid de spălătură recoltat de la om; acest lichid inoculat inducea o formă de gripă care se transmitea între animale. Virusul uman gripal A (VGA) a fost transmis de la animal la om: unul dintre tinerii cercetători voluntari, a fost, cel ce avea să devină mai târziu Sir Charles Stuart-Harris de la care, ulterior, s-a reizolat virusul gripal uman (Francis, 1934).

Un virus distinct antigenic a fost denumit virusul gripal B (tulpina B/Lee/40) iar cel de-al treilea tip major, respectiv tipul C, a fost izolat în 1947 de către Taylor.

Alte tulpini izolate recent au fost: A/H5N1, în 1997 şi A/H9N2, o tulpină aviară, în martie 1999. A/H5N2 circulă în prezent în Asia SE şi este cauza unor îmbolnăviri cu deces.

Taxonomie - familia Orthomixovirus cu 2 genuri:

4. 
   Influenzavirus cu 2 specii: virusurile gripale A şi B;
   
5. 
   Mesainfluenzavirus cu virusul gripal C
   

Separarea celor 2 genuri s-a bazat pe diferenţele antigenice privind structura nucleocapsidei (NP) şi a proteinei matricei (M). Denumirea familiei: din grecescul ortho = drept, corect şi mucus.

Denumirea de mesa sau meso (gr. mesos = mijloc) ar putea, în mod greşit, sugera că acest grup este unul intermediar între ortho- şi paramyxovirusuri. In ultimele tratate nici nu mai este menţionat, pentru a evita această confuzie.

Practic, în prezent, sunt recunoscute genurile A, B şi C, fiecare cu tipurile corespunzătoare, respectiv, A (VGA) , B (VGB) şi C (VGC). In cadrul tipurilor, delimitarea subtipurilor s-a realizat pe baza caracterelor glicoproteinelor de membrană, hemaglutinina (HA) şi neuraminidaza (NA).

Nomenclatură: există o convenţie internaţională (OMS, 1980) care impune să se noteze:

• 
  tipul virusului (A, B sau C);
  
• 
  gazda (alta decât omul);
  
• 
  locul izolării (oraş, regiune, etc.)
  
• 
  numărul tulpinii
  
• 
  anul izolării
  
• 
  descrierea antigenică a HA şi NA este indicată în paranteze.
  

Diferenţe majore între cele 3 virusuri:

6. 
   VGA, infectează în mod natural omul dar şi multe specii de animale: suine, păsări, cai; VGB pare să infecteze doar omul, iar tipul C infectează omul şi suinele (fapt demonstrat doar în China);
   
7. 
   proteinele de suprafaţă ale VGA au o mai mare variabilitate în ceea ce priveşte structura antigenică, comparativ cu tipul B. VGC are o singură glicoproteină multifuncţională;
   
8. 
   există diferenţe morfologice între cele trei tipuri (ex. virusurile gripale A şi B conţin câte 8 segmente de genom iar tipul C, doar 7);
   
9. 
   deşi strategia celor trei virusuri de a codifica sinteza proteinelor este similară, există diferenţe în ceea ce priveşte sinteza proteinelor specifice fiecărui tip.
   

Structura virusului gripal: virionul este pleomorf, de cele mai multe ori sferic-ovoidal cu diametrul de aproximativ 110 nm (limite 80-120); s-au descris şi forme filamentoase, de lungimi variabile. Pasaje succesive, duc la apariţia, mai ales, a formelor sferice (fig. 14).



Fig. 14: Reprezentarea schematică a virusului gripal

Virionul este învelit, genomul ARN, segmentat, cu sens negativ. Învelişul derivă din membrana celulei gazdă, în prealabil modificată prin inserţia de peplomere (HA şi NA).

Genomul, cu dimensiuni apropiate pentru cele trei virusuri (variind între 12900 nt pentru tipul C şi 14600 nt pentru tipul B) are asociată o transcriptază; intern faţă de membrana lipidică se află, cantitativ cel mai important, proteina matricei (M – matrix); ambele sunt străbătute de canale ce permit schimburi de ioni. Cele 8 segmente ale genomului sintetizează: proteinele PB2, PB1, PA (polimeraze asociate ribonucleoproteinei), HA, NA, M şi NS – proteină nestructurală; asociat miezului se află şi proteina NS2 – iniţial considerată ca nestructurală.

Ulterior s-a demonstrat că este o proteină structurală conectă cu proteina matricei.

Importanţa segmentării: VG este un virus supus variaţiei genetice prin reasortare; până la descoperirea HIV, era virusul cu cea mai mare variabilitate antigenică. Virusurile gripale A sunt subclasificate în subtipuri, funcţie de caracteristicile glicoproteinelor de suprafaţă: HA şi NA. OMS recunoaşte 16 subtipuri după HA şi 9 după NA. La om au fost descrise doar tipurile 1, 2 şi 3 de HA.



Fig.15: Replicarea virusului gripal
Replicarea: ataşarea şi adsorbţia presupun mai întâi intervenţia NA care scindează mucusul de la nivelul mucoasei “deschizând drum” HA să realizeze ataşarea la receptori specifici prezenţi la nivelul celulelor respiratorii (fig. 15). Ataşarea poate fi stopată prin intervenţia Ac-lor neutralizanţi (Ac anti-HA, de unde şi rolul antigenelor în vaccinare). Pentru infecţiozitatea VG este necesară scindarea HA în cele 2 părţi componente HA1 şi HA2 (care împreună formează HA). Fiind un virus învelit, ataşarea se face prin fuziunea cu membrana celulei gazdă şi este dependentă de pH. In final, este eliberată în citoplasmă doar NP asociată cu o ARN- polimerază. Transcrierea ARN viral duce la sinteza a 10 specii de ARNm care sunt procesate în nucleu, dar translaţia şi sinteza proteinelor are loc în citoplasmă. După sinteză, proteina M migrează la nivelul membranei celulare şi se îmbogăţeşte cu HA şi NA virală; ulterior, RNP şi polimerazele se aglomerează şi ele la nivelul matricei. Nucleocapsidele asamblate în nucleu migrează la nivelul membranei citoplasmatice, unde va avea loc înmugurirea cu intervenţia probabilă a neuraminidazei: NA îndepărtează acidul sialic de la nivelul suprafeţei celulei gazdă, favorizând eliberarea virionilor.

Structura antigenică

Antigene specifice de tip

Specificitatea NP şi a proteinei M dictează diferenţierea între tipurile de virus A, B şi C.

Antigenul NP corespunde nucleoproteinei virale şi este exprimat la suprafaţa celulei gazdă. Este un antigen stabil, specific pentru fiecare tip şi conţine 3 situs-uri antigenice; blocarea unui situs cu Ac monoclonali inhibă, in vitro, transcrierea ARN. Limfocitele T citotoxice recunosc, preferenţial, acest antigen. Identificarea Ag NP se face prin RFC. Sensibilitatea RFC pentru diagnosticul infecţiei acute este insuficientă şi, de aceea, identificarea NP se face mai frecvent prin ELISA sau prin teste de citotoxicitate in vitro.

Antigenul M corespunde proteinei matricei. Deşi este un antigen stabil, s-au descris totuşi variaţii antigenice pentru subcomponentele M1 şi M2 ale acesteia. Ag M1 are rol în inducerea activităţii citotoxice a limfocitelor T iar AgM2 induce răspunsul imun protector. Identificarea acestui Ag se face prin reacţii de imunoprecipitare în gel, sau, mai sensibil, prin ELISA.

Antigenul NS: reprezintă proteinele NS. Este un Ag cu specificitate de tip dar induce reacţii încrucişate faţă de Ag NS provenite de la tulpini diferite de VG, umane sau animale. Pentru diferenţiere sunt utili Ac monoclonali. Evidenţierea Ag NS este posibilă prin PCR; în plus, Ag1NS poate fi evidenţiat şi prin testul citotoxicităţii pentru limfocitele T.

Antigene specifice de subtip

Hemaglutinina (HA) este un antigen major de suprafaţă. Din cele 16 subtipuri (H1–H16) doar trei au fost descrise pentru tulpinile umane. Răspunsul imun protector indus de AgHA constă în apariţia de Ac şi în răspunsul citotoxic al limfocitelor T. Acest răspuns este diferenţiat faţă de componentele HA1 şi HA2 ale HA. Acest antigen poate fi identificat prin RIH, RN, RFC, ELISA, teste de toxicitate şi prin RT-PCR.

Neuraminidaza (NA) este tot un antigen major de suprafaţă; au fost descrise 9 subtipuri de NA, primele 2, NA1 şi NA2, fiind proprii tulpinilor umane de VG. Ag NA este identificat prin RIH si teste imunenzimatice. Acest Ag nu induce apariţia de Ac neutralizanţi. Variabilitatea antigenetică - au fost descrise două tipuri: minoră şi majoră.

10. 
    Variaţia antigenică minoră (antigenic drift): este consecinţa unor mutaţi spontane la nivelul genelor ce codifică sinteză HA şi NA; apare drept urmare a presiunii imunologice exercitate de populaţia gazdă.
    
11. 
    Variaţia antigenică majoră (antigenic shift): este rezultatul unei reasortări genetice; segmentarea genomului face posibilă recombinarea genetică: o gazdă receptivă atât pentru tulpinile umane cât şi pentru cele animale (ex. porc, păsări) poate fi un adevărat “creuzet” unde 2 segmente se pot recombina; rezultă structuri antigenice noi. O nouă HA sau/şi NA vor duce la sinteza unei noi tulpini de virus, practic a unui virus nou care va surprinde populaţia neimunizată.
    

VGA este supus ambelor tipuri de variaţie, pentru VGB s-a descris numai forma minoră, iar pentru tipul C există o singură variantă antigenică stabilă.


HEMAGLUTININĂ




NEURAMINIDAZĂ


Fig. 16: Variaţia antigenică a virusurilor gripale
Pandemiile care au evoluat de-a lungul acestui secol au fost semnalate în 1918, 1957 şi 1968.

1. 
   1918-1919: “gripa Spaniolă” cu virusul A/H1N1 a determinat 20 milioane decese;
   
2. 
   1957-1958: gripa “Asiatică”, cu A/H2N2 - 70.000 decese în SUA;
   
3. 
   1968-1969: gripa ”Hong Kong”, cu virusul A/H3N2, a determinat 34.000 decese numai în SUA.
   

Emergenţa gripei de Hong Kong, în 1968-1969, a marcat noua eră a VGA/H3N2. Când a apărut prima dată, acest virus a fost asociat cu o rată scăzută a mortalităţii, oricum mai scăzută comparativ cu pandemiile precedente.

Ipoteze care au încercat să explice acest lucru:

12. 
    HA a fost diferită faţă de tulpina asiatică A/H1N1; NA2 a rămas aceeaşi, deci, Ac-anti NA2 ar putea să confere o oarecare protecţie.
    
13. 
    Un virus cu o HA similară pare să fi circulat la sfârşitul lui 1890 şi începutul anilor 1900. In acest caz, persoanele peste 60 de ani puteau prezenta Ac protectori dacă au fost infectate în tinereţe cu acest presupus virus.
    

In prezent sunt încă multe lucruri neînţelese:

14. 
    Deşi noul virus emergent A/H3N2 a determinat mai puţine decese în 1968, comparativ cu alte virusuri pandemice, acest virus continuă totuşi să determine multe decese. De-a lungul timpului, a dus la 400.000 decese numai în SUA; peste 90% dintre acestea au fost persoane în vârstă. Dintre virusurile gripale care circulă în prezent în lume, A/H3N2 are cel mai sever impact.
    
15. 
    Alt virus care circulă în paralel cu acesta, este A/H1N1; şi el are o istorie interesantă: după epidemia devastatoare din 1918-1919, acest virus continuă să circule şi este supus variaţiilor antigenice minore (antigenic drift). Determină periodic epidemii, dar nu ca cea din 1918. Când tulpina Asiatică A/H2N2 a izbucnit în 1957, atunci A/H1N1 a dispărut, aşa cum a “murit” şi A/H2N2, când virusul A/H3N2 a apărut în 1968.
    
16. 
    In 1977, A/H1N1 a reapărut şi, de atunci, cele 2 virusuri circulă în paralel. Se pare că virusul care a reapărut este identic cu cel din 1950. Astfel, mulţi dintre cei născuţi înainte de 1950 au fost imuni şi epidemiile cu VGA/H1N1 care au survenit începând cu 1977 au afectat, desigur, copii. Faptul că populaţia mai în vârstă pare să aibă o protecţie naturală faţă de VGA/H1N1 care evoluează acum, explică rata joasă a mortalităţii din ultimele epidemii.
    

Rezistenţa la agenţi fizico-chimici

VG sunt inactivate de căldură, radiaţii UV sau gamma: infectivitatea dispare după 20-30 min., la 56ºC. Fiind virusuri învelite, pot fi distruse şi prin solvenţi organici, formol si beta-propiolactonă. Infectivitatea este păstrată pentru câteva zile la + 4ºC şi pentru ani de zile la - 70ºC sau prin liofilizare.

Patogenie:

Răspândirea virusului de la o persoană la alta se face prin intermediul aerosolilor sau prin contactul cu mâini şi suprafeţe contaminate. Virusul inhalat este depozitat la nivelul mucoasei care căptuşeşte tractusul respirator. Ţinte pentru virus sunt celulele epiteliale cum sunt cele ciliate sau secretoare de mucus şi, drept consecinţă, afectează imunitatea de tip nespecific, sau primară. Doze infectante: 120-300 DICT₅₀ pentru subtipul A/H3N2 sau 3 DICT₅₀ pentru subtipul A/H2N2.

NA facilitează infecţia prin clivarea reziduurilor de acid sialic de la nivelul stratului de mucus şi, în acest fel, permite ataşarea virusului via HA. Multiplicarea virusului determină necroze şi distrucţii ale epiteliului respirator, eliminarea de virus fiind semnalată cu o zi anterior debutului bolii. Cele mai mari cantităţi de virus (10⁴ – 10⁷ /ml secreţie) se elimină prin secreţiile naso-faringiene, între zilele 3-8 de boală ajungându-se la 10⁹ particule/ml secreţie în formele severe, ce evoluează cu pneumonie. Simptomatologia generală (cefalee, frison) indică diseminarea viremică, deşi virusul este rar izolat din sânge. Distrucţiile celulare s-ar putea datora măcar parţial intervenţiei limfocitelor T citotoxice faţă de antigenele virale exprimate la nivelul celulei gazdă.

La indivizii normoreactivi evoluţia bolii este autolimitată. Când virusul capătă acces la nivelul TRI, poate determina descuamarea importantă a epiteliului bronhiolar sau alveolar. Pe această cale, VG permite aderarea bacteriilor la nivelul celulelor epiteliale. Secundar acţiunii primare a VG evoluţia poate fi spre o pneumonie atipică primară sau, secundar unei infecţii bacteriene, se ajunge la pneumonie lobară acută: cel mai frecvent, suprainfecţia bacteriană este cu S. pneumoniae, H. influenzae sau S. aureus. Lezarea celulelor induce un proces acut inflamator cu edem şi atracţia celulelor fagocitare.

Răspunsul imun

Este de durată, fiind specific pentru fiecare subtip. Caracteristică este imunitatea de tipul “păcatului antigenic originar”: reinfecţia cu subtipuri înrudite antigenic determină un răspuns anamnestic secundar faţă de epitopii virusului iniţial dar şi un răspuns de tip primar faţă de noua tulpină infectantă. Eficienţa acestui “fenomen” este de 4-7 ani.

1. 
   Răspunsul umoral
   

Deşi apar Ac faţă de toate proteinele virale, singurii protectori faţă de o nouă reinfecţie sunt Ac anti HA din ser, de clasă IgG dar şi de la nivelul mucoaselor, Ac de clasă IgA. Efectele prezenţei lor: neutralizarea infectivităţii virale, agregarea virionilor şi liza celulelor infectate viral, mediată de C’. Ac anti-NA, prezenţi în ser şi secreţii contribuie la diminuarea severităţii bolii şi a cantităţii de virus eliberată de la nivelul celulei infectate. Ac antiproteina M şi NP nu au rol protector.

Dinamica apariţiei Ac-lor: titrul lor creşte la sfârşitul primei săptămâni de boală şi este maxim după 3 săptămâni. Ac serici persistă ani de zile, iar cei de la nivelul mucoaselor, 3-5 luni de la contactul infectant.

2. 
   Răspunsul celular
   

Precoce, în primele trei zile de boală, se constată creşterea numărului de neutrofile şi scăderea limfocitelor, cu normalizarea lor ulterioară. Răspunsul celular este specific de tip, antigenele recunoscute predominant de către limfocitele T citotoxice fiind NP şi Ag M1. Faţă de HA apare un răspuns de tip încrucişat, limfocitele T, CD8 şi CD4 pozitive, recunoscând epitopi ai VGA umane dar şi ai tulpinilor aviare şi porcine, protejând parţial gazda umană faţă de infecţiile cu aceste tulpini.

Manifestări clinice

Posibilităţile evolutive sunt variate: de la afecţiuni respiratorii moderate cu rinită şi faringită, la PAP cu posibil deces. Infecţiile asimptomatice pot atinge 50%.

Tipic, fără a fi patognomonic pentru gripă, este debutul brusc, cu febră şi tuse. Tabloul clinic nu diferenţiază în nici într-un caz gripa de alte infecţii respiratorii. Numai diagnosticul de laborator este util acestui scop. La bătrâni tabloul clinic este atipic.

1. 
   Adulţi: debut - febră, frisoane, cefalee, disfagie, tuse uscată, mialgii, astenie, anorexie. Febra de 38 – 40 C se atinge la 24 de ore de la debut şi durează, de regulă, 3 zile (limite 1 – 5 zile). Simptomatologia se remite cel mai frecvent într-o săptămână dar tusea şi astenia pot persista încă o săptămână după remiterea febrei. In ultimul timp, au evoluat VGA: H1N1, H2N2, H3N2 şi VGB, toate determinând o simptomatologie asemănătoare. In general, VGB determină infecţii mai puţin severe decât VGA, iar VGA/ H3N2 pare a fi cel mai “periculos”. La bătrâni, simptomele majore sunt: anorexia, lentoarea, febră neexplicată, astenia, rinita şi starea de confuzie.
   
2. 
   Copii şi nou-născuţi: VGA şi VGB sunt agenţi etiologici importanţi atât pentru infecţiile TRS cât şi pentru TRI. Simptomatologia este asemănătoare cu cea a adultului, dar tulburările gastrointestinale, cum ar fi durerile abdominale, vărsăturile şi diareea, sunt mai frecvent semnalate, ca şi miozitele, crupul şi otita medie. Infecţia la nou-născut este posibil fatală şi se poate manifesta doar prin febră de etiologie neprecizată.
   

Complicaţii:

1. 
   TRS: sinuzite bacteriene, otite medii.
   
2. 
   TRI: exacerbarea unor boli pulmonare cronice obstructive, insuficienţă cardiacă congestivă, crup, bronşite, pneumonii. Pneumonia este rar determinată per primam de VG; mai frecvent constă în suprainfecţii bacteriene şi instalarea unei pneumonii lobare acute.
   
3. 
   Aparat circulator: rar implicat; posibile miocardite, pericardite şi tromboflebite.
   
4. 
   Sindromul Reye este o complicaţie rară, ce constă în insuficienţă hepatică şi encefalopatie, având o rată a mortalităţii de 30%- 40%. Apare mai ales la copii (între 2-16 ani) secundar unor infecţii virale (ex. gripă, mai ales cu tip B, varicelă) şi a terapiei cu aspirină administrată ca antipiretic. De aici rezultă interdicţia utilizării ei în tratamentul simptomatic, la copii, în infecţii virale. Patogenia este necunoscută. Hipoglicemia, creşterea transaminazelor, a amoniacului în sânge şi a timpului de protrombină, asociate tulburărilor mentale, apar la 2-3 săptămâni de la debutul infecţiei virale. Tratamentul este doar suportiv şi este adresat combaterii edemului cerebral.
   

Diagnosticul de laborator: direct şi indirect.

• 
  diagnostic direct (secreţii nazale, faringiene)
  
• 
  aspiratul naso-fariangian, la copil, poate fi util atât pentru izolarea de virus, cât şi pentru diagnosticul rapid, direct, prin evidenţierea de antigene în probă:
  
  • 
    metode rapide: IF, ELISA, metode moleculare (RT-PCR);
    
  • 
    izolarea virusului pe ouă embrionate sau culturi de celule, urmată de caracterizarea/ identificarea Ag;
    
• 
  diagnostic indirect: seroconversia sau dinamica ascen-dentă/semnificativă a Ac specifici prin RFC, RIH, ELISA.
  

Produse patologice:

1. 
   Secreţiile nazale, lichidul de spălătură nazofaringian, eventual aspiratul traheal, lichidul de spălătură bronşică, recoltate cât mai precoce, în primele trei zile de boală; în lipsa lor, se poate apela la recoltările per tampon faringian, respectiv nazal, descărcate în acelaşi mediu de transport (pentru un pacient); aceste produse patologice sunt utile pentru izolarea VG pe culturi de celule de rinichi de maimuţă sau pentru inocularea pe ouă embrionate.
   

Atenţie la transport şi conservare! Transportul trebuie sa fie cât mai rapid sau, dacă inocularea este întârziată, proba se conservă la 4C dar nu se congelează! Aspiratul naso-fariangian, la copil, poate fi util atât pentru izolarea de virus, cât şi pentru diagnosticul rapid, direct, prin evidenţierea de antigene în probă.

Diagnosticul direct

1. 
   Izolarea şi identificarea
   

17. 
    Cultivarea pe culturi de celule: culturi primare de rinichi de maimuţă (PMK), linia celulară MDCK (Madin-Darby Canine Kidney), celule Vero; temperatura optimă de cultivare este 33ºC, mai ales în sistemul rotativ de culturi de celule. După inoculare, apare un efect citopatic, nespecific, în medie după 4 zile.
    
18. 
    Cultivarea pe ouă embrionate. Se folosesc embrioni de găină de 10 11 zile. Iniţial, se inoculează produsele patologice, pentru adaptarea la noua gazdă în cavitatea amniotică, după care, pasaje succesive, prin inocularea în cavitatea alantoidiană, cresc şansele obţinerii unor cantităţi importante de antigen. După incubarea la 33ºC , după 3-5 zile, urmează identificarea în lichidul alantoidian.
    

Identificarea VG

Identificarea antigenelor izolate pe gazde vii se face prin RFC pentru identificarea antigenelor specifice de tip sauşi prin RIH cu hematii de găină, R de hemadsorbţie, IF sau EIA.

(b) Diagnosticul gripei prin metode rapide

Se bazează pe evidenţierea directă a antigenlor gripale în produsele patologice.

19. 
    IF: test laborios, presupune dotare tehnică specială şi personal instruit. In plus, costul truselor este încă prohibitiv; iniţial identificarea se facea până la nivel de tip (A respectiv B). In prezent există variante cu Ac monoclonali car eidentifică şi subtipurile circulante.
    
20. 
    ELISA: deşi prezintă dezavantajul identificări doar a subtipului, ELISA are în mod evident unele avantaje faţă de IF: este automatizată, mai ieftină, nu presupune prezenţa de celule intacte (se poate lucra şi pe produse patologice menţinute câteva zile la frigider). Se poate utiliza direct produsul patologic sau se poate recurge la identificarea prin ELISA după o inoculare iniţială pe CC (timp de 12-24 ore), de regulă pe celule MDCK.
    
21. 
    Teste imunoenzimatice de tip directigen: principial asemănătoare cu ELISA; este o reacţie de culoare, care apare în câteva minute. Deşi nu are sensibilitatea şi specificitatea ELISA sau IF, poate fi utilizată ca test de tip sceening de către medicii de familie.
    
22. 
    RT-PCR: nu înlocuieşte metodele clasice însă este foarte utilă pentru detecţia rapidă a subtipurilor circulante cu potenţial epidemiogen crescut, permiţând luarea de măsuri rapide în context epidemiologic particular (evoluţia rapidă în populaţie a unui nou subtip).
    

Diagnosticul serologic: presupune recoltarea a 2 probe de ser (la 10–14 zile interval); nu are finalităţi practice pentru diagnosticul clinic, ci, mai curând, pentru cel epidemiologic, fiind util pentru precizarea circulaţiei VG în populaţie şi pentru aprecierea eficienţei vaccinării.

Tratament: analgezice şi antitusive, ca tratament simptomatic. Ca antipiretic se preferă acetominofenul (pentru a preveni sindromul Reye).

Amantadina şi rimantadina sunt drogurile de elecţie (rimantadina mai ales la cei cu insuficienţă renală). Se administrează cât mai precoce, atât în scop profilactic cât şi terapeutic; reduc perioada de boală cu aproximativ 50%.

Mecanism de acţiune: inhibarea funcţiei proteinei M2 (iniţial, în etapa pătrunderii virusului şi, ulterior, prin stoparea disocierii ribonucleoproteinei) şi a maturării virale.

Efecte adverse: de tip nervos, mai ales pentru amantadină, şi rezistenţa la antivirale

Zanamivir, analog de acid sialic, inhibă selectiv NA, prevenind eliberarea virusului din celulă. Netoxic, bine tolerat. Oseltamivir, inhibitor de NA, scurtează boala cu 1- 3 zile; rar determină tulburări digestive Antibiotice: numai pentru profilaxia sau terapia suprainfecţiilor bacteriene.

Epidemiologie

Variabilitatea antigenică face ca, permanent, un număr mare de persoane să fie receptive la boală; desigur, copiii sunt mai frecvent afectaţi. In zonele temperate, epidemiile sunt practic anuale, durează 4-6 săptămâni şi sunt caracteristice sezonului rece. Variaţiile antigenice minore determină izbucniri epidemice iar cele majore, pandemii. OMS a recomandat ca, în fiecare ţară, să existe Centre Naţionale de Referinţă pentru supravegherea sero-epidemiologică a gripei, cu scopul surprinderii noii variante antigenice cât mai precoce şi, implicit, al producerii de vaccin.

Sursa de virus: bolnavii cu forme tipice şi atipice de boală. Purtătorii preinfecţioşi sunt periculoşi, diseminând virusul, în cantităţi mari, 24 -36 de ore, anterior debutului. Ceilalţi purtători, sănătoşi şi foşti bolnavi, nu sunt periculoşi deoarece eliminarea virusului este tranzitorie. Transmiterea virusului se face mai ales direct datorită marii sensibilităţi a virusului la agenţi fizico-chimici şi ai factorilor de mediu. Transmiterea directă este favorizată mai ales în condiţii de aglomeraţie iar cea indirectă, mai rar incriminată, presupune transmiterea prin aer, mâini sau obiecte contaminate. Receptivitatea este generală, cu afectarea mai ales a vârstelor extreme, gravidelor şi imunosupresaţilor.

Manifestarea procesului epidemiologic

Manifestarea sporadică, posibilă pe parcursul întregului an. Epidemia este manifestarea caracteristică gripei, evoluând anual, iar la intervale de 3-5 ani îmbracă un caracter mai sever, extensiv. Manifestarea pandemică, secundară variaţiilor antigenice majore, survine la intervale variabile, de regulă 2040 de ani; riscul privind o viitoare pandemie explică programul internaţional de supraveghere a circulaţiei tulpinilor de virus gripal A la nivel mondial.

Prevenţie

Prevenţie generală: creşterea rezistenţei generale, măsuri de educaţie sanitară, evitarea aglomeraţiei în sezon epidemic.

Prevenţie specială: administrarea de imunoglobuline şi antivirale, mai ales pentru grupele de risc. Prevenţie specifică: vaccinarea anuală, cu formula vaccinală corespunzătoare tulpinilor de virus circulante.

Scopul imunizării: producerea de Ac neutralizanţi anti-HA şi anti-NA. Protecţia este strict faţă de tulpinile înrudite celor din compoziţia vaccinului: A/H3N2, A/H1N1 şi B.

Tipuri de vaccin: vaccin integral inactivat prin formol sau beta-propiolactonă a fost introdus în practică încă din 1933. Vaccinul cultivat pe embrion de găină are drept contraindicaţie majoră alergia la proteinele din ou. In prezent, se utilizează vaccinul trivalent, din virus omorât, fracţionat şi purificat, înalt imunogen. Alte tipuri: vaccin viu atenuat şi vaccin corpuscular (conţine numai HA şi NA). Vaccinul cu administrare locală are avantajul sintezei de IgA, dar nu este acceptat de populaţie.

Grupe vaccinabile: persoanele peste 65 de ani, bolnavii cu afecţiuni pulmonare, cardiace, diabeticii, copiii sub 14 ani, personalul medical, etc. Persistenţa Ac-lor post-vaccinal doar un an impune repetarea vaccinării în lunile septembrie-octombrie.