FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

BÖLÜM IV. CO₂ DEĞİŞİM TESTİ (Yöntem C.4-C)
IV.1 Test yönteminin ilkesi
Ölçülmüş miktarda aşı mineral ortamı içeren, bilinen derişimdeki test kimyasalı (10-20 mg DOC veya TOC/litre) tek organik karbon kaynağı olarak kontrollu bir hızla karanlıkta veya dağınık ışıkta karbon dioksit içermeyen hava ile havalandırılır. Bozunma baryum veya sodyum hidroksit içinde yakalanan ve kalıntı hidroksitin titrasyonu veya inorganik karbon olarak ölçülen karbon dioksitin belirlenmesi ile 28 günlük süre boyunca takip edilir. Test kimyasalından (kör aşıdan türetilen için doğrulanmış) üretilen karbondiksit miktarı yüzde ThCO₂ olarak ifade edilir. Biyolojik bozunma derecesi inkübasyonun başlangıcında ve sonunda yapılan tamamlayıcı DOC analizinden hesaplanabilir.

IV.2 Test yönteminin tanımlanması

IV.2.1 Düzenek

1. 
   2-5 litrelik kaplar, herbiri hemen hemen kabın dibine ve çıkışına uzanan havalandırma tüpüyle tutturulmuş;
   
2. 
   manyetik karıştırıcılar, az çözünen kimyasalları belirlerken;
   
3. 
   Gaz soğurma (absorpsiyon) şişeleri
   
4. 
   Hava akışını kontrol eden ve ölçen cihaz;
   
5. 
   karbon dioksit içermeyen havayı hazırlamak, karbon dioksit temizlemek için düzenek; alternatif olarak gaz silindirlerinden CO2 içermeyen oksijen ve CO2 içermeyen azot karışımı doğru oranlarda (% 20 O2 : % 80 N2) kullanılabilir;
   
6. 
   Karbon dioksitin belirlenmesi için cihaz, ya titrimetrik olarak ya da inorganik karbon analiz cihazının bazı çeşitleri;
   
7. 
   Membran tipi süzme cihazı (isteğe bağlı);
   
8. 
   DOC analiz cihazı (isteğe bağlı).
   

IV.2.2 Mineral ortamının hazırlanması

Stok çözeltilerinin hazırlanması için, bakınız I.6.2

10 ml (a) çözeltisini 800 ml seyreltme suyuyla karıştır, (b) çözeltisinden 1 ml (d) çözeltisine ekle ve seyreltme suyuyla 1 litreye tamamla.

IV.2.3. Aşının hazırlanması ve ön şartlandırılması

Aşı çok şeşitli kaynaklardan elde edilebilir: aktif kanalizasyon atıksuyu çamur; lağım atıkları; yüzey suları; toprak veya bunların karışımlarından.

Bakınız I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ve I.6.5
IV.2.4 Cam balonların hazırlanması
Aşağıda örnek olarak verilen ağırlıklar ve hacimler 3 L süspansiyon içeren 5 litrelik kapları gösterir. Eğer daha düşük hacimler kullanılırsa değerleri ona göre değiştirin, fakat oluşan karbon dioksitin doğru bir şekilde ölçülebildiğinden emin olun.
Her 5-litrelik kap için 2400 ml mineral ortamdan ekleyin. Asılı katı partiküllerin derişimini, son aşılanmış karışımın 3 litresinde 30 mg/l den fazla olmayacak şekilde hazırlanmış aktif çamurdan uygun hacimde ekleyin. Alternatif olarak, 30 mg/l derişimi elde etmek için 5 litrelik kap içerisine madde eklemeden önce, ilk olarak mineral ortamında 500-1000 mg/l süspansiyon verecek şekilde aktif çamuru seyreltin; bu daha yüksek kesinliği garanti altına alır. Diğer aşı kaynaklarıda kullanılabilir (Bakınız I.6.4.2).

Karbon dioksit içeriğini temizlemek için aşılanmış karışımları CO₂ içermeyen hava ile gece boyunca havalandırın.

10 ile 20 mg arasında DOC ceya TOC/L eklenen kimyasal payı ile istenen derişimlere ulaşmak, kap sayısını çoğaltmak için bilinen hacimdeki stok çözeltilerden, test maddesini ve referans maddesini ayrı ayrı ekleyin; Aşı kontrolu olarak bazı kapları kimyasalları eklemeden bırakın. Zor çözünen test maddelerini Ek-III’ de açıklandığı gibi ağırlık ve hacim temeline veya elleclemeye göre, kaplara direk olarak ekleyin.
Eğer gerekiyorsa, diğer kaplarda benzer konsantrasyonlarda olan test ve referans kimyasallarının her ikisinden eklenmesiyle test kimyasalının mümkün olan inhibitör etkisini kontrol etmek için bir kap kullanın.
Hatta gerekiyorsa test kimyasalının abiyotik olarak bozunduğunu kontrol etmek için kimyasalın aşılanmamış çözeltisini (Bakınız I.6.6) içeren steril bir kap kullanın.
Uygun derişimde toksik (zehirli) madde koyarak sterilize edin.
Daha önce CO₂ içermeyen hava ile havalandırılmış mineral ortam eklemesiyle, tüm kaplardaki süspansiyon hacimlerini 3 L’ye tamamlayın. İsteğe bağlı olarak DOC (bakınız Ek-II.4.) analizi ve/veya spesifik analiz için örnekler alınabilir. Absorpsiyon (sogurma) şişelerini kapların hava çıkışlarına bağlayın.
Eğer baryum hidroksit kullanılırsa, her biri 100 ml 0,0125 M baryum hidroksit çözeltisinden içeren üç absorpsiyon şişesinin herbirini seri olarak 5 litrelik cam balona bağlayın. Çözelti çökmüş sülfat ve karbonat içermemelidir ve şiddeti kullanmdan hemen önce belirlenmelidir. Eğer sodyum hidroksit kullanılırsa, iki tutucu bağlayın, ikincis tutucu karbon dioksitin ilk tutucuda tamamen absorblandığını göstermek için kontrol amaçlı kullanılır. serum şişesi kapaklarıyla oturtulmuş absorbsiyon şişeleri uygundur. Her şişeye, test kimyasalı tamamen bozunduğunda açığa çıkan toplam karbon dioksitin miktarını absorblamak için yeterli olan 200 ml 0,05 M sodyum hidroksit ekleyin. Sodyum hidroksit çözeltisi, taze olarak hazırlandığında bile, eser miktarda karbonat içerecektir; bu körteki karbonatın düşülmesi ile düzeltilecektir.
IV.2.5 Tipik bir uygulamada cam balon sayısı

Kap 1 ve 2: Test süspansiyonu

Kap 3 ve 4: Kör aşı

Kap 5: İşlem kontrolu

ve tercihen ve gerekli olduğunda

Kap 6: Abiyotik steril kontrolü

Kap 7: Toksisite Testinin performansı
Teste, süspansiyondan 30-100 ml/min hızında CO₂ içermeyen hava geçirerek başlayın. CO₂ miktarının analizi için, karbon dioksit soğurucusundan periyodik olarak örnek alın. İlk on günlük sürede, analizler iki ve üç günlük aralarda ondan sonra 28. güne kadar beş günde bir yapılmalı, böylelikle 10 günlük çalışma süresi tanımlanabilir.
28. günde, DOC ve/veya spesifik analiz için örnekler alın, süspansiyonların pH’ ını ölçün ve her kaba 1 ml derişik hidroklorik asit ekleyin; test süspansiyonu içinde bulunan karbon dioksiti uzaklaştırmak için gece boyunca kapları havalandırın. 29 ncu günde açığa çıkan karbon dioksit için son analizi yapın.
CO₂ ölçüm günlerinde, kaba yakın olan baryum hidroksit soğurucu bağlantısını kesin ve fenol ftalein’i indikatör olarak kullanarak, hidroksit çözeltisini 0,05 M HCl ile titre edin. Geriye kalan soğuruculardan ilkini kaba yakın olan bir yere yerleştirin ve 100 ml taze 0,0125 M baryum hidroksit içeren yeni bir soğurucuyu serinin en sonuna yerleştirin. Gerektiği zaman titrasyon yapın, örneğin, ilk tutucu fazla çökelti görüldüğünde, ikincide ortada henüz bişey yokken veya en az haftalık olarak. Alternatif olarak, soğurucu olarak NaOH kullanıldığında, cam balonun yakınındaki soğurucudaki sodyum hidroksit çözeltisinden şırınga ile küçük bir örnek alın (kullanılan karbon analiz cihazının özelliğine bağlı olarak). Açığa çıkan karbon dioksitin direk analizi için, örneği karbon analiz cihazının IC (inorganik karbon) kısmına enjekte edin.
Herhangibir karbon dioksit düzeltimi için İkinci tutucunun içeriğini sadece testin sonunda analiz edin.
IV.3 Veriler ve raporlama
IV.3.1 Sonuçların işlenmesi
Soğurucuda yakalanan CO₂ titrasyon yapıldığında şu şekilde verilir:
mg CO₂ = (100 x C_B – 0,5 x V x C_A) x 44

burada:

V= soğurucudaki 100 ml’ nin titrasyonu için kullanılan HCl hacmi (ml),

C_B= Baryum hidroksit çözeltisin derişimi (M),

C_A= hidroklorik asit çözeltisinin derişimi (M),
Eğer C_B 0,0125 M ve C_A 0,05 M ise, 100 ml baryum hidroksit için titrasyon 50 ml’ dir ve CO₂ ağırlığı şu şekilde verilir:

(0,05/2) x 44 x titrasyon yapılan ml HCl = 1,1 x ml HCl

Böylece, bu durumda, üretilen mg CO₂ için titrasyon yapılan HCl hacmini çevirmek için faktör 1,1 dir.
Yalnız aşıdan ve aşı artı test kimyasalından kendi titrasyon değerlerini kullanarak elde edilen CO₂ ağırlığını hesaplayın, fark sadece test kimyasalından üretilen CO₂ ağırlığıdır.
Örneğin, Sadece aşı 48 ml titrasyon verirse ve aşı artı test kimyasalı 45 ml verirse,

aşıdan gelen CO₂ = 1,1 x (50-48) = 2,2 mg

Aşı artı test kimyasalından gelen CO₂ = 1,1 x (50-45) = 5,5 mg

Ve böylece test kimyasalından elde edilen CO₂ ağırlığı 3,3 mg olur.

Yüzde biyolojik bozunma şu şekilde hesaplanır:

% bozunma = (mg CO₂ üretilen x 100)/(ThCO₂ x eklenen mg test kimyasalı)

veya,

% bozunma = (mg CO₂ üretilen x 100)/(testde eklenen mg TO x 3,67)

3,67, karbon dioksitin karbona oranı (44/12), karbonun karbondioksite dönüşüm faktörüdür.
Ölçüldüğü zamana kadar, herhangibir zaman aralığında hesaplanan yüzde ThCO₂ değerleri eklendikten sonra, yüzde bozunmayı elde edin.
Sodyum hidroksit soğurucuları için, IC (inorganik karbon) (mg) şeklinde ifade edilen üretilen karbon dioksit miktarını, soğurucunun hacmi ile soğurucudaki, IC konsantrasyonunu çarparak hesaplayın.

Yüzde bozunmayı şu şekilde hesaplayın:

ThCO₂ yüzdesi = (cam balondaki mg IC – körteki mg IC x 100)/( Test kimyasalı olarak eklenen mg TOC)
Uzaklaştırılan DOC miktarını I.7 altında açıklandığı gibi hesaplayın (isteğe bağlı). Bunları ve diğer sonuçları sağlanan veri formlarına kayıt edin.
IV.3.2 Sonuçların geçerliliği
Test kimyasalı süspansüyonunun, test başlangıcındaki mineral ortamı içindeki IC içeriği TC’ nin % 5‘ inden az olmalı ve test sonunda kör aşıdaki toplam CO₂ değişimi normal olarak 40 mg/l ortam değerini geçmemelidir. 70 mg CO₂ /litreden daha büyük değerler elde edilirse, elde edilen veriler ve deneysel yöntem kritik olarak incelenmelidir.
Ayrıca bakınız I.5.2.
IV.3.3. Raporlama
Bakınız I.8
IV.4 Veri formu
Veri formunun bir örneği aşağıda verilmektedir.
KARBON DİOKSİT DÖNÜŞÜM TESTİ

1. 
   LABORATUVAR
   
2. 
   TESTİN BAŞLANGIÇ TARİHİ
   
3. 
   TEST MADDESİ
   

İsim:

Stok çözelti konsantrayonu: kimyasal olarak mg/ml

Ortamdaki ilk konsantrasyon: kimyasal olarak mg/ml

Kaba eklenen toplam C: mg C

ThCO₂: mg CO₂

4. 
   AŞI
   

Kaynak:

Yapılan işlemler:

Varsa ön şartlandırma:

reaksiyon karışımındaki asılı katıların konsantrasyonu: mg/litre

Zaman (gün)	Oluşan CO2 (mg) test		Elde edilen CO2 (mg) kör		Oluşan toplam CO2 (mg) (Test eksi kör ortalaması)		ThCO2
	1 2	ortalama	3 4	ortalama	1	2	1	2	Orta-lama
0
n1
n2
n3
28

Not: Referans kimyasallar ve toksisite kontrolleri için benzer formatlar kullanılabilir.

5. 
   KARBON ANALİZİ (isteğe bağlı)
   

Karbon analiz cihazı:

Zaman (gün)	Kör mg/l	Test kimyasalı mg/l
0	Cb(0)	C0
28 (*)	Cb(t)	Ct
(*) inkübasyonda veya inkübasyon sonunda

6. 
   ABİYOTİK BOZUNMA (isteğe bağlı)
   

BÖLÜM V. MANOMETRİK RESPİROMETRE TESTİ (Yöntem C.4-D)
V.1 Test yönteminin ilkesi
Ölçülmüş hacimdeki tanımlanmış tek organik karbon kaynağı olarak bilinen derişimde test kimyasalı (en az 50-100 mg ThOD/litre vermek için test maddesinin 100 mg/litresi) içeren, aşılanmış mineral ortamı 28 günün sonuna kadar sabit sıcaklıkta (±1 ^°C veya daha yakın) karıştırılır. Okisjen tüketimi, ya sabit gaz hacminin korunmasını gerektiren respirometre kabında oksijen miktarının (elektroliz yöntemiyle üretilen) ölçülmesiyle ya da düzenek içindeki hacim veya basınç (veya ikisinin kombinasyonunun) değişiminden elde edilir. Açığa çıkan karbon dioksit, potasyum hidroksit çözeltisine veya diğer uygun soğurucuya soğurulur. Test kimyasalı (alınan oksijen parallel yürütülen kör aşı ile karşılaştırılarak düzeltilmiş) tarafından alınan oksijen miktarı ThOD veya COD yüzdesi olarak ifade edilir. İsteğe bağlı olarak birincil bozunma, inkübasyonun başında ve sonunda yapılan tamamlayıcı özel analizlerle ve DOC analizi ile nihai biyolojik bozunmadan hesaplanabilir.
V.2.1. Test yönteminin tanımlanması
V.2.1. Düzenek
(a) uygun respirometre;

(b) ±1 °C veya daha iyi hassasiyette sıcaklık kontrolu;

(c) membranlı süzme düzeneği (isteğe bağlı);

(d) Karbon analiz cihazı (isteğe bağlı).

V.2.2 Mineral ortamının hazırlanması
Stok çözeltilerinin hazırlanması için, bakınız I.6.2

10 ml (a) çözeltisini 800 ml seyreltme suyuyla karıştırın, (b) çözeltisinden 1 ml (d) çözeltisine ekleyin ve hacmi seyreltme suyuyla 1 litre yapın.

V.2.3. Aşının hazırlanması ve ön şartlandırması
Aşı farklı birçok kaynaktan türetilebilir: aktif çamur; kanalizasyon atıkları, yüzey suları ve topraktan veya bunların karışımlarından.
Bakınız I.6.4, I.6.4, I.6.4.2 Kapların hazırlanması

Test ve referans kimyasallarının çözeltilerini, stok çözeltilerini kullanarak mineral ortamı içinde, normal olarak konsantrasyon 100 mg kimyasal/litreye (en az 50-100 mgThOD/litreyi verecek şekilde) eşit ayrı ayrı seriler halinde hazırlayın.

Hesaplama nitrat oluşumuna dayandırıldığında (Bakınız Ek-II.2) nitratlaşma umulmuyorsa, ThOD’ yi amonyum tuzlarının oluşumuna dayandırarak hesaplayın.

pH değerlerini belirleyin, eğer gerekliyse 7,4±0,2’ ye ayarlayın

Az çözünen maddeler daha sonraki bölümlerde eklenebilir (bakınız aşağıda).
Eğer test kimyasalının toksisitesi belirlenecekse, kendi çözeltilerinde olduğu gibi mineral ortam içinde aynı derişimlerde hem test hemde referans maddesi içeren başka bir çözelti hazırlayın.

Eğer fizikokimyasal oksijen alımının ölçülmesi gerekliyse, uygun toksik madde (Bakınız I.6.6) eklenerek sterilize edilmiş normal olarak 100 mg ThOD/litrede bir test kimyasal çözeltisi hazırlayın.

En az iki cam balona, test ve referans maddesi çözeltisinden sırasıyla gerekli miktarda koyun. Başka kaplara sadece mineral ortamı (aşı kontrol için) koyun ve gerekliyse test/referans kimyasal çözeltisi ve steril çözeltisini karıştırın.

Eğer test kimyasalı az çözünen bir madde ise, bu kısımda ağırlık veya hacim temeline göre doğrudan ekleyin veya Ek-III’e göre işlem yapınız. CO₂ soğurucu ortamlara sodyum hidroksit, sönmemiş kireç veya diğer soğurucuları koyun.

IV.2.5 Tipik bir uygulamadaki cam balon sayısı

Kap 1 ve 2: Test süspansiyonu

Kap 3 ve 4: Kör aşı

Kap 5: İşlem kontrolu

ve tercihen ve gerekli olduğunda:

Kap 6 : Steril kontrolu

Kap 7: Toksisite kontrolu

Ayrıca bakınız 1.6.7.

V.2.6. Testin performansı

Kapların istenen sıcaklığa ulaşmasına izin verin ve hazırlanmış aktif çamur veya diğer aşı kaynakları ile asılı katıların derişimi 30 mg/litreden daha fazla olmayacak şekilde uygun kapları aşılayın. Cihazı kurun, karıştırıcıyı başlatın ve hava geçirmezliğini kontrol edin ve oksijen alımı ölçümünü başlatın. Çoğunlukla gerekli okumaları yapmak, doğru sıcaklık ve yeterli karıştırmanın sağlanmasını günlük kontrol etmek dışında dikkat gerektiren başka bir şey yoktur.

Sık ve düzenli yapılan okumalarla, cihaz üreticisi tarafından verilen metodları kullanarak oksijen alınımını hesaplayın. 28 günlük normal İnkübasyon sonunda özellikle eğer oksijen alımı ThODNH₄’ den (azot içeren bileşikler için) düşükse veya büyükse, kap içeriklerinin pH’ ını ölçün.
Eğer gerekliyse, DOC ve spesifik kimyasal (bakınız Ek-II.4) analizi için başında ve sonunda respirometre kaplarından örnekler alın. İlk alımda, kapta kalan test süspansiyonunun hacminin bilindiğinden emin olun. Oksijen, N-içeren test maddesi tarafından alındığında 28 gün boyunca nitrit ve nitrat derişimindeki artışı belirleyin ve nitratlaşma ile tüketilen oksijen için düzeltmeyi hesaplayın.
V.3 Veriler ve raporlama
V.3.1 Sonuçların işlenmesi
Belirlenen zamandan sonra test kimyasalının oksijen alımını (aynı zaman sonunda kör aşı kontrollu için düzeltilen) kullanılan test kimyasalının ağırlığıyla bölün.

sonuç mg oksijen/mg test maddesi olarak ifade edilen BOD’ u verir. Şu şekildedir:

BOD = (test kimyasalı tarafından alınan mg O₂ – kör tarafından alınan mg O₂)/ (cam balondaki mg test kimyasalı)= mg test kimyasalı başına mg O₂.
Aşağıdaki eşitlikten yüzde biyolojik bozunmayı:

% biyolojik bozunma=%ThOD=BOD (mg O₂/mg kimyasal) x 100/ ThOD (mg O₂ kimyasalı)

ya da buradan
%COD=BOD (mg O2/mg kimyasal) x 100)/COD (mg O2 kimyasalı)hesaplayın.
Bu iki yönteminda aynı değeri verme gerekliliğinin olmadığına dikkat edilmelidir; ilk yöntemin kullanılması tercih edilir.
Azot içeren test maddeleri için, nitratlaşma oluşumu (Ek-II.2) hakkında bilgi sahibi olunan veya tahmin edilen, uygun ThOD (NH₄ veya NO₃) kullanın. Eğer nitratlaşma tamamlanmadan gerçekleşirse, nitratlaşma ile tüketilen oksijen miktarını nitrit ve nitrat (Ek- V) miktarındaki değişmeden düzeltmeyi hesaplayın.
Organik karbonun ve/veya özel kimyasalın isteğe bağlı belirlemesi yapıldığında, I.7. altında açıklandığı gibi yüzde bozunayı hesaplayın.
Eklenen veri formlarına bütün sonuçları kaydedin.
V.3.2. Sonuçların geçerliliği
Normal olarak 20-30 mg/litre olan kör aşı oksijen alımı 28 gün içinde 60 mg/litreden fazla olmamalıdır. 60 mg/litreden yüksek olan veriler, verilerin ve denysel tekniklerin kritik incelemesini gerektirir. Eğer pH değeri 6-8,5 aralığının dışındaysa ve test kimyasalı tarafından oksijen tüketimi % 60’ dan az ise, daha düşük derişimdeki test kimyasalı ile test tekrarlanmalıdır.
Ayrıca bakınız I.5.2
V.3.3 Raporlama
Bakınız I.8
V.4. Veri formu
Veri formunun bir örneği bu aşağıda verilmektedir.
MANOMETRİK RESPİROMETRE TESTİ

1. 
   LABORATUVAR
   
2. 
   TESTİN BAŞLANGIÇ TARİHİ
   
3. 
   TEST MADDESİ
   

İsim:

Stok çözelti konsantrayonu: mg/ml

Ortamdaki ilk konsantrasyon, C₀: mg/ml

Test kabındaki hacim (V): ml

ThOD veya COD: mg O₂/mg test maddesi (NH₄ veya NO₃)

4. 
   AŞI
   

Kaynak:

Yapılan işlemler:

Varsa ön şartlandırma:

reaksiyon karışımındaki asılı katıların konsantrasyonu: mg/l

5. 
   OKSİJEN ALIMI : BİYOLOJİK BOZUNABİLİRLİLİK
   

		Zaman (Günler)
		0		7		14			21		28
O2 alımı (mg) Test kimyasalı	1
	2
	a, ortalama
O2 alımı (mg) Kör	3
	4
	b, ortalama
Düzeltilmiş BOD (mg)	(a1-bm)
	(a2-bm)
mg Test kimyasalı başına BOD
% bozunma	D1(a1)
	D2(a2)
	Ortalama*
V= Test kabındaki ortalama hacim * Eğer önemli bir fark var ise ve ortalaması alınmamalıdır. N.B. : Kimyasal referans ve tosisite kontrolleri için benzer format kullanılabilir.

6. 
   NİTRATLAŞMA İÇİN DÜZELTME ( Bakınız EK- V)
   

Gün	0	28	Fark
Nitrat Derişimi (mg N/litre) Eşdeğer Oksijen (4,57 x N x V)(mg) Nitrit Derişimi (mg N/litre) Eşdeğer Oksijen (3,43 x N x V)(mg) (ii + iv) Toplam Eşdeğer Oksijen	- - - -	- - - -	(N) (N)

7. 
   KARBON ANALİZİ (isteğe bağlı)
   

Karbon analiz cihazı:

Zaman (Gün)	Kör mg/litre	Test kimyasalı mg/litre
0	(Cblo)	(Co)
28*	(Cblt)	(Ct)
* veya inkubasyon sonunda

8. 
   ÖZEL KİMYASAL (isteğe bağlı)
   

S_b = 28 günde fizikokimyasal (steril) kontrol içindeki derişim

S_a = 28 günde aşılanmış kap içindeki derişim,

9. 
   ABİYOTİK BOZUNMA (isteğe bağlı)
   

a = 28 gün sonrasında steril kaplardaki oksijen tüketimi, (mg)

( Bakınız bölüm 1 ve 3)