FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

VERİLER VE RAPORLAMA

1. 
   Sonuçların değerlendirilmesi
   

Bu test deneysel anlamda ciddi değişime uğrayabildiği için örneğin test hücrelerinin sayısı, test derişimlerinin sayısı, balık sayısı gibi, bir uzman istatistikçinin hem test tasarımında hem de sonuçların yorumlanmasında bulunması önerilir. Test tasarımında bulunan tercihler açısından, yardımcı istatistiki işlemler burada verilmemiştir. Büyüme hızları ölüm oranı%10’u geçen test kaplarında hesaplanmamalıdır. Ancak bütün test derişimlerinde ölüm oranı belirtilmelidir.

Verilerin analiz için hangi yöntem kullanılırsa kullanılsın, genel kavram, özgül büyüme hızının t₁ ve t₂ zamanları arasındaki ilişkidir. Bu çeşitli şekillerde, balıklar tek tek işaretlenip işaretlenmediğine tank ortalaması gerekip gerekmediğine göre tanımlanır.
burada,

r₁= tek bir balığın özgül büyüme hızı,

r₂= tanktaki tüm balıkların ortalama büyüme hızı,

r₃= yalancı özgül büyüme hızı,

w₁,w₂ = balıkların t₁ ve t₂ zamanlarındaki ağırlığı,

log_ew₁= çalışma periyodunun başında tek bir balığın ağırlığının logaritması,

log_ew₂ =çalışma periyodunun sonunda tek bir balığın ağırlığının logaritması,
= çalışma periyodunun başında tanktaki w₁ değerlerinin ortalama logaritması,

= çalışma periyodunun sonunda tanktaki w₂ değerlerinin ortalama logaritması,

t₁, t₂ =çalışma periyodunun başı ve sonundaki zaman (gün),

r₁, r₂, r₃ değerleri 0-28 günlük periyottan yada 0-14 yada 14-28 günlük periyottan hesaplanır. ( 14. gündeki ölçüm yapıldıktan sonra)

1. 
   Sonuçların regresyon ile analizi ( konsantrasyon-cevap modeli)
   

Bu yöntem özgül büyüme hızı ve derişim arasında uygun bir matematiksel ilişki ortaya koyar ve istenen her EC değerindeki EC_x değerinin hesaplanmasını sağlar. Bu yöntemi kullanarak tek bir balık için “r” değerinin hesaplaması gerekli değildir ve bunun yerine analiz tank ortalaması r değerine (r₂) dayandırılabilir. Son yöntem daha tercih edilir. Özellikle daha küçük türler için daha uygundur.

Tank ortalaması özgül büyüme değerleri (r₂) konsantrasyon-cevap ilişkisini sorgulamak için derişime karşı grafiksel olarak çizilmelidir.
r₂ ve derişim arasındaki ilişkiyi ifade etmek için, uygun bir model seçilmelidir ve bu seçim uygun sebeplerle desteklenmelidir.
Eğer her bir tankta sağ kalan balıkların sayısı eşit değilse, basit yada lineer olmayan model oluşturma süreci eşit olmayan büyüklükteki grupların tartılmasına izin vermelidir.
Uyarlama modeli, örneğin EC₂₀ ve onun dağılımının tahminine olanak vermelidir (Standard hata veya güven aralığı). Uygunlaşmış modelin grafiği verilerle uygun olarak verilmelidir ve böylelikle modelin uyumunun yeterliliği izlenebilir.(8)(18)(19)(20)

2. 
   LOEC tahmini için sonuçların analizi
   

Eğer test bütün derişim seviyelerinde yedek tanklar (tekrarlama) içeriyorsa, LOEC tahmini özgül büyüme hızı tank ortamalarının, 0.05 lik bir olasılık seviyesinde anlamlı fark için en düşük konsantrasyonu tanımlamada ki kontroller için ortalama r ile her bir konsantrasyon için ortalama r yi karşılaştıran uygun bir metot (örn. Dunnett veya William testi (12)(13)(14)(21) kullanılarak, varyans analizlerine (ANOVA) dayandırılmalıdır. Eğer parametrik metotlar için gerekli olan kabuller normal olmayan dağılımları (örn. Shapiro-Wilk testi) veya heterojen varyans (Barlett testi) verirse, ANOVA veya ağırlıklı ANOVA uygulanmadan önce verilerin homojen varyanslara dönüştürme zorunluluğuna önem verilmelidir.

Eğer test her bir konsantrasyonda tekrar tanklarını içermiyorsa, tanklara dayanan bir ANOVA duyarsız veya mümkün olmayacaktır. Bu durumda, kabul edilebilir bir uyuşma ANOVA’yı tekbir balık için yalancı büyüme hızı r₃ ‘e dayandırmaktadır.
Test konsantrasyonları için ortalama r₃ değeri kontrollerdeki r₃ değerleri ile karşılaştırılabilir. LOEC daha önceki gibi belirlenebilir. Bu yöntemde tanklar arasındaki değişikliğe karşı koruma sağlamadığının bilinmesi ve bunun ötesinde tek tek balıklardaki değişkenliğe karşı da koruma sağlamadığının bilinmesi gereklidir. Ancak tecrübeler göstermiştir ki (8), tank arasındaki değişkenliğin tank içi değişkenliğe (örn. balıklar arası) göre çok küçük olmaktadır. Eğer analizlerde tek tek balık kullanılmıyorsa, aykırı değer tanımlaması ve doğrulamasındaki yöntem onun kullanımını sağlamalıdır.

2. 
   Sonuçların yorumlanması
   

Sonuçlar çözeltilerde ölçülen toksik madde derişiminin analitik yöntemin tayin sınırı yakınında olması yada yarı-durağan testlerde test maddesinin derişimi yenilemeden önce ve taze hazırlanmış çözeltide düşüyorsa dikkatle yorumlanmalıdır.

3. 
   Test raporu
   

Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir.

1. 
   Test maddesi
   

• 
  Fiziksel doğası ve ilgili fizikokimyasal özellikler
  
• 
  Saflık ve test maddesinin miktar tayini için kullanılan analitik yöntem ile birlikte kimyasal tanımlama verisi
  

2. 
   Test türleri
   

• 
  Bilimsel adı
  
• 
  Alt ırk, büyüklüğü, tedarikçi, herhangi bir ön işlem yapılıp yapılmadığı,
  

3. 
   Test koşulları
   

• 
  Kullanılan test yöntemi ( iç akış yada yarı durağan yenileme, yükleme, muhafaza v.b.)
  
• 
  Test tasarımı (örneğin test hücrelerinin sayısı,kap başına düşen balık sayısı, test derişimleri ve tekrarları)
  
• 
  Stok çözeltilerin hazırlanma yöntemi ve yenileme sıklığı (çözünürleştirici ajan, kullanıldığında derişimi verilmelidir.)
  
• 
  Nominal test derişimleri, test kaplarındaki ölçülen değerlerin ortalaması ve onların standart sapmaları ve gerçek çözeltideki test maddesinin konsantrasyonlarına başvurulan ölçümlerin kanıtının elde edilmesini sağlayan metot.
  
• 
  Seyreltme suyunun özellikleri., pH, sertlik, sıcaklık, alkalinite, çözünmüş oksijen konsantrasyonu, kalıntı klor seviyesi(eğer ölçüldüyse), toplam organik karbon, asılı katılar, test ortamının tuzluluğu (eğer ölçüldüyse) ve yapılan diğer ölçümler
  
• 
  Test kaplarındaki su kalitesi, pH, sertlik, sıcaklık ve çözünmüş oksijen konsantrasyonu
  
• 
  Besleme hakkında ayrıntılı bilgi (besinin türü, kaynağı, verilen miktar ve sıklığı
  

4. 
   Sonuçlar
   

• 
  Sonuçların yaşama için gerekli olan ölçütleri sağladığının kanıtı, herhangi bir test derişimindeki ölüm oranı hakkında veriler
  
• 
  Kullanılan istatistiki analiz teknikleri, balık veya tekrarlara dayanan istatistikler, verilerin işlenmesi ve kullanılan tekniklerin doğrulaması
  
• 
  0, 14 (eğer ölçüydüyse) ve 28. günlerde herbir balık ve ortalama balık ağırlıklarına ilişkin tablolanmış veriler, tank ortalaması ve 0-28 ve 0-14 (eğer ölçüldüyse) ve tercihen 14-28. günler arası yalancı büyüme hızları
  
• 
  Tablosal ve grafiksel formda istatistiki analiz (regresyon analizi yada ANOVA) sonuçları LOEC (p=0.05) ve NOEC veya ECx değerleri mümkünse standart hataları ile
  
• 
  Balıklar tarafından gösterilen beklenmeyen tepkiler ve test maddesi tarafından sebep olunan gözlenebilir etkiler.
  

3. 
   KAYNAKLAR
   

1. 
   Solbe J.F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UKRing Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth rate of Fish. WRc Report No. PRD 1388-M/2.
   
2. 
   Ashley S., Mallett M.J. and Grandy N.J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
   
3. 
   Crossland N.O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pp 1855-1870.
   
4. 
   Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P.D., Market M., Munk R., Scholz N. and Höfte B.B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydaniorerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, pp 157 -164.
   
5. 
   Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
   
6. 
   Holcombe , G.W., Benoit D.A., Hammermeister, D.E., Leonard, E.N. and Johnson, R.D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes).Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, pp 287-297.
   
7. 
   Benoit, D.A., Holcombe, G.W. and Spehar, R.L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3 -91- 063. U. S. Environmental Protection Agency, Duluth, Minesota.
   
8. 
   Stephan C.E. and Rogers J.W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R C Bahner and D J Hansen, Eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, pp 328-338.
   
9. 
   Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rain bow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 p.
   
10. 
    Cox D.R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.
    
11. 
    Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 December 1991.
    
12. 
    Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, pp 1096-1121.
    
13. 
    Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, pp 482-491.
    
14. 
    Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose leve ls are compared with a zero dose control. Biometrics 27, pp 103-117.
    
15. 
    Johnston, W.L., Atkinson, J.L., Glanville N.T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchusmykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, 123-133.
    
16. 
    Quinton, J. C. and Blake, R.W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, 33-41.
    
17. 
    Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 P.
    
18. 
    Bruce, R.D. and Versteeg D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data . Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.
    
19. 
    DeGraeve, G.M., Cooney, J.M., Pollock, T.L., Reichenbach, J.H., Dean, Marcus, M.D. and McIntyre, D.O. (1989). Precision of EPA seven -day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. report EA -6189 (American Petroleum Institute Publication, n. 4468). Electric Power Research Institute, Palo alto, CA.
    
20. 
    Norbert -King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 pp.
    
21. 
    Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, pp 510 -531.
    

Ek-I

Test için önerilen balık türleri ve uygun test şartları

Türler	Önerilen test sıcaklığı aralığı (°C)	Işıklandırma periyodu (saat)	Başlangıç balık ağırlığı için önerilen aralık (g)	İstenilen ölçüm kesinliği	Yükleme Hızı (g/L)	Depolama yoğunluğu (litre başına)	yiyecek	Test süresi
Önerilen türler
Oncorhynchus Mykiss gökkuşağı alabalığı	12.5-16	12-16	1-5	En yakın 100 mg	1.2-2.0	4	Uygun, kızartılmış somon yiyeceği	>28
Diğer iyi belgelenmiş türler
Danio rerio zebrabalığı	21-25	12-16	0.050-0.100	En yakın 1 mg	0.2-1.0	5-10	Canlı yiyecek (Brachionus Artemia)	>28
Oryzias latipes pirinç balığı	21-25	12-16	0.050-0.100	En yakın 1 mg	0.2-1.0	5-20	Canlı yiyecek (Brachionus Artemia)	>28

Ek-II

Seyrelme suyunun bazı kabul edilebilir kimyasal özellikleri

MADDE	DERİŞİMLER
Partikül halindeki madde	<20 mg/L
Toplam organik karbon	<2 mg/L
İyonlaşmamış amonyak	<1 μg/L
Kalıntı klor	<10 μg/L
Toplam fosforlu organik pesitisit	<50 ng/L
Toplam klorlu organik pestisit + poliklorlu bifeniller	<50 ng/L
Toplam organik klor	<25 ng/L

Ek-III
Toksisite testi için uygun derişimlerin logaritmik serisi

Kolon ( 100 ile 10 yada 10 ile 1 arasındaki derişimlerin sayısı)*
1	2	3	4	5	6	7
100	100	100	100	100	100	100
32	46	56	63	68	72	75
10	22	32	40	46	52	56
3.2	10	18	25	32	37	42
1.0	4.6	10	16	22	27	32
	2.2	5.6	10	15	1+	24
	1.0	3.2	6.3	10	14	18
		1.8	4.0	6.8	10	13
		1.0	2.5	4.6	7.2	10
			1.6	3.2	5.2	7.5
			1.0	2.2	3.7	5.6
				1.5	2.7	4.2
				1.0	1.9	3.2
					1.4	2.4
					1.0	1.8
						1.3
						1.0

*Bir kolondan beş yada daha fazla ardışık derişim seçilebilir. X kolonundaki derişimlerin orta noktaları arasın (2x+1) olarak bulunmuştur. Listedeki değerlerin ifade ettiği derişimler yüzde hacim yada yüzde ağırlık olarak ifade edilir.(mg/l yada μg/l). Değerler gerektiğinde herhangi 10 kuvveti bölünüp çarpılabilir. Kolon 1 toksisite seviyesine dikkate değer bir belirsizlik varsa kullanılabilir.