FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

VERİLER

1. 
   Sonuçların işlenmesi
   

Deneysel birim hücre olduğundan yapısal kromozom bozukluğuna sahip hücrelerin yüzdeler hesaplanmalıdır. Deneysel ve kontrol kültürler için farklı tipteki yapısal kromozom bozuklukları sayı ve tekrarlanma sıklıkları ile birlikte listelenmelidir. Boşluklar ayrıca kaydedilir ve rapor edillir ancak genellikle toplam bozukluk sıklığında yer almazlar.

Belli başlı bozukluk deneylerindeki tüm muamele edilen kültürler ve negatif kontrol kültürler için sitotoksisitenin eş zamanlı ölçümleri ayrıca kaydedilmelidir.
Kültürlerle ilgili veriler ayrı ayrı sağlanmalıdır. İlaveten, bütün veriler tablo halinde özetlenmelidir. Net bir pozitif cevabın doğrulanmasına gerek yoktur. Belirsiz sonuçlar ilave testlerle, tercihen deneysel koşullar modifiye edilerek, netleştirilmelidir. Negatif sonuçların teyit edilmesi ihtiyacı 1.4.3.3’te tartışılmıştır. Takip eden deneylerde çalışma parametrelerinin modifikasyonu, değerlendirilen koşulların aralıklarının genişletilmesi, üzerinden düşünülmelidir. Derişim aralıkları ve metabolik aktivasyon koşulları değişiklik yapılabilecek çalışma parametreleri arasındadır.

2. 
   Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumlanması
   

Pozitif sonuç tayin etmek için derişime bağlı artış veya kromozomu bozulmuş hücrelerin sayısında tekrar eden artış gibi bazı ölçütler vardır. Sonuçlar ilk önce biyolojik açıdan değerlendirilmelidir. İstatistiksel yöntemler, test sonuçlarını değerlendirirken yardımcı olarak kullanılabilir (3)(13). İstatistiksel anlamlılık pozitif bir cevap için tek belirleyici etken olmamalıdır.

Poliploid hücre sayısındaki artış test maddesinin mitotik süreci inhibe etme ve sayısal kromozomları harekete geçirme potansiyeli olduğuna işaret edebilir. Endoredublikasyonlu kromozomlu hücrelerin sayısındaki artış test maddesinin hücre döngüsünün devamını inhibe etme potansiyeli olduğunu gösterir(17)(18). Yukarıdaki ölçütleri karşılamayan sonuçları olan bir test maddesinin bu sistemde mutajenik olmadığı düşünülür.
Her ne kadar pek çok deney açık pozitif ya da negatif sonuçlar verecekse de, nadir durumlarda veri kümeleri test maddesinin aktivitesi hakkında net bir karar verilmesine engel olabilir. Sonuçlar deneyin tekrarlanma sayısından bağımsız olarak şüpheli ve belirsiz olabilir.
İn vitro kromozom bozukluk testinden elde edilen pozitif sonuçlar, test maddesinin kültürlenmiş memeli somatik hücrelerinde yapısal kromozom bozukluğuna yol açtığına işaret eder. Negatif sonuçlar test koşulları altında test maddesinin kültürlenmiş memeli somatik hücrelerinde kromozom bozukluğuna yol açmadığına işaret eder.

3. 
   RAPORLAMA
   

1. 
   Test raporu
   

Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir:

Çözücü/Taşıyıcı

• 
  taşıyıcı seçimi için gerekçe;
  
• 
  eğer biliniyorsa, test maddesinin çözücü/taşıyıcı içindeki çözünürlüğü ve kararlılığı;
  

Hücreler:

• 
  hücrelerin kaynağı ve türü;
  
• 
  karyotip özellikleri ve kullanılan hücre tipinin uygunluğu;
  
• 
  eğer uygulanabiliyorsa, mikoplazmanın yokluğu;
  
• 
  hücre döngüsü uzunluğu bilgisi;
  
• 
  kan verenlerin cinsiyeti, tam kan veya ayrılan lenfositler, kullanılan mitojen;
  
• 
  uygulanabiliyorsa, parça sayısı;
  
• 
  uygulanabiliyorsa, hücre kültürü elde etme yöntemleri;
  
• 
  kromozomların tipik sayısı (verilen bir hücre dizisindeki her bir hücrenin kromozomlarının toplam sayısı)
  

Test koşulları:

• 
  metafaz-durdurucu maddelerin tanımlanması, derişimi ve hücrenin maruz kalma süresi;
  
• 
  derişimler ve içerilen kültür sayısı için gerekçe örneğin, varsa, sitotoksisitesi verileri ve çözünürlük sınırlamaları;
  
• 
  ortamın bileşimi, uygulanabiliyorsa CO2 derişimi;
  
• 
  test maddesinin derişimi;
  
• 
  taşıyıcının ve eklenen test maddesinin hacmi;
  
• 
  inkübasyon sıcaklığı;
  
• 
  inkübasyon süresi;
  
• 
  muamele süresi;
  
• 
  eğer uygunsa, ekim sırasındaki hücre yoğunluğu;
  
• 
  kabul edilebilirlik kriteri de dahil, metabolik aktivasyonun türü ve bileşimi;
  
• 
  pozitif ve negatif kontroller;
  
• 
  lam hazırlama yöntemleri;
  
• 
  skorlamak ve derecelendirmek için kriterler;
  
• 
  analiz edilen metafaz sayısı;
  
• 
  toksisite ölçümleri için yöntemler;
  
• 
  çalışmaların negatif, pozitif veya belirsiz olup olmadığının anlaşılma ölçütleri
  

Sonuçlar:

• 
  toksiste belirtileri, örneğin, akıcı olmama derecesi, hücre döngüsü verileri, hücre sayımları, mitotik indeks;
  
• 
  çökelme belirtileri;
  
• 
  eğer belirlenebiliyorsa, muamele ortamının ozmolalite ve pH verileri;
  
• 
  bozukluk için tanımlar, gaplar dahildir;
  
• 
  hem muamele edilen hem de kontrol kültürler için ayrı ayrı kromozom bozukluğu olan hücre sayısı ve kromozom bozukluğu tipi;
  
• 
  Eğer görülebiliyorsa, plodideki değişikler;
  
• 
  doz/cevap ilişkisi, mümkün yerlerde;
  
• 
  varsa, istatistiksel analizler;
  
• 
  eş zamanlı negatif (çözücü/taşıyıcı) ve pozitif kontrol verileri
  
• 
  tarihsel negatif (çözücü/taşıyıcı) ve pozitif kontrol verileri, aralık, ortalama ve standard sapmalarla birlikte
  

Sonuçların tartışılması.

Yorumlar

4. 
   KAYNAKLAR
   

1. 
   Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29.
   
2. 
   Ishidate, M.Jr. and Sofuni, T. (1985). The in Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, 427-432.
   
3. 
   Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl.10), 1-175.
   
4. 
   Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res,. 257, 147-204.
   
5. 
   Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.
   
6. 
   Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.
   
7. 
   Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173-215.
   
8. 
   Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.
   
9. 
   Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, 277-290.
   
10. 
    Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254- induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, 175-177.
    
11. 
    Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
    
12. 
    Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr., Ivett, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, 241-261.
    
13. 
    Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
    
14. 
    Soper, K.A. and Galloway, S.M. (1994). replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, 139-149.
    
15. 
    Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.
    
16. 
    Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, 795-801.
    
17. 
    Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, 403-413.
    
18. 
    Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin - induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.
    

B.11 MUTAJENİTE - İN VİVO MEMELİ KEMİK İLİĞİ KROMOZOM BOZUKLUĞU TESTİ

1. 
   YÖNTEM
   

Bu yöntem OECD TG 475, Memeli Kemik İliği Kromozom Bozukluğu Testi (1997)’nin tekrarıdır.

1. 
   Giriş
   

Canlı organizmada (In vivo) memeli kromozomal bozukluk testi, hayvanların, genellikle de kemirgenlerin kemik iliklerinde test maddesiyle uyarılmış yapısal kromozom bozukluklarının belirlenmesinde kullanılır (1)(2)(3)(4). Yapısal bozukluklar kromozom veya kromatid olarak iki tip olabilir. Poliploidideki artış, kimyasalın sayısal bozuklukları uyarma potansiyeli olduğuna işaret eder. Kimyasal mutajenlerin çoğuyla kromatid tipi bozukluklar uyarılır, ancak kromozom tipi bozukluklar da meydana gelir. Kromozom mutasyonları ve buna bağlı olaylar insandaki pek çok genetik hastalığın nedenidir ve onkogenlerde ve tümör baskılayıcı genlerde değişikliklere neden olan kromozom mutasyonları ve ilgili olayların, insanlar ve deney hayvanlarında kansere yol açtığına dair önemli kanıtlar mevcuttur.

Bu testte rutin olarak kemirgenler kullanılır. Kemik iliği bu testteki hedef dokudur, damarlı bir doku olduğundan ve döngüsünü hızlı bir şekilde tamamlayan hücre popülasyonu içerdiğinden kolayca izole edilip, işlenebilir. Diğer türler ve hedef dokular bu yöntemin konusu değildir.
Bu kromozom bozukluk testi, özellikle, her ne kadar tüm bunlar türler ve dokular arasında çeşitlilik gösterse de, mutajenik zararın ve buna bağlı olarak in vivo metabolizma etkenlerinin, farmakokinetiğin ve DNA onarım sürecinin değerlendirilmesini amaçlar. Bir canlı organizma içindeki (in vivo) test ayrıca, yapay ortamdaki (in vitro) testlerle belirlenen mutajenik etkilerin daha sonraki araştırmaları için faydalıdır.
Eğer test maddesinin veya reaktif metabolitinin hedef dokuya ulaşamadığına dair kanıt mevcutsa, bu testi kullanmak uygun değildir.
Ayrıca bakınız Bölüm B Genel Giriş (A).

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

Kromatid-tipi bozukluk: Yapısal kromozom hasarı, tekli kromatid kırılması veya kromatidler arası kırılma ve birleşme olarak ifade edilir.

Kromozom-tipi bozukluk: Yapısal kromozom hasarı, özdeş bir konumdaki her iki kromatitin kırılması veya kırılması ve birleşmesi olarak ifade edilir.
İki katına çıkarma (Endoreduplikasyon): DNA çoğalmasının S fazından sonraki bir işlemdir, çekirdek mitoza uğramaz fakat başka bir S fazı süreci başlatır. Sonuç 4, 8, 16, . . .kromatidli kromozomlardır.
Boşluk: bir kromatidin genişliğinden daha küçük genişlikte ve en az yanlış dizilimli kromatid bir akromatik doku bozulmasıdır.
Sayısal bozukluk: kullanılan hücrelerin normal kromozom sayısındaki değişim
Poliploidi: haploid (tek kromozomlu yapı) kromozom sayısının (n) diploid sayıdan başka bir sayıyla çarpımı (ör. 3n, 4n.....).
Yapısal bozukluk: Kromozom yapısında, hücre bölünmesinin metafaz aşamasının mikroskobik incelemeyle saptanabilen değişikliktir; delesyonlar, fragmanlar, ara ve iç değişiklikler olarak gözlenir.

3. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Hayvanlar test maddesine uygun bir yolla maruz bırakılırlar ve muamele sonrasındaki uygun zamanlarda feda edilirler. Bu durumun öncesinde hayvanlar bir metafaz-durdurucu madde ile (kolşisin veya Kolsemid) muamele edilir. Daha sonra kemik iliği hücrelerinden kromozom hazırlıkları yapılır ve boyanır, kromozom bozuklukları için metafaz hücreleri analiz edilir.

4. 
   Test yönteminin tanımlanması
   

1. 
   Hazırlıklar
   

1. 
   Hayvan türünün seçimi
   

Her ne kadar uygun herhangi bir memeli türü kullanılabilirse de sıçanlar, fareler ve Çin hamsterları yaygın olarak kullanılır. Genç, sağlıklı, erişkin hayvanların yaygın olarak kullanılan laboratuvar suşları kullanılmalıdır. Çalışmanın başlangıcında, hayvanlardaki ağırlık değişkenliği aralığı her iki cinsiyet için de, uygun ortalama değerin % 20’sini geçmemelidir.

2. 
   Barınma ve beslenme koşulları
   

Genel koşullar, Genel Giriş Kısım B’de belirtildiği şekilde uygulanır, nem % 50–60 arasında olmalıdır.

3. 
   Hayvanların hazırlanması
   

Sağlıklı genç erişkin hayvanlar rastgele kontrol ve muamele gruplarına ayrılırlar. Kafesler yerleştirilmelerinden kaynaklanacak olası etkileri en az indirecek şekilde yerleştirilirler. Hayvanlar ayrı ayrı kimliklendirilirler. Hayvanlar en az beş gün öncesinden laboratuvar koşullarına alıştırılırlar.

4. 
   Dozların hazırlanması
   

Eğer uygunsa, hücreler muamele edilmeden önce, katı test maddeleri uygun çözücüler veya taşıyıcılar içinde çözülmeli veya askıda kalmalı ve seyreltilmelidir.. Sıvı test maddeleri muameleden önce test sistemine doğrudan eklenebilirler veya seyreltilebilirler. Kararlılığıyla ilgili veriler saklanmasının uygun olduğunu göstermedikçe test maddesinin taze hazırlanmış olanları uygulanmalıdır.

2. 
   Test koşulları
   

1. 
   Çözücü/Taşıyıcı
   

Çözücü/taşıyıcı kullanılan doz seviyelerinde toksik etki meydana getirmemelidir ve test maddesiyle kimyasal reaksiyona gireceğinden şüphe duyulmamalıdır. Eğer çok iyi bilinen çözücüler/taşıyıcılar dışındakiler kullanılırsa içerikleri uyumlu olduklarını gösteren verilerle desteklenmelidir. Uygun olan her yerde önce sulu çözelti/taşıyıcı kullanılmasının düşünülmesi tavsiye edilir.

2. 
   Kontroller
   

Eş zamanlı pozitif ve negatif (çözücü/taşıyıcı) kontroller, her bir cinsiyet için her bir deneyde de yer almalıdır. Test maddesiyle muamele haricinde, kontrol grubundaki hayvanlar, muamele grubundaki hayvanlarla eşit şartlarda tutulmalıdırlar.

Pozitif kontroller, arka planda belirlenebilen artışlar göstermesi beklenen maruz kalma seviyelerinde canlı organizma içinde (in vivo) yapısal bozukluklar meydana getirmelidir. Pozitif kontrol dozları etkilerin açıkça görülebileceği şekilde seçilmelidir, fakat işaretli lamların özdeşliği okuyucu tarafından hemen ortaya çıkarılmaz. Test maddesinin uygulandığından daha farklı şekilde uygulanan pozitif kontrol kabul edilebilirdir ve sadece tek seferde örnekleme yapılır. Mevcut olduğu durumlarda, kimyasal sınıfla ilişkili pozitif kontrol kimyasallarının kullanımı üzerinde durulmalıdır.
Pozitif kontrol madde örnekleri :

Madde	CAS No.	EINECS No.
Etil metansülfonat	62-50-0	200-536-7
Etil nitroz üre	759-73-9	212-072-2
Mitomisin C	50-07-7	200-008-6
Siklofosfamid Siklofosfamid monohidrat	50-18-0 6055-19-2	200-015-4
Trietilenmelamin	51-18-3	200-083-5

Tek başına çözücüyle veya taşıyıcıyla muamele edilmiş olan ve bunun dışında uygulama gruplarıyla aynı şekilde muamele edilen negatif kontroller, hayvanlar arasındaki kabul edilebilir çeşitlilik ve kromozom bozukluklarına sahip hücre sıklıkları, geçmişe yönelik kontrol verilerden elde edilemediği sürece, her örnekleme zamanı için dâhil edilmelidir. Eğer negatif kontroller için tek bir örnekleme uygulanacaksa, en uygun zaman ilk örnekleme zamanıdır. Ek olarak, seçilen çözücü/taşıyıcı tarafından uyarılmış hiç bir zararlı veya mutajenik etki olmadığını gösteren geçmişe yönelik veya yayınlanmış kontrol verileri yoksa, muamele edilmemiş kontroller de kullanılabilir. .

5. 
   İşlem
   

1. 
   Hayvanların sayı ve cinsiyetleri
   

Her bir muamele ve kontrol grubu cinsiyet başına en az 5 analiz edilebilir hayvan içermelidir. Eğer çalışma sırasında aynı tür içi ve aynı maruz kalma yolu uygulanarak yapılan çalışmalardan elde edilebilir veriler varsa, bu durum cinsiyetler arasında önemli farklılıkların bulunmadığını gösterir, o zaman tek bir cinsiyette test uygulanması yeterli olacaktır.

İnsanlarda kimyasallara maruz kalma cinsiyete özgü olabildiğinden, örneğin bazı farmasötik etkenlerle, test uygun cinsiyetteki hayvanlarla uygulanmalıdır.

2. 
   Uygulama planı
   

Test maddeleri tercihen tek işlemde uygulanır. Test maddesi ayrıca büyük hacimli maddenin uygulanmasını kolaylaştırmak amacıyla, örn. aynı gündeki iki muamele birkaç saati geçmeyecek şekilde ayrılabilir, bölünmüş dozlar halinde uygulanabilir. Diğer doz düzeyleri bilimsel olarak gerekçelendirilmelidir.

Örnekler muameleyi takiben bir gün içindeki iki farklı zamanda alınmalıdır. Kemirgenler için muameleyi takip eden ilk örnekleme 1,5 normal hücre döngüsü uzunluğudur. Test maddesinin alınması ve metabolizması için zamana gerek duyulmasının yanında, test maddesinin hücre döngüsü kinetiği üzerindeki etkileri kromozom bozukluğunu belirlemeleri için gereken en uygun süreyi de etkileyebileceğinden, ilk örnekten 24 saat sonra ikinci bir örnek alınması tavsiye edilir. Eğer doz düzeyleri birden fazla günde uygulanıyorsa, en son muameleden sonra 1,5 normal hücre döngüsü uzunluğunda, bir örnek alma süresi kullanılmalıdır.
Feda edilmeden önce, hayvanlara uygun dozda metafaz durdurucu madde (ör. Colcemid^ veya kolşisin) karın içine enjekte edilir. Daha sonra uygun aralıklarla hayvanlardan örnek alınır. Fareler için bu aralık yaklaşık 3-5 saattir; Çin hamsterları için bu aralık yaklaşık 4-5 saattir. Hücreler kemik iliğinden toplanır ve kromozom bozuklukları için analiz edilirler.

3. 
   Doz-seviyeleri
   

Eğer elde hiç uygun veri bulunmadığı için bir aralık bulma çalışması yürütülürse, temel çalışmada kullanılanla aynı laboratuvar, aynı suş, cinsiyet ve muamele düzeyi kullanılarak yürütülmelidir (5). Eğer toksisite varsa, ilk örnek alma zamanı için üç doz kullanılmalıdır. Bu doz seviyeleri maksimumla çok az toksisitenin olduğu veya hiç toksisitenin olmadığı aralığın içinde olmalıdır. Daha sonraki örnek alma zamanında sadece en yüksek dozun kullanılması gerekir. En yüksek doz, toksik belirtilerinin oluşmaya başladığı doz olarak tanımlanır öyle ki daha yüksek doz seviyelerinin, aynı doz uygulama düzeyine dayanarak, ölüme neden olması beklenir. Düşük seviyeli toksik olmayan dozlarda özel biyolojik aktivite gösteren hormonlar ve mitojenler gibi maddeler doz belirleme ölçütlerinde istisna olabilir ve tek başına değerlendirilmelidir. Ayrıca en yüksek doz, kemik iliğinde (ör. Mitotik indekste % 50’den fazla azalma) bazı toksik belirtileri meydana getiren doz olarak da tanımlanabilir.

4. 
   Sınır testi
   

Eğer 2000 mg/kg vücut ağırlığı doz seviyeli bir sınır testi tek doz veya aynı günde iki muamele olarak uygulandığında gözlenebilen herhangi bir toksik etki meydana getirmiyorsa ve eğer yapısal olarak benzer maddelerle ilgili genotoksisite (genetik toksisite) beklenmiyorsa bu durumda üç doz kullanılarak yapılacak kapsamlı bir çalışmaya gerek olmayabilir. Uzun süreli çalışmalarda, 14 güne kadar olan muameleler için sınır doz 2000 mg/kg/vücut ağırlığı/gün; 14 günden daha uzun süreli muamelelerde 1000 mg/vücut ağırlığı/gün’dür. İnsanda beklenen maruz kalma, sınır testinde daha fazla dozun kullanılması gerektiğine işaret edebilir.

5. 
   Dozların uygulanması
   

Test maddesi genellikle gavaj yöntemi kullanılarak sonda ile beslemeyle veya mideye uygun bir elastik boru sokulmasıyla veya karın içine enjeksiyonla uygulanır. Diğer maruz kalma yolları gerekçelendirildiklerinde uygun olabilir. Sonda ile veya enjeksiyonla tek seferde uygulanabilecek olan maksimum sıvı hacmi test hayvanının büyüklüğüne bağlıdır. Hacim 2 ml/100g vücut ağırlığını geçmemelidir. Bu değerden daha yüksek hacimler gerekçelendirilmelidir. Normalde daha yüksek konsantrasyonlarda daha kötü etkiler meydana getiren tahriş edici ve aşındırıcı maddeler haricindeki maddeler için konsantrasyonun tüm doz seviyelerinde sabit olacak şekilde ayarlanmasıyla test hacmindeki değişkenlik en aza indirilir.

6. 
   Kromozom hazırlanması
   

Feda edilmelerden hemen sonra kemik iliği elde edilir, hipotonik çözeltiye maruz bırakılır ve sabitlenir. Daha sonra hücreler lamların üzerine yayılır ve boyanırlar.

7. 
   Analiz
   

Mitotik indeks pozitif kontroller de dâhil muamele edilmiş tüm hayvanlar ve muamele edilmemiş negatif kontrol hayvanları içinde hayvan başına en az 1000 hücrede sitotoksisitenin (hücre toksisitesi) bir ölçüsü olarak belirlenmelidir.

Her hayvan için en az 100 hücre analiz edilmelidir. Bu sayı yüksek sayıda bozukluk gözlendiği takdirde artırılabilir. Pozitif ve negatif kontrollerinkiler de dâhil tüm lamlar mikroskobik analizden önce ayrı ayrı işaretlenmelidir. Çünkü lam hazırlama işlemleri genellikle kromozom kaybıyla birlikte metafaz kısmının kırılmasıyla sonuçlanır, bu yüzden sayılan hücreler 2n ±2 sayısına eşit sayıda sentromer içermelidir.

2.