FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- Diyatomeler
- Tavsiye edilen türlerin görünüm ve karakteristikleri
VERİ
Test kaplarındaki biyokütle, ölçüm için kullanılan vekil parametre birimleri cinsinden ifade edilebilir(örneğin hücre sayısı, floresan). Test materyali konsantrasyonları ve ölçüm zamanları ile birlikte test kültürleri ve kontrollerindeki tahmin edilen biyokütle tablo haline getirilir ve büyüme eğrilerini çizmek için en az her saat başındaki çözünürlük kaydedilir. Hem logaritmik ölçek hem de doğrusal ölçek ilk adımda kullanışlı olabilir, fakat logaritmik ölçekler şart olup genellikle test süresi esnasındaki büyüme şeklinde varyasyonları daha iyi gösterir. Üssel büyümenin, logaritmik ölçek üzerinde çizildiğinde bir doğru ürettiği ve doğrunun eğiminin belirli büyüme hızını belirlediği dikkate alınır. Çizimleri kullanarak, kontrol kültürlerinin test yoluyla beklenen oranda üssel olarak büyüyüp büyümediği tetkik edilir. Bütün veri noktaları ve grafik görünümü dikkatlice tetkik edilir ve olası hatalar için işlenmemiş veri ve prosedür kontrol edilir. Sistematik bir hatayla sapmaya neden olmuş gibi görünen herhangi bir veri noktası özellikle kontrol edilir. Eğer yönetsel hataların belirtilebildiği ve/veya yüksek olasılıkla dikkate alındığı belli ise spesifik veri noktası anahat düzenleyicisi olarak işaretlenir ve sonraki istatiksel analize dahil edilmez(iki ya da üç tekrar kabından birindeki sıfır alg konsantrasyonun sebebi, doğru bir şekilde inoküle edilmemiş ya da düzgün bir şekilde temizlenmemiş kap olabilir). Ana hat düzenleyicisi olarak veri noktasının red nedenleri test raporunda açık bir şekilde belirtilmelidir. Kabul edilen nedenler sadece (ender) prosedürel hatalardır ve kötü hassasiyet değildir. Ana hat düzenleyicisinin belirlenmesinde kullanılan istatistiksel prosedürler bu tip problemlerde kısıtlı olarak işe yarar ve uzman değerlendirmesinin yerini alamaz. Verinin grafiksel veya tablo olarak sunulduğu durumlarda ana hat düzenleyicilerinin de veri noktaları arasında (anahat düzenleyicisi olarak işaretlenmiş biçimde)gösterilmesi tercih edilir.
Testin amacı alg büyümesindeki etkileri belirlemektir. Bu Test Yöntemi, iki farklı tepki değişkenini tanımlar. Ülkemizde kabul edilebilir sonuçlar için, etkiler yukarıda tanımlanan (a) ve (b) tepki değişkenleri kullanarak değerlendirilir.
Bu test yönteminin uygulanması için, sonuçların hesaplanması, yukarıda belirtilen nedenlerden dolayı ortalama büyüme hızına dayandırılmalıdır. Bu iki tepki değişkenini kullanarak hesaplanan toksisite değerlerinin mukayese edilebilir olmadığı ve test sonuçları kullanıldığında bu farklılığın kabul edilmesi gerektiğine dikkat edilmelidir. Bu test yöntemindeki test koşullarına bağlı kalındığında, ortalama büyüme hızı üzerine dayalı olan ECx değerleri, genel olarak verim (EyCx) üzerine dayalı sonuçlardan daha yüksek olacaktır. Bunun sebebi söz konusu yaklaşımlarda kullanılan matematiksel temeldir. Bundan dolayı, sadece matematiksel olarak farklı olan değerlerde iki tepki değişkeni arasında hassasiyet yönünden farklılık olduğu şeklinde yorumlanmamalıdır. Ortalama büyüme hızı kavramı, toksisitenin, büyüme hızına etkisine dayanarak tahmin edildiği ve kontrol grubunun tam belirli büyüme hızı veya konsantrasyon-tepki eğrisinin eğimi veya test süresinden bağımsız olduğu sınırlanmamış kültürlerdeki alglerin genel üssel büyüme biçimine dayanır. Bunun tam tersi olarak, verim tepki değişkenine bağlı olan sonuçlar diğer değişkenlerin tümüne bağlıdır. EyCx, testlerde kullanılan alg türlerine özgü büyüme hızına ve türler arası ve hatta farklı alg suşları arasında değişiklik gösterebilen maksimum spesifik büyüme hızına bağlıdır. Bu tepki değişkeni, alg türleri ya da farklı alg suşlarının toksik maddeye olan hassasiyetlerini karşılaştırmak için kullanılmamalıdır. Toksisite tahmini için ortalama büyüme hızı kullanımı bilimsel olarak tercih edilirken, bazı mevzuat gereklerini yerine getirmek amacıyla verime dayalı toksisite tahmini de bu Test Yöntemine dahil edilmiştir.
Belirli bir süre için ortalama büyüme hızı, kontrol ve doz gruplarının her tek kabı için denklemden biyokütledeki logaritmik artış olarak hesaplanır:  Burada,
Her doz ve kontrol grubu için, varyans tahminleri ile birlikte büyüme hızı için ortalama değer hesaplanır. Başlangıç değeri olarak, ölçülmüş değerden ziyade nominal olarak inoküle edilmiş biyokütle değerini kullanarak bütün test süresi (normal olarak 0-3 gün) üzerinde ortalama büyüme hızını hesaplanır çünkü bu yolla çok daha hassas sonuçlar elde edilecektir. Biyokütle ölçümü için kullanılan ekipman(örneğin, akışlı hücre ölçer), düşük aşı biyokütleyi yeterli hassasiyet derecesinde tespit edebilirse başlangıç biyokütle konsantrasyonu kullanılabilir. Test süresince gün başına (0-1, 1-2 ve 2-3 gün) belirli büyüme hızı olarak hesaplanan bölüm büyüme hızı değerlendirilir ve kontrolün büyüme hızının sabit kalıp kalmadığı incelenir (bakınız geçerlilik kriteri, bölüm 1.7). Birinci günün belirli büyüme hızının toplamdaki ortalama büyüme hızından belirgin bir şekilde düşük olması, gecikme evresine işaret edebilir. Kontrol kültürlerinde gecikme evresi, ön-kültürün uygun üretimi ile azaltılabilir ve neredeyse tamamen yok edilebilirken, maruz bırakılan kültürlerde ilk maruz kalmadan sonra gerçekleşen gecikme evresinin sebebi, ilk toksik stresin aşılması veya test maddesinin kaybına bağlı (alg biyokütlesi üzerine emilim dahil) daha kısa süreli maruz kalma olabilir. Bundan dolayı, test maddesinin maruz kalma süresi boyunca yaptığı etkileri değerlendirmek için bölüm büyüme hızına bakılabilir. Bölüm büyüme hızı ile ortalama büyüme hızı arasındaki belirgin farklar sabit logaritmik büyümeden sapmaya işaret eder ve büyüme eğrilerinin daha dikkatli incelenmesini gerektirir. Her doz tekrarı için büyüme hızı yavaşlatma yüzdesi aşağıdaki denklemden hesaplanır:  Burada:
Test çözeltilerini hazırlamak için çözücü kullanılırsa, yüzde yavaşlatma hesaplanırken, çözücüiçermeyen kontrollerden ziyade çözücü içeren kontroller kullanılmalıdır.
Verim, kontrol ve dozların her kabı için test bitimindeki biyokütleden başlangıç biyokütlesi çıkartılarak hesaplanır. Her test konsantrasyonu ve kontrolü için, varyans tahminler ile birlikte verim için ortalama değer hesaplanır. Verimdeki (%Iy) yavaşlama yüzdesi, her doz tekrarı için aşağıdaki gibi hesaplanır: 
Burada:
Test maddesi konsantrasyonunun logaritmasına karşı yavaşlama yüzdesi çizilir ve noktalar dikkatlice incelenir, ilk aşamada harici olarak belirlenen bütün veri noktaları göz ardı edilir. Konsantrasyon tepki ilişkisinin ilk izlenimini elde etmek için göz ya da bilgisayar çıkarımı yoluyla veri noktaları boyunca düz bir hat uydurulur daha sonra tercihen bilgisayarlı istatistik yöntemi gibi daha detaylı bir yöntem ile devam edilir. Veri analiz araçlarının kullanılabilirliğine, planlanan veri kullanımına, veri kalitesine (tamlık) ve miktarına bağlı olarak (ve bazen iyi gerekçelendirilerek) bu etapta veri analizini durdurmaya karar verilebilir ve elde edilen eğriden anahtar değerler olan EC50 ve EC10 (ve/veya EC20) okunur (uyarıcı (stimulator) etkiler ile ilgili bölüme bakınız.). İstatistiksel yöntem kullanmamak için geçerli nedenler şunları içerebilir: — Bilgisayarlı yöntemlerle elde edilen sonuçlar bazen güvenilir olmayabilir, bu gibi durumlarda uzman görüşü alınır — mevcut bilgisayar programlarının uyarıcı büyüme tepkilerini kullanmak için yeterli olmaması (aşağı bakınız).
Amaç, bağlanım (regresyon) analiziyle sayısal konsantrasyon–tepki ilişkisi elde etmektir. Tepki verisini doğrusallaştırarak probit, logit veya Weibull gibi birimlereçevirdikten sonra ağırlıklıdoğrusal bağlanım kullanmak mümkündür fakat doğrusal olmayan regresyon prosedürleri tercih edilir çünkü bu prosedürler,verilerde mutlaka ortaya çıkacak düzensizlikleri ve düzgün dağılımdan sapmaları daha iyi yönetirler. Sıfır ya da tam yavaşlamaya yaklaşıldığı durumlarda, bu gibi düzensizlikler, çevrim ile oldukça büyüyerek, yapılan analizi karıştırırlar(9). Probit, logit ya da Weibull çevrimleri kullanan standart analiz yöntemlerinin var-yok verisi (ör. ölüm ya da canlı kalma) kullanımı için ayırıldığına ve büyüme veya biyokütle verisini temin etmek için değiştirilmesi gerektiğine dikkat edilmelidir. Devamlı veriden ECx değerlerinin tayini için belirli prosedürler (10), (11) ve (12)’de bulunabilir. Doğrusal olmayan bağlanım analizi kullanımı, Ek-IV içerisinde detaylı bir şekilde gösterilmektedir. Analiz edilecek olan her tepki değişkeni için, ECx değerlerinin nokta tahminini yapmak amacıyla konsantrasyon-tepki ilişkisi kullanılır. Mümkün olduğunda her tahmin için %95 güvensınırı belirlenmelidir. Tepki verisinin bağlanım modeline uygunluğu, grafiksel veya istatistiksel olarak değerlendirilmelidir. Bağlanım analizinde, doz gruplarının ortalaması kullanılmaz; bunun yerine, her bir tekrardaki tepkiler kullanılarak yürütülür. Bununla birlikte, eğer veri içinde dağılım çok büyük olduğundan dolayı doğrusal olmayan eğriçizimi zor olur ya da başarısız olur ise şüpheli harici veri noktalarının etkisini azaltmanın pratik yolu olarak grup ortalamalarında bağlanım yürütülerek problem aşılabilir. Bu şekilde kullanım tercih edilirse, normal prosedürden bir sapma olarak test raporunda belirtilmelidir çünkü tekrar verilerinden çizilen eğri iyi sonuçlar vermez. Mevcut bağlanım modelleri, veri için uygun değil ise EC50 tahminleri ve güven sınırları, ön yükleme ile doğrusal içdeğerbiçim kullanarak elde edilebilir (13). LOEC ve dolayısıyla NOEC’i tahmin etmek ve test maddesinin büyüme hızı üzerine etkilerini bulmak için varyans (ANOVA) teknikleri analizini kullanarak doz ortalamalarını karşılaştırmak gerekir. Daha sonra her konsantrasyonun ortalaması, uygun olan çoklu karşılaştırma ya da eğilim (trend) test yöntemi kullanarak kontrol ortalaması ile karşılaştırılmalıdır. Dunnett ya da Williams testleri kullanışlı olabilir (14)(15)(16)(17)(18). Varyans homojenliğinin ANOVA varsayımının devam edip etmediğini değerlendirmek gereklidir. Bu değerlendirme, grafiksel olarak ya da geçerli bir test ile yapılabilir (18). Uygun testler Levene ya da Barlett’dir. Varyans homojenliği varsayımını sağlamakta başarılı olunamadığı durumlarda bazen logaritmik veri dönüşümü işe yarayabilir. Eğer varyansheterojenliği çok büyük ve dönüşüm ile düzeltilemiyor ise düşüren Jonkheeretrend testi gibi yöntemler ile analiz belirlenmelidir. NOEC’in belirlenmesi üzerine ek kılavuz, (12) içerisinde bulunabilir. Bilimdeki yeni gelişmeler, NOEC kavramından vazgeçmeyi ve yerine bağlanıma dayalı nokta tahmini ECx’i kullanmayı tavsiye etmektedir. Bu alg testi kapsamında, x için uygun bir değer belirlenmemiştir. %10 ile %20 aralığında bir değer uygun olabilir (seçilen tepki değişkenine bağlı olarak) ve hem EC10’un hem de EC20’nin raporlanması tercih edilir.
Düşük konsantrasyonlarda, bazen, büyümenin uyarılması (negatif inhibisyon) gözlemlenebilir. Bu durum, hormesisden (toksik uyarı) ya da kullanılan minimal ortama test materyalleri ile uyarıcı büyüme faktörlerinin eklenmesinden kaynaklanabilir. İnorganik besinlerin eklenmesinin doğrudan herhangi bir etkisi bulunmaz çünkü test ortamındaki besin fazlalığı, test süresince muhafaza edilmelidir. Düşük dozlardaki uyarı miktarı, çok büyük olmadığı sürece, genellikle EC50 hesaplamalarında görmezden gelinir. Bununla birlikte uyarı çok büyükse veya ECx değeri düşük x için hesaplanacaksa özel prosedürler gerekebilir. Mümkünse veri analizinden uyarıcı tepkilerin çıkarılmasından kaçınılmalıdır ve eğer mevcut eğrinin çizimi yazılımı küçük uyarı kabul edemiyor ise ön yükleme ile doğrusal iç değer biçim kullanılabilir. Eğer çok büyükse, hormesis modeli kullanımı kabul edilebilir (19).
Işık absorbe eden test materyalleri, büyüme hızının fazlaca azalmasına sebep olabilir çünkü gölgelendirme, uygun ışık miktarını azaltır. Bu tür fiziksel etki çeşitleri, test koşullarının değiştirilmesinden kaynaklanan toksik etkilerden ayrı tutulmalı ve ayrı rapor edilmelidir. Kılavuz, (2) ve (3) içinde bulunabilir.
Test raporu aşağıdakileri içermelidir: Test Maddesi:
Test suşları:
Test koşulları:
Sonuçlar:
(1) OECD TG 201 (2006). Freshwater Alga andCyanobacteria, GrowthInhibition Test. (2)ISO 1998: Waterquality — Guidance for algal growth inhibition tests with poorly solublematerials, volatile compounds, metals and wasterwater. ISO/DIS 14442. (3) OECD 2000: GuidanceDocument on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. (4) ISO 1998: Water quality — Sampling — Part 16: General Guidance for Biotesting. ISO 5667-16. (5) ISO 1993: Wate rquality — Algal growth inhibition test. ISO 8692. (6) Mayer, P.,Cuhel, R. andNyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibitiontests. WaterResearch 31: 2525-2531. (7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology&Oceanography 22,5 (1977), pp.919-925. (8) Simpson, S.L.,Roland, M.G.E., Stauber, J.L. andBatley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay end points. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073-2079. (9) Christensen, E.R.,Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718. (10) Nyholm, N. Sørensen, P.S.,Kusk, K.O. andChristensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167. (11) Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485-1494. (12) OECD. (2004). GuidanceDocument on Statistical Analysis of Ecotoxicity Data. (13) Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronictoxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN. (14) Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J.Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121 (15) Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491. (16) Williams, D.A. (1971). A test fordifferencesbetweentreatment means when several dose levels are comparedwith a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. (17) Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics28:510-531. (18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York. (19) Brain P. AndCousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at lowdoses. WeedResearch, 29, 93-96. Ek-I Test için uygun olduğu gösterilmiş suşlar Yeşil Alg — Pseudokirchneriella subcapitata, (önceden Selenastrum capricornutum olarak bilinen), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG — Desmodesmus subspicatus (önceden Scenedesmus subspicatus olarak bilinen)86.81 SAG
— Naviculapelliculosa, UTEX 664 Siyanobakteri — Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A — Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1
10801 UniversityBoulevard Manassas, Virginia 20110-2209 UNITED STATES CCAP, Culture Collection of AlgaeandProtozoa Institute of FreshwaterEcology, WindermereLaboratory Far Sawrey, Amblerside Cumbria LA22 0LP
UNITED KINGDOM SAG: Collection of AlgalCultures Inst. PlantPhysiology University of Göttingen NicholausbergerWeg 18 3400 Göttingen GERMANY
Section of Molecular, Cellular andDevelopmentalBiology School of BiologicalSciences TheUniversity of Texas at Austin Austin, Texas 78712 USA
Yüklə 5,29 Mb. Dostları ilə paylaş:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||