FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- Mikroorganizmaların toksisitesi imkan veriyorsa daha yüksek derişimler de kullanılabilir.
Yeterli sayıda temiz havalandırma birimi, bunun için 1.5 litrelik orijinal SCAS test birimi kullanılabilir, her bir test maddesi ve kontroller için hava giriş tüplerinden (şekil 1) oluşan düzenek kurulur. Test ünitelerine sağlanan ve pamuk filtresi ile temizlenmiş ve sıkıştırılmış hava serbest organik karbon içermemelidir ve buharlaşma kayıplarını azaltmak için önceden suyla doyurulmalıdır. 1 ile 4 g/litre askıda katı madde içeren karışmış sıvının bir örneği ağırlıklı olarak evsel kanalizasyon suyu arıtan tesisden alınan aktif çamurdan elde edilir. Her bir havalandırma birimi için bu karışmış sıvıdan yaklaşık 150 ml gereklidir.Test maddesinin stok çözeltileri saf su kullanılarak hazırlanır. Bu çözelti için genellikle, herhangi bir biyolojik bozunma olmuyorsa her bir havalandırma döngüsünde 20 mg/L karbon test maddesine karşılık gelen 400 mg/litre organik karbon gereklidir.Mikroorganizmaların toksisitesi imkan veriyorsa daha yüksek derişimler de kullanılabilir.Stok çözeltilerin organik karbon içeriği ölçülür.
Bu test 20 ila 25 ˚C’de yürütülmelidir. Yüksek derişimde mikroorganizma derişimi kullanılır( 1 ila 4 g/L asılı katı) ve alıkonulma zamanı 36 saattir. Kanalizasyon beslemesindeki karbonumsu yapılar normal olarak her bir havalandırma çevriminde önce 8 saat süreyle çok büyük oranda yükseltgenir. Daha sonra çamur geri kalan havalandırma periyoduna kadar bir miktar dinlendirilir. Bu sürede eğer metabolize olmadıysa mevcut bulunan tek madde test bileşiğidir. Bu özellikler evsel kanalizasyon ortam olarak kullanıldığında testin günlük tekrar aşılaması ile birleştirildiğinde, iklimlendirme ve yüksek derecede biyolojik bozunma için çok elverişli şartlar oluşturur.
Ağırlıklı olarak evsel aktif çamur tesisinden yada laboratuar biriminden karışmış sıvı örneği alınır ve aerobik ortamda kullanıma kadar saklanır. Her bir havalandırma birimi ve kontrol birimi, 150 ml karışmış sıvı ile doldurulur ve havalandırma başlatılır (eğer orijinal SCAS birimi kullanılıyor ise verilen hacimler 10 ile çarpılır). 23 saat sonunda havalandırma durdurulur ve çamurun çökmesi için 45 dakika beklenir. Her bir kabın kapağı sırasıyla açılır ve 100 ml üst sıvı alınır. Çökmüş evsel kanalizasyon suyu örneği kullanımdan hemen önce elde edilir ve bunun 100 ml’lik kısmı her bir havalandırma biriminde kalan çamura eklenir. Havalandırma tekrardan başlatılır. Bu basamakta test maddesi eklenmez ve birimler yalnızca çökme sonucu berrak bir üst sıvı elde edilinceye kadar evsel kanalizasyon suyu ile beslenir. Bu yaklaşık olarak 2 hafta alır ve bu zaman her bir havalandırma birimindeki üst sıvıdaki çözünmüş organik karbon miktarının sabit bir değer alması için gereken zamandır. Bu sürenin sonunda, ayrı ayrı çöken çamurlar karıştırılır ve oluşan komposit çamurdan 50’şer ml her birime eklenir. Kontrol birimlerine 95 ml çökmüş lağım suyu ve 5 ml su eklenir ve benzer şekilde test birimlerine 95 ml çökmüş lağım suyu ile birlikte test bileşiği stok çözeltisinden (400 mg/L) 5 ml kısım eklenir. Havalandırma tekrardan başlatılır ve 23 saat sürdürülür. Çamurun çökmesi için 45 dakika beklenir, üst sıvı alınır ve organik karbon içeriğinin belirlenmesi için analiz edilir. Yukarıdaki doldur boşalt işlemi test süresince günlük olarak tekrar edilir. Çöktürmeden önce sıvı seviyesinin üstünde katı birikiminin önüne geçebilmek için birimlerin duvarlarının yıkanması gerekli olabilir. Çapraz kirliliğin önüne geçmek için her birim için ayrı bir kazıyıcı yada fırça kullanılmalıdır. İdeal olarak, daha az sürelerde de belirlenebilirse de, üst sıvıdaki çözünmüş organik karbon miktarı günlük olarak belirlenir. Sıvılar analizden önce 0.45 mikronluk yıkanmış membran filtreleri ile filtre edilir veya santrifüj edilir. Membran filtreleri süzme aşamasında ne karbonu salacak ne de maddeyi adsorblayacak şekilde olmalıdır. Örneğin sıcaklığı santrfifüj içinde 40 oC’yi geçmemelidir. Hiç biyolojik bozunmaya uğramayan yada çok az bozunan bileşikler için test süresi belirsizdir, ancak önceki deneyler bu sürenin genel olarak en az 12 hafta olması gerektiği ancak 26 haftayı geçmemesi gerektiğini göstermiştir.
Test ve kontrol birimlerinin üst sıvısındaki organik karbon içeriği zamana karşı grafiğe geçirilir. Biyolojik bozunma olduğunda, test örneğindeki miktar kontroldeki değere yaklaşır. 3 ardışık ölçüm boyunca eğer iki değer arasındaki fark sabit bulunuyorsa, istatistiksel veri değerlendirmesi yapabilmek için yeterli olacak sayıda bu tür ölçümler yapılır ve test bileşiğinin yüzde biyolojik bozunması hesaplanır. (Dda, Dssd, bakınız 1.2)
Test raporu, eğer mümkünse, aşağıdakileri içermelidir.
Bu testle analiz edilen maddeler kolaylıkla biyolojik bozunabilir olan maddeler olmadığı için, esas olarak biyolojik bozunmaya bağlı olan DOC uzaklaştırması, iklimlendirmenin birkaç hafta sonunda beklenmedik yok olmanın aniden olduğu durumlar dışında,günler ve haftalar boyunca kademeli olacaktır. Fiziko-kimyasal adsorsiyon bazen önemli rol oynayabilir. Bu başlangıçta eklenen DOC’nin kısmen yada tamamen yok olmasıyla anlaşılır. Daha sonra olan olaylar, adsorpsiyon derecesi, atık akış suyundaki (effluent) asılı katıların derişimi gibi faktörlere bağımlıdır. Genellike test ve kontrol sıvılarındaki DOC değerleri arasındaki fark başlangıçtaki az bir değerden giderek artar ve bu değer deneyin geri kalan kısmında, iklimlendirme olmadıkça, sabit bir değere ulaşır. Biyolojik bozunma (veya kimsi biyolojik bozulma) ve adsorpsiyon arasındaki bir farklılık olursa ilave testler yürütülür. Bu işlem birkaç yoldan yapılabilir. Ancak en ikna edici olanı üst sıvı yada çamuru temel seri testinde aşı olarak kullanmaktır (Tercihen respirometik test). Bu testte yüksek ve adsorbe edici olmayan DOC değerleri veren test maddeleri potansiyel biyolojik bozunur olarak değerlendirilebilir. Adsorbe edici olmayan kısmi uzaklaştırma kimyasalın en azından az miktarda biyolojik bozunmaya uğradığını gösterir. Düşük yada sıfır DOC(yada COD) uzaklaştırma değerleri test maddesinin mikroorganizmalar tarafından inhibe edilmesinden kaynaklanabilir ve bu çamurun azalması ve parçalanmasıyla bulanık üst sıvı oluşturması ile anlaşılabilir. Test, test maddesi daha düşük bir konsantrasyonda verilerek tekrar edilmelidir. Bileşiğe özgü bir analitik metodun kullanımı yada 14C işaretli test maddesi kullanımı daha büyük bir hassasiyet sağlayabilir. 14C işaretli bileşikte, 14CO2 geri kazanımı biyolojik bozunmanın gerçekleştiğini doğrular. Sonuçlar birincil biyolojik bozunma cinsinden verildiğinde, eğer mümkünse ana test maddesinin cevap kaybına yol açan kimyasal yapı değişikliğine ilişkin bir açıklama verilmelidir. Yöntemin analitik geçerliliği kör test ortamında bulunan test sonucu ile birlikte verilmelidir.
Ek-I SCAS testi: sonuçların örneği
Ek-II  Şekil 1 Test düzeneği örneği C.13 BİYOLOJİK KONSANTRASYON İÇ-AKIŞ BALIK TESTİ
Bu biyolojik konsantrasyon yöntemi OECD TG 305(1996) yöntemi ile eşdeğerdir.
Bu yöntem, maddelerin iç-akış koşullarındaki biyolojik konsantrasyon potansiyellerini tanımlamak için bir işlem açıklar. İç-akış test şartları daha tercih edilebilir olsa da, yarı-durağan şartlar eğer geçerlilik ölçütlerini sağlıyorsa müsaade edilebilirdir. Bu yöntem testi yürütmek için ve test maddelerinin değişen özellikleri için deneysel düzeneği özel laboratuvar koşullarına uyarlama özgürlüğü sağlayacak yeterli ayrıntı verir. Bu yöntem en çok log Pow değerleri 1.5 ve 6.0(1) arasında değişen kararlı organik kimyasallara uygulanabilir ancak log Pow değerleri 6’dan büyük olan aşırı yağ seven(süperlipofilik) maddelere de uygulanabilir. Bazen KB olarak da ifade edilen biyolojik konsantrasyon faktörünün (BCF) bu tür süper yağ seven maddeler için olan ön-kestirimi (ön tahmini) laboratuvar deneylerinden elde edilen yatışkın-hal-biyolojik konsantrasyon faktörü (BCFss) değerinden muhtemelen daha yüksek olacaktır. log Pow değerleri 9’a kadar olan organik kimyasallar için biyolojik deriştirme faktörünün ön-belirlemesi Bintein eşitliği kullanılarak elde edilebilir (2) nci Biyolojik konsantrasyon potansiyelini tanımlayan katsayılar, alım hız sabiti (k1), atılım hız sabiti (k2) ve BCFss’tir. Radyoaktif işaretli test maddeleri suyun ve balık örneklerinin analizini kolaylaştırabilir ve bozunan tanımlamasını ve miktarlandırılmasının yapılıp yapılamayacağını belirlemede kullanılır. Eğer toplam radyoaktivite kalıntıları ölçülürse(örneğin yanma ya da doku çözünürleştirmesi ile), BCF; ana bileşiğe, artık herhangi bir metabolit (metabolizmada oluşan) ve ayrıca özümlenmiş karbona dayanır. Dolayısıyla, toplam radyoaktif kalıntıya dayanan BCF’ler sadece ana bileşiğin özgül kimyasal analizinden türetilmiş BCF ile doğrudan karşılaştırılabilir değildir. Ana bileşiğe dayanan BCF tespitinde radyoaktif işaretleme çalışmaları için temizleme işlemleri uygulanabilir ve gerekli görülürse ana metabolitler tanımlandırabilir. Ayrıca dokulardaki kalıntıların analizi ve tanımlanması ile bir balık metabolizma çalışmasını, biyolojik konsantrasyon çalışması ile birleştirmek mümkündür.
Biyolojik konsantrasyon/biyolojik birikim test maddesinin çevresel ortamdaki test maddesi derişimine kıyasla, organizmadaki (ilgili organlarında) derişiminde meydana gelen artıştır. Biyolojik konsantrasyon faktörü (BCF yada KB) bu birikim testinin alım evresindeki herhangi bir anda, doku yada tanımlı dokulardaki test maddesi derişiminin [Cf μg/g olarak (ppm)], çevresel ortamdaki test maddesi derişimine bölümüdür [Cw μg/g olarak (ppm)]. Yatışkın-hal biyolojik konsantrasyon faktörü (BCF yada KB) uzun bir periyotta kayda değer ölçüde değişmez ve test maddesinin çevreleyici ortamda derişimi aynı periyotta sabittir. Plato yada yatışkın hal balıktaki test maddesinin [Cf] zamana karşı çizilen grafiğinde, eğri zaman eksenine paralel olduğunda ve en az 3 gün arayla alınan örneklerdeki Cf değeri, üç ardışık analizde birbirinin ± 20%’si içindeyse ve üç örnekleme periyodunda kayda değer bir farklılık yoksa ulaşılır. Biriktirilmiş örnekler analiz edildiğinde, en azından 4 ardışık analiz gereklidir. Daha yavaş aralıklarla alınan örnekler için aralıkların 7 günlük olması daha uygundur. Biyolojik konsantrasyon faktörleri doğrudan kinetik hız sabitlerinden(k1/k2) hesaplandığında bunlar BCFolarak tanımlanır. Oktanol/ Su dağılım katsayısı (Pow) kimyasalın n-oktanoldeki çözünürlüğünün dengedeki suya oranıdır(Yöntem A.8) ve Kow olarak ta tanımlanır. Pow ‘ın logaritması, kimyasalın sucul organizmaları tarafından biyolojik konsantrasyon potansiyelinin bir belirteci olarak kullanılır. Maruz kalma ya da alım evresi balıkların test kimyasalına maruz kaldıkları zamandır. Alım hız sabiti (k1) Balık test maddesine maruz kaldığında balıkta (ya da ilgili dokusunda) test maddesinin konsantrasyonundaki artışı açıklayan sayısal değerdir.(k1, gün-1 olarak ifade edilir.) Maruz kalma sonrası ya da atılım evresi test balığının test maddesi içeren ortamdan test maddesi içermeyen ortama alındıktan sonra test maddesinin balıktaki (ya da ilgili dokusunda) atılmasının (kaybının) çalışılmasında geçen zamandır. Atılma (kayıp) hız sabiti (k2), balığın test maddesi içeren ortamdan test maddesi içermeyen ortama alınmasını takiben, test maddesinin test balığındaki konsantrasyonundaki azalma miktarının sayısal değeridir.(k2, gün-1 olarak ifade edilir)
Test iki evreden oluşmaktadır: Maruz kalma (alım) evresi ve maruz kalma sonrası (atılım) evreleri vardır. Tutunma evresi boyunca, tek bir türden oluşan ayrı balık grupları test maddesinin en az iki farklı derişimine maruz bırakılır. Daha sonra atılım evresi için test maddesi içermeyen bir ortama alınırlar. Alım evresinde maddenin alımı önemsiz (örneğin 10’dan küçük BCF değerinde) değilse bir atılım evresi her zaman gereklidir. Test maddesinin balığın içindeki/üzerindeki (yada ilgili dokusundaki) konsantrasyonu testin her iki evresinde de izlenir. Biyolojk konsantrasyon testinde gözlenebilecek olası olumsuz etkileri ilişkilendirmek ve test maddesi için zemin derişimleri oluşturmak için iki test derişimine ek olarak, bir grup kontrol balığı sadece test maddesi içermeyen ve diğer bütün şartları aynı olan bir ortamda tutulur. Alım evresi, daha önce dengeye geldiği gözlenmiyorsa 28 gün devam ettirilir. Alım evresinin uzunluğunun tahmini ve yatışkın hal zamanının tahmini Ek-III’teki eşitlik kullanılarak belirlenebilir. Atılım evresi, test balığının yalnızca test maddesi içermeyen ama diğer bütün şartları aynı olan ortama temiz bir tank içine aktarılması ile başlatılır. Mümkün olduğu durumda, biyolojik konsantrasyon faktörü (Cf) BCFSS, tercihen hem balığın konsantrasyonunun görünür yatışkın halde sudaki konsantrsayona (Cw) oranı hem de kinetik biyolojik konsantrasyon faktörü, BCFk,birinci derece kinetik varsayılarak, alım (k1) ve atılım (k2) hızları oranı olarak hesaplanır. Eğer birinci derece kinetiğe uyulmuyorsa, daha karmaşık modeller kullanılabilir.(Ek -V) Eğer 28 gün içinde yatışkın hale ulaşılmıyorsa, alım evresi, yatışkın hale ulaşılıncaya kadar yada 60 güne kadar,hangisi önce geliyorsa, uzatılmalıdır ve daha sonra atılım evresine başlanmalıdır. Alım hız sabiti, atılım (kayıp) hız sabiti(ya da daha karmaşık modeller kullanılıyorsa hız sabitleri), biyolojik konsantrasyon faktörü ve mümkün oluyorsa bu parametrelerin güven aralığı, test maddesinin balıkta ve suda ölçülen derişimlerini en iyi açıklayan modele göre hesaplanır. BCF, balığın toplam ıslak ağırlığının fonksiyonu olarak ifade edilir. Ancak özel amaçlar için, eğer balık yeterince büyükse belirli doku ya da organlar (karaciğer, kas gibi) kullanılabilir yada balık yenilebilir(fileto) yada yenilmez parçalara bölünür. Pek çok organik madde için biyolojik konsantrasyon potansiyeli ve yağ severlilik( lipofilisite) arasında açık bir ilişki bulunduğu için bu maddeler için gözlenen biyolojik konsantrasyon ve test balığının yağ içeriği arasında da bir ilişki vardır. Bu yüzden yüksek yağı seven özellikteki bileşiklerdeki bu tür değişkenliği azaltmak için( örn. log Pow>3) biyolojik konsantrasyon toplam vücut ağırlığı yanında lipit içeriği cinsinden de belirtilmelidir. Uygulanabilir olduğunda, lipit içeriği test maddesinin konsantrasyonunun belirlendiği aynı biyolojik örneklerde belirlenmelidir.
Biyolojik konsantrasyon için testi yürütmeden önce, test maddesi hakkında aşağıdaki bilgiler bilinmelidir:
Gereken diğer bilgiler bu testte kullanılan balıklar için toksisitedir. Bu tercihen asimptotik (zamandan bağımsız) LC50 değeridir. Örnek hazırlama ve saklama koşulları ile birlikte test çözeltileri ve biyolojik malzeme için bilinen bir kesinlikte, doğrulukta ve duyarlılıkta uygun bir analitik yöntem mevcut olmalıdır. Suda ve balık dokusunda test maddesinin analitik tayin sınırı ayrıca bilinmelidir. 14C ile işaretli test maddesi kullanıldığında, safsızlıklardan kaynaklanan radyoaktivite bilinmelidir.
Testin geçerli olabilmesi için aşağıdaki koşullar sağlanmalıdır:
Bilinen biyolojik konsantrasyon potansiyelindeki referans maddelerin gerektiğinde kullanımı deneysel prosedürü kontrol etmek için yararlı olabilir. Ancak özel maddeler henüz önerilmemiştir.
Ekipmanların bütün parçaları için kullanılan materyallerin çözme, süzme, adsorplama ya da balık üstünde olumsuz etki yapabilmelerinden kaçınmak için dikkat gösterilmelidir. Kimyasal olarak aktif olmayan ve yükleme hızına uygun kapasitede standart dikdörtgen ya da silindirik tanklar kullanılabilir. Teflon®, paslanmaz çelik yada cam tüpler tercihen kullanılabilir. Plastik tüplerin kullanımı en aza indirilmelidir. Tecrübeler yüksek adsorpsiyon kapasitesine sahip maddeler için sentetik pyrethroitler, silanize (silisyum ile modifiye edilmiş) edilmiş camın gerekebildiğini göstermiştir. Bu hallerde kullanılan ekipman kullandıktan sonra atılmalıdır.
Testte genel olarak kirletilmemiş ve belli kalitede kaynaktan gelen doğal su kullanılır. Seyreltme için kullanılan su seçilen balık türlerinin havalandırma (iklimlendirme) ve test sürelerinde yaşamasına imkân verecek ve herhangi bir anormal görünüm ve davranış yaratmayacak kalitede olmalıdır. İdeal olarak balıkların seyreltme suyunda yaşayabildiği, büyüyebildiği ve çoğalabildiği gösterilmelidir.(örneğin laboratuvar kültürü veya yaşam döngüsü toksisite testi). Su ayrıca en azından pH, sertlik, toplam katı, toplam organik karbon ve tercihen ayrıca amonyum, nitrit, bazlık ve deniz türleri için de tuzluluk açısından karakterize edilmelidir. Balık iyiliği için önemli olan değişkenler tümüyle bilinmektedir ancak Ek- I tatlı ve deniz suyu için önerilen en fazla konsantrasyonları vermektedir. Su test boyunca sabit kalitede olmalıdır. pH değeri 6.0 ila 8.5 aralığında olmalıdır ancak verilen bir testte ise ±0.5 pH birimi aralığında olmalıdır. Seyreltme suyunun gereksiz olarak test sonuçlarını etkilemeyeceğinden (örneğin test maddesi ile kompleksleşerek) emin olmak için yada balık stoğunun performansını etkilemeyeceğinden emin olmak için aralıklarla analiz için örnek alınmalıdır. Ağır metallerin (örneğin, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni ) ve temel anyonların ve katyonların ( Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4 ), pestisitlerin (toplam fosfatlı organik pestisit ve klorlu organik pestisit ), toplam organik karbonun ve asılı katıların tayini suyun kalitesinin bağıl olarak sabit kalitede olduğu bilinen bir zamanda örneğin 3 ayda yapılmalıdır. Su kalitesinin en azından 1 yıl boyunca sabit kalitede olduğu durumlarda ölçümler daha az sıklıkta ve ölçüm aralıkları uzatılarak( örneğin her altı ayda) yapılabilir. Seyreltme suyunun doğal tanecik içeriği ve toplam organik karbon içeriği test maddesinin biyo-yararlanımını düşürebilecek olan organik maddeye adsorpsiyonunu engellemek için mümkün olduğu kadar düşük seviyede tutulmalıdır. En fazla kabul edilen değer 5 mg/L tanecikli madde ( kuru ve 0.45 mikronluk filtreden geçmeyen) ve 2 mg/L toplam organik karbondur (EK- I’e bakınız). Gerekli olduğunda su, kullanım öncesi filtre edilmelidir. Test balığından ve yiyecek kalıntılarından suya gelen organik karbon içeriği katkısı mümkün olduğu kadar düşük tutulmalıdır. Test boyunca, test kabındaki organik karbon derişimi test maddesinden kaynaklanan organik karbon derişimini ve eğer kullanılmışsa çözünürleştirici ajanın derişimini 10 mg/L’den fazla geçmemelidir (±%20).
Test maddesinin uygun derişimde bir stok çözeltisi hazırlanır. Stok çözelti test maddesinin basitçe seyreltme suyunda çözüp çalkalayıp karıştırarak hazırlanır. Çözücülerin ve dağıtıcıların (çözünürleştirici ajanlar) kullanımı önerilmez ancak bazı durumlarda uygun ve derişik bir stok çözelti hazırlamak için gerekli olabilir. Kullanılabilen çözücüler etanol, metanol, etilen glikol monoetil eter, etilen glikol dimetil eter, dimetilformamit ve trietilen glikoldür. Kullanılabilen dağıtıcılar Cremephor RH40, Tween 80, % 0.01’lik metilselüloz ve HCO-40’tır. İç-akış testinde bakteri üremesine neden olabilecek kolay bozunabilir ajanları kullanırken dikkatli olunmalıdır. Test maddesi radyoaktif olarak işaretlenebilir ve en yüksek saflıkta olmalıdır( tercihen % 98’den fazla). İç-akış testleri için, test bölmelerine test derişimlerini uygulamak için, test maddesinin stok çözeltisini sürekli olarak dağıtan bir sisteme( ölçüm pompası, oransal seyreltici, doyurucu sistemi) ihtiyaç vardır. Her bir test bölmesinde günlük olarak en azından 5 hacim değişimi tercihen yapılabilir. İç-akış modu tercih edilmelidir ancak bunun mümkün olmadığı durumda doğruluk ölçütleri sağlandığında yarı durağan bir teknik kullanılabilir. Stok çözeltilerinin ve seyreltme suyunun akış hızı 48 saat önce ve test süresince de en azından günlük olarak kontrol edilmelidir. Bu kontrol her bir test bölmesindeki akış hızının kontrolünü içerir ve bölmelerde ve bölmeler arasında 20% değişmediğinden emin olunur.
Türlerin seçimindeki önemli ölçütler, kolaylıkla elde edilebilir olması, uygun boyutta elde edilmesi ve laboratuvarda kolaylıkla saklanabilir olmasıdır. Balık türlerinin seçimindeki diğer lçütler ticari olması, ekolojik önemi, karşılaştırılabilir duyarlılıkta olması ve geçmişte başarılı kullanımıdır. Önerilen test türleri Ek- II’de verilmiştir. Diğer türlerde kullanılabilir ancak test prosedürünü uygun test koşulları oluşturmak için uyarlanması gereklidir. Bu halde türlerin seçimindeki sebep ve deneysel koşullar belirtilmelidir.
Stok balık popülâsyonu testten önce en az 2 hafta boyunca teste uygulanacak koşullarda beslenir ve su içinde test sıcaklığında havalandırılır. 48 saatlik çökme periyodunu takiben, ölümler kaydedilir ve aşağıdaki ölçütler uygulanır:
Testlerde kullanılan balıkların gözlenebilir hastalıklara sahip olmamasına ve anomalite olmadığından emin olunur. Hasta olan balıklar atılır. Balıklar testten 2 hafta önce ya da test esnasında tedavi edilmemiş olmalıdır.
Açıklayıcı testin; test maddesi konsantrasyonu, alım evreleri, atılım evreleri süresi gibi koşullarını iyileştirmek (optimize etmek) için ön bir testin yürütülmesi yararlı olabilir.
Alım evresinin zamanının tahmini pratik tecrübelerden yada test maddesinin sudaki çözünürlüğü yada oktanol/su dağılım katsayısı bilgileri gibi kesin ampirik ilişkilerden elde edilebilir.(EK- III’e bakınız) Alım evresi daha önce dengeye gelmiyorsa 28 gün yürütülmelidir. Eğer 28 gün içinde yatışkın hale ulaşılamıyorsa, alım evresi daha fazla ölçüm alarak yatışkın hale ulaşana dek yada 60 güne, hangisi daha kısa ise, uzatılabilir.
Alım evresinin süresinin yarısı kadar bir süre vücuttaki maddenin yükünde (örneğin, %95) azalma gerçekleşmesi için genellikle yeterlidir. (Açıklama ve hesaplama için Ek-III’e bakınız). Eğer %95 kayıp için gereken süre pratik olarak çok uzunsa, örneğin normal alım evresini 2 kattan fazla aşıyorsa (56 günden fazla) daha kısa bir periyot kullanılabilir (yani, test maddesinin konsantrasyonu yatışkın-hal konsantrasyonun %10’undan az olana kadar). Ancak birinci derece kinetik oluşturan ve tek bölmeli balık modelinden daha karmaşık alım ve atılım şablonuna sahip maddeler kayıp hızı sabitlerinin hesaplanması için daha uzun atılım evreleri gerektirebilir. Periyot, test maddesinin balıktaki konsantrasyonu analitik tayin sınırının üzerinde kaldığı periyot tarafından kontrol edilebilir.
Her bir örneklemede örnek başına en az dört balık olacak şekilde her bir konsantrasyonunda balık sayısı belirlenir. Eğer daha fazla istatiksel kuvvet gerekiyorsa örnek başına daha fazla balık gerekebilir. Eğer deneyde yetişkin balıklar kullanılmışsa dişi mi erkek mi olduğu yada ikisi birden kullanılmışsa rapor edilmelidir. Eğer her iki cinsiyette kullanılmışsa, cinsiyetler arası lipit içeriğinin önemsiz olduğu maruz kalmain başlangıcından önce belgelendirilmelidir. Bunun için erkek ve dişi balıkların biriktirilmesi gerekebilir. Herhangi bir testte, en küçüğü en büyüğünün üçte ikisinden küçük olmayacak şekilde benzer ağırlıkta balıklar seçilir. Hepsi aynı yılın türünden olmalı ve aynı kaynaktan gelmelidir. Balığın ağırlığı ve yaşı BCF değerlerinde bazen ciddi etkiye sahip olduğu için (1) bu ayrıntılar doğrulukla kaydedilir.. Bunun için testten önce ortalama ağırlığı hesaplayabilmek için balık stoğunun bir alt örneğinin tartılması önerilir.
Testin başlangıcında balığın eklenmesinin neden olduğu Cw azalmasını en aza indirmek için ve çözünmüş oksijen konsantrasyonundaki azalmadan kaçınmak için yüksek su-balık oranları kullanılır. Kullanılan test türleri için yükleme hızının uygun olması önemlidir. Her durumda normal olarak günlük olarak litre su başına 0.1-1.0 g balık düzeyindeki (ıslak ağırlık) yükleme hızı önerilir. Test maddesinin istenen derişiminin ±%20 sınırlarında tutulabildiği ve çözünmüş oksijen derişimininin %60’dan az doygunluğa düşmediği gözleniyorsa daha yüksek yükleme hızları da kullanılabilir. Uygun yükleme koşullarını seçerken, balık türlerinin normal yaşam çevreleri göz önüne alınır. Örneğin, dipte yaşayan balıklar akvaryumda aynı hacimde su için okyanus dibindeki balıklardan daha fazla dip alanına ihtiyaç duyar.
İklimlendirme ve test periyodu boyunca, balıklar bilinen lipit ve protein içeriğine sahip ve vücut ağırlıklarını sabit tutacak ve onları sağlıklı tutacak besinler ile beslenir. Balıklar iklimlendirme ve test periyodunda toplam vücut ağırlıklarının %1 ila %2’sine denk gelecek nispette besinle beslenir bu oran test boyunca balıkların lipit içeriğini görece olarak sabit bir değerde tutar. Verilecek besin miktarı, uygun vücut ağırlığını ve lipit içeriğini sağlamak için örneğin haftada bir yeniden hesaplanmalıdır. Bu hesaplama için her bir test bölmesindeki balıkların ağırlığı o bölmeye en son konulan balığın ağırlığından hesaplanabilir. Bölme içindeki balıkların ağırlığı ölçülmez. Yenilmeyen besinler ve posalar beslemeden (30 dakika veya 1 saat) sonra test bölmelerinden sifonlama ile uzaklaştırılır. Organik madde konsantrasyonunu mümkün olduğu kadar düşük seviyede tutabilmek için bölmeler test boyunca mümkün olduğu kadar temiz tutulur çünkü organik karbonun varlığı test maddesinin biyo yararlanımını sınırlayabilir. Pek çok besin balıktan elde edildiği için bu besinler test maddesi içeriği için analiz edilmelidir. Ayrıca besinin pestisit ve ağır metal içeriği analizi de istenebilir.
Işıklı periyot genellikle 12 ila 16 saattir ve sıcaklık test türleri için uygun olacak sıcaklıkta (±2 oC ‘te) tutulmalıdır (Ek- II’ye bakınız). Işıklandırmanın türü ve karakteristikleri bilinmelidir. Çalışmadaki ışınlama koşullarında maddenin ışıkla olası ışıkla dönüşümüne karşı dikkat edilmelidir. Balığın doğal olmayan ışınlama sonucu oluşan ürünlere maruz kalmadan kaçınmak için uygun ışıklandırma kullanılmalıdır. Bazı durumlarda 290 nm altındaki UV ışımasını perdelemek için bir filtre kullanılır.
Balıklar iç-akış şartları altında test maddesinin en az iki farklı konsantrasyonuna maruz bırakılır. Normal olarak, test maddesinin en yüksek konsantrasyonu akut asimptotik LC50’sinin yaklaşık %1’i olacak ve kullanılan analitik yöntemle sudaki tayin sınırının en az 10 katı olacak şekilde seçilir. En yüksek test konsantrasyonu ayrıca 96 saatlik akut LC50 değerini uygun bir akut/kronik orana (bazı kimyasallar için uygun oranlar 3’ten 100’e kadar olabilir) bölerek de belirlenebilir. Eğer mümkünse, diğer konsantrasyon ötekinden 10 kat farklı olacak şekilde seçilir. Eğer bu %1’lik LC50 ölçütü ve analitik sınır nedeniyle mümkün değilse, 10’dan daha düşük bir oran yada 14C işaretli test maddesi kullanılabilir. Test maddesinin çözünürlüğünün üzerinde hiçbir konsantrasyon kullanılmamalıdır. Çözünürleştirici bir ajanın kullanılması durumunda konsantrasyonu 0.1 ml/L den daha yüksek olmamalıdır ve bütün test kaplarında aynı olmalıdır. Test maddesi ile birlikte bunun test suyundaki toplam organik karbona olan katkısı bilinmelidir. Ancak bu tür maddelerin kullanımından kaçınmak için bütün çaba sarf edilmelidir.
Bir seyreltme suyu veya uygunsa test balıklarına herhangi bir etkisi olmadığı belirlenmişse çözünürleştirici ajan içeren bir kontrol, test serilerine paralel olarak yürütülmelidir.
Test boyunca bütün kaplarda çözünmüş oksijen, TOC, pH, sıcaklık ölçülmelidir. Uygunsa toplam sertlik ve tuzluluk kontrollerde ve daha yüksek konsantrasyondaki bir kapta ölçülmelidir. Çözünmüş oksijen miktarı ve tuzluluk uygunsa en az 3 kez alım periyodunun başında, ortasına yakın ve sonunda ve haftada bir kez de atılım periyodunda ölçülmelidir. TOC testin başında ( alım evresi testinin başlangıcından 24 ila 48 saat önce) balıklar eklenmeden önce ve alım ve atılım evrelerinin ikisinde de haftada en az bir kez ölçülmelidir. Sıcaklık günlük olarak, pH her bir periyodun başında ve sonunda ve sertlik her teste ölçülmelidir. Sıcaklık tercihen en az bir test kabında sürekli olarak izlenmelidir.
Test maddesi derişiminin belirlenmesi için test bölmelerinden su örneği alımı balıkların eklenmesinden önce ve hem alım hem de atılım evrelerinde yapılır. En az olarak, su ve balığın örneklemesi aynı zamanda, balığın beslemesinden önce alınır. Alım evresinde, test maddesinin konsantrasyonu doğruluk ölçütleri ile uyumluluğun kontrolü için belirlenir. Balıklar alım evresinde en az 5 farklı ortamdan ve atılım evresinde ise en az 4 farklı ortamdan toplanır. Bazı ortamlarda özellikle basit birinci derece atılım kinetiğinden başka kinetik gösterdiğinde, BCF değerinin kabul edilebilir bir hesaplamasının yapılması zor olduğu için, daha yüksek sıklıkta örnekleme yapılması uygun olabilir.(Ek-IV’e bakınız). Toplanan ilave örnekler, eğer ilk kesimdeki analizler BCF’nin istenen doğrulukta hesaplanması için uygun değilse saklanır ve analiz edilir.
Su örnekleri test bölmesindeki merkezi bir noktadan etkinlik göstermeyen bir tüpe sifonlamayla alınarak analiz edilir. Filtreleme ve santrifüjlemeden hiçbiri biyo yararlanılabilir olamayan kesiminin biyolojik yararlanılabilir kesimden ayrılmasını sağlamadığı için(özellikle Pow değerleri 5’ten büyük olan yüksek oranda yağ seven kimyasallar için) (1)(5) örnekler bu tür işlemlere tabi tutulmayabilir. Bunun yerine kapları mümkün olduğu kadar temiz tutacak önlemler alınır ve toplam organik karbon içeriği hem alım hem de atılım evrelerinde izlenir. Uygun sayıda balık (normal olarak en az 4) her örnekleme zamanında test bölmelerinden ayrılır. Alınan balıklar tatlı suyla hızlıca yıkanır, kurulanır ve en uygun ve insani yolla öldürülür ve tartılır. Bozunma ve diğer kayıpları engellemek için ve test süresince uygun alım ve atılım hızlarını yaklaşık olarak hesaplayabilmek için örneklemeden hemen sonra balıkların ve suyun analiz edilmesi tercih edilir. Hemen analiz ayrıca plato değerinin belirlenmesindeki gecikmeleri de engeller. Eğer hemen analiz yapılmazsa, örnekler uygun bir yöntem ile saklanır. Çalışmanın başlangıcından önce, belirli bir test maddesinin saklanması ile ilgili uygun bir yöntem, örneğin derin dondurma, 4˚C’de tutma, saklama zamanı, ekstraksiyon gibi bilgiler elde edilmelidir.
Bütün yöntem analitik yöntemin doğruluk, kesinlik ve duyarlılığına dayandığı için, kimyasal analizin kesinliği, tekrarlanabilirliği ve belli bir yöntem için test maddesinin hem sudan hem de balıktan kayda değer şekilde geri kazanılabilirliği kontrol edilir. Ayrıca test maddesinin kullanılan seyreltme suyunda tayinedilebilir olmadığı kontrol edilir. Eğer gerekiyorsa, testten elde edilen Cw ve Cf değerleri kontrollerin geri kazanım ve zemin değerlerine göre düzeltilir. Balık ve su örnekleri kirlilik ve kayıp olmayacak şekilde muhafaza edilir. ( ölçüm cihazına adsorpsiyondan kaynaklanan)
Eğer testte radyoaktif işaretli malzemeler kullanılacaksa, toplam radyoaktif işaretleyici (ana bileşik ve metabolitler) için analiz yapılabilir ya da örnekler ana bileşik ayrı olarak analiz edilebilecek şekilde temizlenir. Ayrıca, temel metabolitler yatışkın halde ya da testin alım evresi sonunda, hangisi önce gerçekleşiyorsa, karakterize edilebilir. Eğer BCF radyoaktif işaretli kalıntılar cinsinden ≥1000% ise, bazı önemli kimyasalları ki bunlar arasında pestisitler güçlü bir şekilde önerilir, yatışkın halde balık dokularındaki toplam kalıntıların %10’undan fazlasını temsil eden bozunmanın tanımlanması ve miktarının belirlenmesi önerilir. Eğer balık dokularındaki radyoaktif işaretli artıkların %10’undan fazlasını temsil eden bozunma tanımlanır ve miktarı belirlenirse, bu bozunmanın test suyunda da tanımlanması ve miktarının belirlemesi önerilir. Test maddesinin konsantrasyonu genel olarak tartılan her bir balık için belirlenmelidir. Eğer bu mümkün değilse, her bir örneklemede balıklar biriktirilebilir ancak biriktirme verilere uygulanabilecek olan istatistikî işlemleri kısıtlar. Eğer belirli bir istatistiki işlem ve kuvvet önemli bir sebep ise, o zaman uygun sayıda balık istenen biriktirme prosedürüne ve kuvvete uygun şekilde dahil edilir.(6)(7) BCF toplam ıslak ağırlık olarak ve yüksek yağ seven maddeler için toplam lipit içeriğinin fonksiyonu olarak tanımlanmalıdır. Balığın lipit içeriği eğer mümkünse her bir örnekleme alanında belirlenir. Lipit içeriğinin belirlemesi için uygun yöntemler kullanılmalıdır.(EK- III’teki Ref.2 ve 8) Kloroform/metanol ekstraksiyon tekniği standart bir yöntem olarak önerilebilir.(9) Farklı yöntemiler aynı sonucu vermez(10) bu yüzden kullanılan metodun ayrıntılarının verilmesi gerekir. Mümkün olduğunda, lipitin analizi test maddesinin analizi için üretilen aynı ekstrakt ile yapılmalıdır. Çünkü lipitlerin kromatografik olarak analiz edilmeden önce uzaklaştırılmaları gerekir. Deneyin sonunda balığın lipit içeriği (mg/ kg ıslak ağırlık) deneyin başlangıcındaki değerden ±%25’ten fazla değişmemelidir. Islak temele dayalı lipit konsantrasyonunu kuru temele dayalı konsantrasyona dönüştürmek için doku katı yüzdesi rapor edilmelidir.
|