FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

Ek- III

Ortam
L. minor ve L. gibba için farklı büyüme ortamları tavsiye edilir. L. minör için modifiye edilmiş İsveç Standardı (SIS) ortamı tavsiye edilir iken, L. gibba için 20X AAP ortamı tavsiye edilir. Her iki ortamın bileşimi aşağıda verilmektedir. Bu ortamları hazırlar iken, belirteç ya da analitik saflıktaki kimyasallar ve deiyonize su kullanılmalıdır.

İsveç Standardı (SIS) Lemna büyüme ortamı

— Stok çözeltileri I-V, otoklavlama (120 oC, 15 dakika) ile ya da membran filtrasyonu (yaklaşık olarak 0,2 μm gözenek büyüklüğü) ile steril hale getirilir.

— Stok VI (ve isteğe bağlı olarak VII) sadece membran filtrasyonu ile steril hale getirilir, bunlar otoklavlanmamalıdır.

— Steril stok çözeltileri serin ve karanlık koşullar altında depolanmalıdır. Stok VI (ve isteğe bağlı olarak VII) bir aylık raf ömrüne sahip iken, stok I – V, altı aydan sonra atılmalıdır.

Stok çözelti No.	Madde	Stok çözeltideki derişim (g∙l^–1)	Hazırlanmış ortamdaki derişim (mg∙l^–1)	Hazırlanan ortam
				Element	Derişim (mg∙l^–1)
I	NaNO3 KH2PO4	8,50 1,34	85 13,4	Na; N K; P	32; 14 6,0; 2,4
II	MgSO4 ∙ 7H2O	15	75	Mg; S	7,4; 9,8
III	CaCl2 ∙ 2H2O	7,2	36	Ca; Cl	9,8; 17,5
IV	Na2CO3	4,0	20	C	2,3
V	H3BO3 MnCl2 ∙ 4H2O Na2MoO4 ∙ 2H2O ZnSO4 ∙ 7H2O CuSO4 ∙ 5H2O Co(NO3)2 ∙ 6H2O	1,0 0,20 0,010 0,050 0,0050 0,010	1,00 0,20 0,010 0,050 0,0050 0,010	B Mn Mo Zn Cu Co	0,17 0,056 0,0040 0,011 0,0013 0,0020
VI	FeCl3 ∙ 6H2O Na2-EDTA∙2H2O	0,17 0,28	0,84 1,4	Fe —	0,17 —
VII	MOPS (tampon)	490	490	—	—

— Bir litre SIS ortamı hazırlamak için, 900 ml deiyonize suya aşağıdakiler eklenir:

— 10 ml stok çözelti I

— 5 ml stok çözelti II

— 5 ml stok çözelti III

— 5 ml stok çözelti IV

— 1 ml stok çözelti V

— 5 ml stok çözelti VI

— 1 ml stok çözelti VII (isteğe bağlı olarak)

Not: Belirli test maddeleri için daha fazla stok çözelti VII (MOPS tampon) gerekli olabilir (bkz. bölüm 1.4, son paragraf).

— pH 0,1 ya da 1 mol HCI ya da NaOH ile 6,5 ± 0,2’ye ayarlanır ve hacim, deiyonize su ile bir litreye tamamlanır.
20X AAP büyüme ortamı
Stok çözeltiler, steril damıtık ya da deiyonize su içinde hazırlanır.

Steril stok çözeltiler serin ve karanlık koşullar altında depolanmalıdır. Bu koşullar altında stok çözeltilerin en az 6-8 hafta raf ömrü olacaktır.

Beş besin stok çözeltisi (A1, A2, A3, B ve C) 20X – AAP ortamı için, belirteç kalitesindeki kimyasallar kullanılarak hazırlanır. Büyüme ortamı oluşturmak için yaklaşık 850 ml deiyonize suya her besin stok çözeltisinin 20 ml’si, ilave edilir. pH 0,1 ya da 1 mol HCI ya da NaOH ile 7,5 ± 0,1’e ayarlanır ve hacim, deiyonize su ile bir litreye tamamlanır. Daha sonra ortam, 0,2 μm (yaklaşık olarak) membran filtreden geçirilerek steril haldeki kaba filtre edilir.

Teste yönelik büyüme ortamı, pH’ın kararlı hale gelmesine olanak sağlamak amacıyla kullanımdan 1-2 gün önce hazırlanmalıdır. Büyüme ortamının pH’ı, kullanımdan önce kontrol edilmelidir ve eğer gerekli ise yukarıda açıklandığı gibi 0,1 ya da 1 M NaOH ya da HCl eklenerek yeniden ayarlanmalıdır.

Stok çözelti No.	Madde	Stok çözeltideki derişim(g∙l^–1) (*)	Hazırlanan ortamdaki derişim (mg∙l^–1) (*)	Hazırlanan ortam
				Element	Derişim (mg∙l^–1) (*)
A1	NaNO3 MgCl2∙6H2O CaCl2∙2H2O	26 12 4,4	510 240 90	Na; N Mg Ca	190; 84 58,08 24,04
A2	MgSO4∙7H2O	15	290	S	38,22
A3	K2HPO4∙3H2O	1,4	30	K; P	9,4;3,7
B	H3BO3 MnCl2∙4H2O FeCl3∙6H2O Na2EDTA∙2H2O ZnCl2 CoCl2∙6H2O Na2MoO4∙2H2O CuCl2∙2H2O	0,19 0,42 0,16 0,30 3,3 mg∙l^–1 1,4 mg∙l^–1 7,3 mg∙l^–1 0,012 mg∙l^–1	3,7 8,3 3,2 6,0 66 μg∙l^–1 29 μg∙l^–1 145 μg∙l^–1 0,24 μg∙l^–1	B Mn Fe - Zn Co Mo Cu	0,65 2,3 0,66 — 31 μg∙l^–1 7,1 μg∙l–1 58 μg∙l–1 0,080 μg∙l^–1
C	NaHCO3	15	300	Na; C	220; 43
(*) Belirtilmemiş ise
Dipnot: Teorik olarak uygun final bikarbonat derişimi (pH ayarlamasını kayda değer bir şekilde önleyecek şekilde) 15 mg/l’dir; 300 mg/l değildir. Ancak bu yöntem için dolanıö testini de içeren 20X-AAP ortamın geçmişteki kullanımı300 mg/l’ye dayanır. (I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R & D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.

STEINBERG ortamı (ISO 20079’dan sonra)
Derişimler ve stok çözeltiler

— Modifiye edilmiş Steinberg ortamı, ISO 20079’da sadece Lemna minör için (orada sadece Lemna minor’a izin verildiğinden) kullanılır, ancak iyi sonuçlar gösteren testlere Lemna gibba ile de ulaşılabilir.

— Ortam hazırlanır iken belirteç ya da analitik kalitede kimyasallar ve deiyonize su kullanılmalıdır.

— Stok çözeltilerden ya da çökme olmadan en yüksek ortam derişimine olanak sağlayan 10 kat konsantre edilmiş ortamdan besin ortamı hazırlanır.

Tablo 1
pH-kararlı hale getirilmiş STEINBERG ortamı (Altenburger’e modifiye edilmiş acc.)

Madde	Besin ortamı
Makroelementler	mol ağırlığı			mg/l		mmol/l
KNO3	101,12		350,00			3,46
Ca(NO3)2 ∙ 4H2O	236,15		295,00			1,25
KH2PO4	136,09		90,00			0,66
K2HPO4	174,18		12,60			0,072
MgSO4 ∙ 7H2O	246,37		100,00			0,41
Mikroelementler	mol ağırlığı			µg/l		µmol/l
H3BO3		61,83			120,00		1,94
ZnSO4 ∙ 7H2O		287,43			180,00		0,63
Na2MoO4 ∙ 2H2O		241,92			44,00		0,18
MnCl2 ∙ 4H2O		197,84			180,00		0,91
FeCl3 ∙ 6H2O		270,21			760,00		2,81
EDTA Disodyum-dihidrat		372,24			1 500,00		4,03

Tablo 2

Stok çözeltiler (Makro elementler)

1. Makro elementler (50-kat konsantre edilmiş)	g/l
Stok çözelti1: KNO3 KH2PO4 K2HPO4	17,50 4,5 0,63
Stok çözelti2: MgSO4 ∙ 7H2O	5,00
Stok çözelti3: Ca(NO3)2 ∙ 4H2O	14,75

Tablo 3

Stok çözeltiler (Mikro elementler)

2. Mikro elementler (50-kezkonsantre edilmiş)	mg/l
Stok çözelti 4: H3BO3	120,0
Stok çözelti 5: ZnSO4 ∙ 7H2O	180,0
Stok çözelti6: Na2MoO4 ∙ 2H2O	44,0
Stok çözelti7: MnCl2 ∙ 4H2O	180,0
Stok s çözelti8: FeCl3 ∙ 6H2O EDTA disodyum-dihidrat	760,00 1 500,00

— Stok çözeltiler 2 ve 3 ve ayrı olarak 4 ila 7 toplanabilir (gereken derişimleri göz önünde bulundurarak).

— Daha uzun raf ömrü için stok çözeltiler 121 oC’de 20 dakika otoklav içinde muamele edilir ya da alternatif olarak steril filtrasyon (0,2 µm) yürütülür. Stok çözelti 8 için steril filtrasyon (0,2 µm) şiddetle tavsiye edilir.
STEINBERG ortamının final derişiminin hazırlanması (modifiye edilmiş)
— Çökmeyi önlemek amacıyla yaklaşık 900 ml deiyonize suya 20 ml stok çözelti 1, 2 ve 3 (bkz. tablo 2) eklenir.

— 1,0 ml stok çözelti 4, 5, 6, 7 ve 8 eklenir (bkz. tablo 3).

— pH 5,5 ± 0,2 olmalıdır (NaOH çözeltisi ya da HCl nin en düşük hacminin eklenmesi ile ayarlama yapılır).

— Su ile 1 000 ml’e ayarlanır.

— Eğer stok çözeltiler steril hale getirilmiş ve uygun su kullanılmış ise başka bir sterilizasyon gerekli değildir. Eğer final ortam ile sterilizasyon yapılmış ise stok çözelti 8 otoklavlamadan sonra (121 ^oC de 20 dakika) eklenmelidir.
Geçici depolama için 10 kat konsantre edilmiş STEINBERG ortamı (modifiye edilmiş) hazırlanması
— Çökmeyi önlemek amacıyla yaklaşık 30 ml suya 20 ml stok çözelti 1, 2 ve 3 (bkz. tablo 2) eklenir.Tetiklemeden kaçınmak için yaklaşık 30 ml deiyonize suya stok çözelti 1, 2 ve 3’ün (bkz. tablo 2) 20 ml’i eklenir.

— 1,0 ml stok çözelti 4, 5, 6, 7 ve 8 (bakınız tablo 3) eklenir. Su ile 100 ml’e ayarlanır.

— Eğer stok çözeltiler steril hale getirilmiş ve uygun su kullanılmış ise başka bir sterilizasyon gerekli değildir. Eğer final ortam ile sterilizasyon yapılmış ise stok çözelti 8 otoklavlamadan sonra (121 ^oC de 20 dakika) eklenmelidir.

— Ortam pH’ı (final derişim) 5,5 ± 0,2 olmalıdır.

1^Örnek olarak BM taşıma yönetmeliklerinde olduğu gibi.

2^Asit, testler yapılmadan önce derişiminden emin olmak amacıyla titre edilir.

3^Örneğin, referans 1’de % 50 (ağırlık/ağırlık) perklorik acid ve % 40 (ağırlık/ağırlık) sodyum klorat kullanılmıştır

1^Örneğin Whatman Kolon kromatografik selüloz toz CF11, katalog No: 4021050

2^ Karl-Fisher (örneğin) titrasyonu tarafından onaylanan

3^ Alternatif olarak belirlenen su miktarına(örneğin) vakum altında 24 saat boyunca 105 derecede ısıtılarak ulaşılabilinir.

1^Oksitleyicilerin, sellüloz ile olan karışımları potansiyel patlayıcı olarak işleme tabi tutulmalı ve buna göre elleçlenmelidir.

2^Pratikte bu, deneme esnasında kullanılacak miktardan daha çok test edilecek sıvı, sellüloz bire bir karışımı hazırlanıp basınç kabına 5±0.1 g yerleştirmekle başarılabilinir. Karışım her deneme için taze hazırlanmalıdır.

1^ Özellikle bobinin bitişik sarmalları arasında temas önlemmelidir.

1^BM taşıma yönetmeliklerinin içinde bulunan, çeşitli referans madde kullanıldığında sonuçların yorumlanması hakkında bilgi veren referans 1’e bakınız

1^() Bu büyütme değeri, 3 µm fiberler için belirlenir, 6 µm fiberler için × 5000 büyütme daha uygun olabilir.

1^() 3 μm fiberler için, önceki nota bakınız.

1^Serum ve plazmadaki bir dizi ölçüm için, özellikle de glukozda, gece boyunca aç bırakma tercih edilecektir. Bu tercih için temel neden, kaçınılmaz olarak aç kalmamaktan kaynaklanan artan değişkenliğin daha sinsi etkileri maskeleme eğilimi yaratması ve yorum yapılmasını zorlaştırmasıdır. Diğer taraftan, gece boyunca aç kalınması hayvanların genel metabolizmalarıyla etkileşebilir ve özellikle beslenme çalışmalarında, test maddesine günlük maruziyeti etkileyebilir. Eğer gece boyunca açlığa uyum sağlanmışsa klinik biyokimyasal belirlemeler çalışmanın 4. haftasında fonksiyonel gözlemlerden sonra yapılmalıdır.

1^ Serum ve plazmadaki bir dizi ölçüm özellikle de glikoz için, hayvanların bir gece aç bırakılması tercih edilecektir. Bu tercih için asıl neden açlık olmaması durumunda değerin artmasıdır, bu artış da derideki etkileri maskeleyecek ve yorum yapılmasını zorlaştıracaktır. Diğer taraftan, gece boyunca aç bırakılma hayvanların genel metabolizmasını etkileyebilir ve özellikle de beslenmeyle ilgili çalışmalarda, test maddesinin günlük alımını aksatabilir. Eğer gece boyunca aç bırakma benimsenirse, klinik biyokimyasal belirlemeler çalışmadaki fonksiyonel gözlemler yürütüldükten sonra yapılmalıdır.