FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

C.8 TOPRAK SOLUCANLARININ TOKSİSİTESİ

YAPAY TOPRAK TESTİ

1. 
   YÖNTEM
   

1. 
   Giriş
   

Bu laboratuvar testinde test maddesi, solucanların 14 gün boyunca yerleştirildiği yapay bir toprağa eklenir. Bu süre sonunda (tercihen 7 gün sonra) maddenin toprak solucanları üzerine ölümcül etkisi araştırılır. Bu test kimyasalların toprak solucanları üzerine deriden ve beslenme yoluyla görece kısa dönemli ölümcül etkilerinin izlenmesini sağlar.

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

LC_5o = Test süresince test hayvanlarının %50’sini öldüren madde derişimi

3. 
   Referans maddeler
   

Test sisteminin hassasiyetinin kayda değer olarak değişmediğini göstermek için periyodik olarak bir referans maddesi kullanılır.

Analitik saflıkta kloroasetamid referans maddesi olarak önerilir.

4. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Toprak değişken bir ortamdır bu yüzden bu testte dikkatlice tanımlanmış yapay verimli toprak kullanılır. Eisena foetida türünün (bkz EK-I) yetişkin türleri farklı derişimlerde test maddesi ile muamele edilmiş yapay toprakta saklanır. Kapların (konteyner) içeriği bir tabla içine testin başlangıcından sonra 14 gün yayılır (yada isteğe bağlı 7 gün) ve her bir derişimde hayatta kalan toprak solucanları sayılır.

5. 
   Kalite kriterleri
   

Test, test katmanı (substrat) ve organizmaya göre mümkün olduğu kadar tekrarlanabilir olacak şekilde tasarlanmıştır. Kontrol grubundaki ölüm oranı %10’u geçmemelidir; aksi takdirde test geçersizdir.

6. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

1. 
   Malzemeler
   

2. 
   Test katmanı (substratı)
   

Tanımlanmış yapay toprak temel test substratı olarak kullanılır.

(a) Temel substrat (yüzdeler kuru ağırlık cinsinden)

-10% Spahgnum yosunu turbası ( pH 5,5 ‘ten 6,0’a mümkün olduğu kadar yakın ve gözle görünür bitki kalıntısı kalmamış ve iyi öğütülmüş)

-Tercihen %50’den fazla kaolinit içeren %20 kaolinit kili
-Yaklaşık %69 endüstriyel kuartz kumu (taneciklerinin %50’sinin büyüklüğü 0,05 ve 0,2 mm olan ince kumca zengin). Eğer madde suda yeterince dağıtılamıyorsa, test kabı başına 10 g madde test maddesiyle sonra karıştırılmak üzere hazır olmalıdır.
-pH’ı 6,0 ± 0,5’e ayarlamak için kimyasal saflıkta ve toz halinde yaklaşık %1 kalsiyum karbonat (CaCO₃ ) eklenir.
(b) Test katmanı (substratı)
Test substratı, temel substrat, test maddesi ve deiyonize su içerir. Temel substratın su içeriği kuru ağırlığın %25 ila %42’si arasındadır. Substratın su içeriği 105 ºC sıcaklıkta örnek sabit ağırlığa gelene kadar ısıtılarak belirlenir. Burada anahtar ölçüt yapay toprağı üzerine su çıkmayacak noktaya kadar ıslatılmasıdır. Test maddesinin substrat üzerine düzgün dağıtılması ve iyi bir karışım sağlanmasına dikkat edilmelidir. Test maddesi substrat üzerine hangi yolla dağıtıldığı belirtilmelidir.
(c) Kontrol substratı
Kontrol substratı, temel substrat ve su içerir. Eğer katkı bir ajan kullanılırsa, ilave bir kontrol aynı miktar katkı ajanı içermelidir.

1. Test kapları

1 litre kapasiteli (plastik kapak, saat camı yada havalandırma boşluklu plastik filmle sıkıca kapatılmış) substratın 500 gram kuru ağırlığına eşdeğer ıslak, test yada kontrol substratı ile doldurulmuş cam kaplar.

3. 
   Test koşulları
   

Test kapları sürekli ışık alan, 20 ± 2 ºC sıcaklıktaki iklimlendirilmiş bölmelerde tutulmalıdır. Işık şiddeti 400-800 lux olmalıdır.

Test süresi 14 gündür ama isteğe bağlı olarak ölüm oranı testin başlangıcından 7 gün sonra değerlendirilebilir.

4. 
   Test işlemi
   

Test derişimleri

Test maddesinin derişimleri maddenin ağırlığının temel substratın kuru ağırlığına oranı (mg/kg) olarak ifade edilir.
Aralık bulma testi
Kesin testte kullanmak üzere derişimlerin aralığı hakkında bilgi edinmek için %0’dan %100 ölüme yol açan derişimlerin aralığı aralık bulma testi ile belirlenebilir.
Test maddesi şu derişimlerde test edilmelidir:

1000; 100; 10; 1; 0,1 mg madde/kg test substratı (kuru ağırlık)

Kesin bir test yürütülecekse, aralık bulma testi için 10 solucan içeren derişim başına bir test serisi ve bir seri işleme tabi tutulmuş kontrol yeterli olabilir.

Kesin test

Aralık bulma testinin sonuçları %0 - %100 aralığını kapsayan ve farkları 1,8’i aşmayan sabit faktör ile değişen geometrik serideki en az 5 derişimi bulmak için kullanılır.
Bu serideki derişimleri kullanan testler LC₅₀ değerine ve bu değerin güven aralığının mümkün olduğu kadar kesin belirlenmesine izin vermelidir.

Kesin testte her birisi 10 solucan içeren her derişim için en azından 4 test serisi ve 4 muamele edilmemiş kontrol serisi kullanılır. Tekrar serilerinin sonuçları ortalama ve standard sapma olarak verilir.

1,8 oranındaki 2 ardışık derişim %0 ve %100 ölüm oranı verdiğinde, bu iki derişim LC₅₀ ‘nin düştüğü derişim aralığını belirtmede yeterlidir.
Temel test substratı ve temel test maddesi karışımı
Test substratı mümkün olan her durumda su dışında başka katkı maddeleri eklenmeden hazırlanmalıdır. Testin başlangıcından hemen önce test maddesinin deiyonize sudaki yada başka bir çözücüdeki emülsiyon yada dispersiyonu temel test substratı ile karıştırılır yada kromatografik yada benzer bir dağıtıcı ile düzgün bir şekilde dağıtılır.

Eğer suda çözünmezse, uygun bir çözücünün (örn. hekzan, aseton, kloroform) çok az bir hacminde çözünür.

Test maddesini çözmek, emülsiyon yada süspansiyon haline getirmek için yalnızca kolay uçabilen ajanlar kullanılır. Test substratı kullanım öncesi havalandırılmalıdır. Buharlaşan su miktarı tekrar eklenmelidir. Kontrol grubu aynı miktarda katkı maddesi içermelidir.
Test maddesi organik çözücülerde çözünür değil ve dispersiyon yada emülsiyonu da hazırlanamıyorsa 10 g ince kuartz kum ve 500 gram kuru ağırlıkta yapay toprağı muamele etmeye yetecek test maddesi test substratının 490 g kuru ağırlığı ile karıştırılır.
Her bir test serisi için, 500 g kuru ağırlığa eşdeğer miktarda ıslak test substratı, 24 saat ıslak temel substrata benzer substratta şartlandırılmış olan ve 10 toprak solucanı her bir cam kaba konulur, hızlıca yıkanır, fazla su süzgeç kağıdı ile absorbe edilir ve test substratının yüzeyine konulur.
Kaplar substratın kurumasını engellemek için delikli plastik tıpalar, saat camı yada film ile kapatılır ve 14 gün boyunca test şartlarında tutulur.
Değerlendirmeler test kurulduktan 14 gün (isteğe bağlı 7 gün) sonra yapılmalıdır. Test substratı camdan ya da paslanmaz çelikten yapılmış bir tabağa yayılır. Toprak solucanları incelenir ve canlı kalan toprak solucanlarının sayısı belirlenir. Toprak solucanları ön uçlarına uygulanan hafif mekanik bir uyartıya cevap vermiyorlarsa ölü kabul edilirler.

İnceleme 7 gün yürütüldükten sonra, kap substratla yeniden doldurulur ve canlı kalan toprak solucanları aynı test substratı yüzeyine yeniden konulur.

5. 
   Test organizmaları
   

Test organizmaları yetişkin, kuru ağırlığı 300 ila 600 mg olan Eisenia foetida (ekteki nota bakınız) (slitellumla en az 2 aylık) olmalıdır ( Yetiştirme metodu için eke bakınız).

2. 
   VERİLER
   

1. 
   Sonuçların işlenmesi ve değerlendirilmesi
   

Test edilen maddenin konsantrasyonları ölü toprak solucanlarının yüzdesine ilişkin olarak rapor edilir.

Veriler uygun ise LC_5o değeri ve güven aralığı (p=0,05) standard yöntem kullanılarak belirlenmelidir (Litchfield and Wilcoxon, 1949, eşdeğer metod için). LC_5o test substratının (yaş ağırlık) kilogram başına düşen mg cinsinden test maddesi olarak verilmelidir.
Derişim eğrisinin eğimi LC_5o değerinin hesaplanmasına olanak vermeyecek kadar çok dik olduğu durumlarda bu değerin grafikten tahmin edilmesi yeterlidir.
1,8 oranındaki 2 ardışık derişim sadece %0 ve %100 ölüm oranı verdiğinde, bu iki derişim LC₅₀ ‘nin düştüğü derişim aralığını belirtmede yeterlidir.

3. 
   RAPORLAMA
   

1. 
   Test raporu
   

• 
  test raporu, eğer mümkünse, aşağıdakileri içermelidir.
  
• 
  testin yukarıda belirtilen kalite ölçütlerine uygun yürütüldüğünün açıklaması
  
• 
  yürütülen test (aralık bulma testi ve/veya kesin test)
  
• 
  test koşullarının ayrıntılı açıklaması yada testin metotla uyumlu olduğunun açıklaması (Sapmalar varsa belirtilmelidir.)
  
• 
  test organizmaları hakkında bilgi (tür, yaş, ortalama ve ağırlık aralığı, saklama ve yetiştirme koşulları, tedarik edici)
  
• 
  test maddesinin, temel test substratı ile nasıl karıştırıldığının ayrıntılı açıklaması.
  
• 
  LC50 ‘nin belirlenmesinde kullanılan yöntem
  
• 
  kullanılan bütün verileri içeren test sonuçları
  
• 
  test organizmalarında gözlenen belirtiler (semptomlar) ve değişimlerin açıklaması
  
• 
  LC50 yada ölüm oluşturmayan en yüksek test derişimi ve test başlatıldıktan 14 gün (isteğe bağlı 7 gün) içinde %100 ölüm oluşturan en düşük test derişimi
  
• 
  konsantrasyon-cevap eğrisinin çizilmesi
  
• 
  referans maddeleri ile elde edilen ve mevcut test ile ilgili yada önceki kalite kontrol denemeleri ile uyumlu olan test sonuçları
  

4. 
   KAYNAKLAR
   

1. 
   OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of the Council C(81)30 final.
   
2. 
   Edwards, C. A. and lofty, ]. R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and Hall, London, 331 pp.
   
3. 
   Bouche. M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Systematique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 pp.
   
4. 
   Litchfield, J. T. andWilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. I. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.
   
5. 
   Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.
   
6. 
   Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag "Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden', in: Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
   

Ek-I
Testten Önce Toprak Solucanlarının Saklanması ve Yetiştirilmesi
Hayvanların yetiştirilmesi için 30 ila 50 toprak solucanı taze substrat ile besleme kabına konulur ve 14 gün sonra çıkarılır. Bu hayvanlar daha ilerideki yetiştirme serilerinde kullanılabilir. Toprak solucanları kozalarından çıkarılır ve olgunlaştıklarında test için kullanılırlar (Önceden belirlenmiş şartlarda 2 ve 3 ay sonra).
Saklama ve Yetiştirme koşulları
İklim bölmesi : Sıcaklık 20 ± 2 ºC ve tercihen 400 ila 800 lux ışık şiddetinde sürekli ışıkta

Yetiştirme kutuları: Uygun derin olmayan 10 ila 20 L hacminde

Substrat: Eisenia foetida çeşitli hayvan dışkılarında yetiştirilebilirler. %50 turba ve %50 inek yada at gübresinde oluşan Yetiştirme ortamının kullanımı önerilir. Ortamın pH değeri yaklaşık 6-7 (kalsiyum karbonat ile ayarlanmış) ve düşük iyonik iletkenlikte( 6 mmhos’tan az veya %0.5 tuz derişiminde). Substrat nemli olmalı fakat fazla ıslak olmamalıdır. Ayrıca, diğer başarılı yöntemlerde kullanılabilir.

Not: Eisenia foetida bazı taksonomların türlere ayırdığı 2 ırktan oluşur. Bu türler morfolojik olarak benzerdir ancak birisi Eisenia foetida foetida segmentleri üzerinde tipik çaprazlama çizgilere sahiptir diğerinde Eisenia foetida andrei bunlar yoktur ve bu değişik tonlarda kırmızımsı renktedir. Mümkünse Eisenia foetida andrei kullanılmalıdır. Diğer türler gerekli olan metodoloji mevcutsa kullanılabilir.

C.9 BİYOLOJİK BOZUNMA

ZAHN-WELLENS TESTİ

1. 
   YÖNTEM
   

1. 
   Giriş
   

Bu yöntemin amacı statik bir testte yüksek derişimde mikroorganizmalara maruz kaldığında suda çözünür uçucu olmayan organik maddelerin potansiyel nihai biyolojik bozunurluklarını hesaplamaktır.

Askıda katılara fizikokimyasal adsorpsiyon gerçekleşebilir ve bu sonuçların yorumlanmasında dikkate alınmalıdır.(Bakınız 3.2)
Çalışılan maddeler 50 ila 400 mg/litre DOC (Çözünmüş organik karbon )değer aralığında ya da 100 ila 1000 mg/litre COD (Çözünmüş oksijen ihtiyacı) değer aralığında derişiminde kullanılır. Bu görece yüksek derişimler analitik güvenilirliğe sahiptir. Toksik özellikteki bileşikler bozunma sürecini geciktirebilir yada tamamıyla durdurabilir.

Bu yöntemde, çözünmüş organik karbondaki derişimin ölçüsü yada kimyasal oksijen ihtiyacı test maddesinin nihai biyolojik bozunurluğunu belirlemek için kullanılabilir.

Özgün bir analitik yöntemin eş zamanlı kullanımı maddenin birincil biyolojik bozunurluğunun belirlenmesini sağlayabilir ( Ana kimyasal yapının yok olması ile).
Bu yöntem, testte kullanılan derişimde:
- test koşullarında suda çözünebilir olan,

- test şartlarında buhar basıncı ihmal edilebilen

- bakterilere inhibitör olmayan

- test sistemi tarafından yalnızca sınırlı miktarda adsorbe edilebilen

- test çözeltisinden köpürmeyle yok olmayan organik maddelere uygulanabilirdir.
Elde edilen sonuçların yorumlanmasında test maddesindeki temel bileşenlerinin bağıl oranlarının özellikle sonuçların düşük yada marjinal olduğu hallerde bilinmesi yararlı olabilir.

Uygun test koşullarının seçilmesinde ve düşük sonuçların yorumlanmasında maddenin mikroorganizmalara karşı olan toksisitesi hakkında bilgi gereklidir.

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

Testin sonunda elde edilen bozunma ”Zahn-Wellens testindeki biyolojik bozunurluk” olarak rapor edilir. Bu değer aşağıdaki eşitlik ile verilir:

burada:

D_T= T anında % biyolojik bozunma

C_A=Testin başlangıcından 3 saat sonra karışımda ölçülen DOC (yada COD) değeri (mg/L)

C_T= Örnekleme anında test karışımındaki DOC yada COD değeri (mg/L)

C_B= Kör numunenin örnekleme anındaki DOC yada COD değeri (mg/L)

C_BA= Testin başlangıcından 3 saat sonra kör çözeltide ölçülen DOC (yada COD) değeri (mg/L)
Bozunmanın derecesi en yakın yüzde değere yuvarlanır.
Bozunmanın yüzde derecesi test edilen maddenin DOC (yada COD) olarak uzaklaştırılma yüzdesi belirtilir.
Maddenin 3 saat sonra ölçülen değeri ve hesaplanan yada tercihen ölçülen ilk değeri arasındaki fark maddenin yok edilmesi hakkında faydalı bilgi sağlayabilir ( Bkz 3.2 sonuçların yorumlanması)

3. 
   Referans maddeler
   

Yeni bir madde araştırılırken, referans maddelerinin kullanımı yararlı olabilir ancak henüz özgün bir referans maddesi önerilemeyebilir.

4. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Aktif çamur, mineral besinler ve sulu bir çözeltideki kaynaktaki başlıca karbon kaynağı olarak test maddesi, karıştırıcı ve havalandırıcı üniteleri bulunan 1 ila 4 litrelik bir cam kaba birlikte konulur. Karışım 20 ila 25 C sıcaklıkta, çok az ışıkla aydınlanan bir ortamda yada karanlık bir odada 28 gün boyunca havalandırılır ve karıştırılır. Bozunma süreci süzülmüş çözeltide günlük yada başka uygun zaman aralıklarında DOC yada COD değerleri belirlenerek izlenir. Her bir zaman aralığındaki giderilen DOC’nin (yada COD) başlangıçtan üç saat sonraki değere oranı yüzde biyolojik bozunma olarak ifade edilir ve bu değer o andaki bozunma miktarı olarak değerlendirilir.Bu sonuç zamana karşı biyolojik bozunurluk eğrisi oluşturmak için grafiğe geçirilir.

Özgül bir analitik yöntem kullanıldığında, ana molekülün derişiminde biyolojik bozunurluğa bağlı olan azalma ölçülebilir (birincil biyolojik bozunurluk).

5. 
   Kalite kriterleri
   

Bu testin tekrarlanabilirliği, halka testinde tatminkâr olduğu kanıtlanmıştır.

Testin duyarlılığı çoğunlukla kör çözeltinin değişkenliğine bağlıdır ve az oranda da sıvıdaki test maddesi seviyesine ve çözünmüş organik maddenin tayininin doğruluğuna bağlıdır.

6. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

1. 
   Hazırlıklar
   

1. 
   Reaktifler (tepkenler)
   

Test suyu: Organik karbon içeriği <5 mg/litre olan içme suyudur. Kalsiyum ve magnezyum iyonlarının toplam miktarı 2.7 mmol/litreyi geçmemelidir aksi durumda deiyonize su yada damıtık suyla uygun bir seyreltme gereklidir.

Sülfürik asit, analitik saflıkta (A.R.): 50 g/l.

Sodyum hidroksit çözeltisi A.R.: 40 g/l.

Mineral besin çözelitisi: 1 L deiyonize suda çözünür.

Amonyum klorür, NH₄Cl, A.R.: 38,5 g,

sodyum dihidrojenfosfat, NaH₂PO₄.2H₂O, A.R.: 33,4 g,

potasyum dihidrojenfosfat, KH₂PO₄, A.R.: 8,5 g,

di-potasyum mono-hidrojenfosfat, K₂HPO₄,A.R.: 21,75 g.
Karışım hem tampon hem de besin sistemi olarak görev alır.

2. 
   Düzenek
   

1 ile 4 litre hacimde cam kaplar (silindirik kaplar).

Cam yada metal karıştırıcının uygun bir şaft üzerinde döndüğü karıştırıcı ( karıştırıcı kabın tabanından 5 ila 10 cm yüksekte dönmelidir.) 7 ila 10 cm uzunluğunda bir manyetik karıştırıcı da kullanılabilir.
Hava vermek için 2 ila 4 mm iç çapında cam tüp. Tüpün ağzı kabın tabanından 1 cm yüksekte olmalıdır.
Santrifüj (3550 g)
pH-metre
Çözünmüş oksijen ölçer
Süzgeç veya filtre kağıtları
Membran süzme düzeneği
Gözenek büyüklüğü 0,45 mikron olan membran süzgeçler. Membran süzgeçleri süzme aşamasında ne karbonu salacak ne de maddeyi adsorplayacak şekilde olmalıdır.
Organik karbon içeriğini ve kimyasal oksijen ihtiyacını belirlemek için uygun analitik cihazlar.

3. 
   Aşının hazırlanması
   

Biyolojik işleme tesisinden alınan aktif çamur santrifüjlenerek yada test suyuyla çöktürerek yıkanır.(tekrar tekrar)

Aktif çamur uygun bir koşulda olmalıdır. Bu tür bir çamur düzgün çalışan bir atıksu arıtma tesisinden alınabilir. Mümkün olduğu kadar değişik tür ve ırkta bakteri elde etmek için, değişik kaynaklardan aşıları karıştırmak tercih edilebilir (örneğin değişik arıtma tesisleri, toprak ekstraktları, nehir suları). Bu karışım yukarıda anlatıldığı şekilde muamele edilir.
Aktif çamurun aktivitesini kontrol etmek için aşağıda açıklanan fonksiyonel kontrol kısmına bakınız.

4. 
   Test çözeltilerinin hazırlanması
   

Test kabına 500 ml test suyu, 2.5 mg/L mineral besin çözeltisi ve son karışımda 0,2 ila 1,0 g/L kuru maddeye karşılık gelecek aktif çamur eklenir. Son karışımda DOC derişimi 50 ila 400 mg/litre olacak şekilde maddenin stok çözeltisi eklenir. Karşılık gelen COD değerleri 100 ila 1000 mg/litredir. Test suyunun hacmi 1 ila 4 litreye tamamlanır. Toplam hacim miktarı alınan DOC ve COD belirlenmesindeki örnek sayısına ve analitik işlem için gerekli olan hacme göre seçilir.

Normal olarak 2 litre yeterlidir. En azında bir kontrol kabı (kör)test serileri ile paralel olacak şekilde yürütülür. Bu kontrol kabı sadece aktif çamur, test suyuyla hazırlanan besin minerali çözeltisi içerir ve toplam hacmi testtekilerin toplam hacmi ile aynıdır.

2. 
   Testin performansı
   

Test kapları manyetik bir karıştırıcı ile veya pervaneli karıştırıcılarla çok az ışıkta yada karanlık bir odada 20 ila 25 ^oC sıcaklıkta karıştırılır. Havalandırma pamuk yünü filtresi ile temizlenen sıkıştırılmış hava ile ve gerektiğinde yıkama şişesi ile sağlanır. Çamurun çökmemesine ve oksijen derişiminin 2 mg/litrenin altına düşmemesine dikkat edilmelidir.

pH değeri belli aralıklarla kontrol edilmelidir ve gerektiğinde pH 7 ile 8 aralığında ayarlanmalıdır.
Her bir örnekleme öncesi buharlaşma dolayısıyla olan kayıplar gerekli miktarlarda deiyonize yada damıtık su eklenerek telafi edilir.
Bunun için iyi bir yol teste başlamadan önce kaptaki sıvı seviyesini işaretlemektir. Her bir örnekleme zamanında yeni işaretler konulur (havalandırmalı karıştırma olmadan) ilk örnekler test maddesinin aktif çamur tarafından adsorpsiyonunu belirlemek için her zaman testin başlangıcından 3 saat sonra alınır.
Test maddesinin giderimi günlük yada diğer düzenli bir zaman aralığında DOC veya COD’nin belirlenmesi ile izlenir. Test kabından ve kör çözeltiden alınan örnekler yıkanmış bir süzgeç kâğıdından dikkatlice süzülür. Süzülmüş çözeltinin ilk 5ml’lik kısmı atılır. Süzülmesi zor olan çamurlar önce 10 dak. santrifüj edilerek uzaklaştırılabilir. DOC ve COD tespiti en azında iki örnekle yapılır. Test 28 gün sürdürülür.
Not: Bulanık kalan örnekler membran süzgeçler ile süzülür. Membran süzgeçleri organik madde salmamalı veya adsorplamamalıdır.
Aktif çamurun fonksiyonel kontrolü
Bilinen bir madde içeren bir kap, aktif çamurun fonsiyonel kapasitesini kontrol etmek için test serileri ile paralel bir şekilde yürütülür. Dietilen glikol bu amaç için uygun bulunmuştur.
Adaptasyon (Alışma)
Eğer analizler görece düşük aralıklarda yürütülüyorsa, adaptasyon bozunma eğrisinden tanımlanabilir. Bu yüzden test hafta sonundan önce hemen başlatılmamalıdır.
Eğer periyodun sonunda adaptasyon gerçekleşiyorsa, test bozunmanın tamamlandığı süreye kadar uzatılabilir.
Not:

Eğer adapte olmuş çamurun davranışı hakkında daha geniş bilgi, gerekiyorsa, aynı aktif çamur aşağıdaki işleme göre aynı maddeye maruz bırakılır:

Karıştırıcı ve havalandırıcıkapatılır ve aktif çamur çöktürülür. Üst sıvı alınır 2 litre test suyuyla doldurulur. 15 dakika karıştırılır ve tekrar çöktürülür. Üst sıvı tekrar alındığında, geri kalan çamur aynı maddeyle 1.6.1.4 ve 1.6.2’ye göre test edilmek üzere tekrar kullanılır. Aktif çamur çöktürme yerine santrifüj ile de izole edilebilir.
Adapte olmuş çamur 0.2 ila 1 g kuru ağırlık/ litre derişimdeki taze çamurla karıştırılabilir.
Analitik araçlar;

Normal olarak örnekler ıslak süzgeç kağıdından dikkatlice süzülür (yıkama için deiyonize su kullanılır)

Bulanık kalan örnekler 0,45 mikronluk süzgeç kağıtlarından süzülür. Örnek süzüntülerinde DOC derişimi 2 örnekle TOC (Toplam Organik Karbon)cihazı kullanılarak gerçekleştirilir (ilk 5 ml atılır). Eğer süzüntü aynı gün analiz edilemiyorsa, ertesi gün analiz edilmek üzere buzdolabında saklanmalıdır. Daha uzun saklama önerilmez.
Örnek süzüntülerindeki COD derişimi COD analitik düzeneği ile referans (2) deki işleme göre belirlenir.

2. 
   VERİLER VE DEĞERLENDİRME
   

DOC ve/veya COD derişimleri yukarıdaki 1.6.2 yöntemina göre en az iki örnekle belirlenir. T anında bozunma 1.2 ‘de verilen formüllere (tanımlar ile) göre hesaplanır. Bozunmanın derecesi en yakın yüzde değere yuvarlanır.

Testin sonunda elde edilen bozunma ”Zahn-Wellens testindeki biyolojik bozunurluk” olarak rapor edilir
Not: Eğer testin tamamlanmasından önce bütünüyle bozunma gerçekleşmişse ve bu sonuç ertesi gün gerçekleştirilen başka bir test ile doğrulanabiliyorsa test sonuçlandırılabilir.

3.