VERİLER VE RAPORLAMA
-
Sonuçların işlenmesi
Bu testin amacı, test maddesinin yaşayan ebeveyn hayvan başına üretilen toplam canlı yavru sayısı üzerindeki etkisini belirlemektir. Ebeveyn hayvan başına toplam yavru sayısı her test kabı (tekrar) için hesaplanmalıdır. Eğer herhangi bir test kabında test esnasında ebeveyn hayvan ölürse veya erkeğe dönüşürse, o zaman bu tekrar analiz dışında tutulur. Daha sonra analizde azaltılmış sayıdaki tekrarlar esas alınır.
Kimyasalların üreme verimi üzerindeki etkileri için LOEC ve dolayısıyla NOEC’ in hesaplanmasında her derişim için ve toplanmış artık standard sapma için tekrarlara karşı ortalama üreme veriminin hesaplanması gereklidir, bu varyans analizi (ANOVA) kullanılarak yapılabilir. Daha sonra her derişim için ortalama uygun çoklu karşılaştırma metodu kullanılarak kontrol ortalaması ile karşılaştırılmalıdır. Dunnett veya Williams testleri kullanışlı olabilir (14)(15)(16)(17). Varyans’ın homojenliğinin ANOVA varsayımının geçerli olup olmadığı kontrol etmek gereklidir. Bunun biçimsel değer testi yerine grafiksel olarak yapılması zorunludur (18); uygun bir alternatifte Barlett testini uygulamaktır. eğer varsayım geçerli değilse, o zaman ANOVA veya ağırlıklandırılmış ANOVA gerçekleştirmeden önce verileri homojenleştirilmiş varyans haline dönüştürmesine önem verilmelidir. Algılanabilir etkinin boyutu ANOVA (örneğin en az belirgin fark) kullanarak hesaplanabilir ve rapor edilebilir.
Üreme veriminde % 50 azalmaya sebep olacak olan derişimin hesaplanması için (örneğin EC50), lojistik eğri gibi uygun bir eğri en küçük kareler yöntemi gibi istatistiksel metotlar kullanılarak verilere uydurulmalıdır. Eğri parametrelerle ifade edilen bir hale getirilebilir, bu sayede EC50 ve onun standart hatası doğrudan hesaplanabilir. Bu EC50 ile ilgili güven sınırlarının hesaplanmasını büyük oranda kolaylaştırır. Farklı güvenlik seviyelerinin tercih edilmesi için iyi sebepler bulunmadıkça, iki taraflı % 95 güven sınırları kullanılmalıdır. Uydurma işlemi, tercihen uyum eksikliği belirtisi değerlendirmesi için bir anlam sağlar. Bu grafiksel olarak yapılabilir veya karelerin kalıntı toplamlarının ‘uyum eksikliği’ ve ‘saf hata bileşenleri’ halinde bölünmesiyle ve uyum eksikliği için bir belirginlik testinin gerçekleştirilmesi ile yapılabilir. Çünkü, üretilen gençlerde yüksek doğurganlık sağlayan işlemler, daha düşük doğurganlık sağlayan işlemlerden, daha büyük varyans’a sahip olma eğilimindedirler. Farklı işlem gruplarında gözlenen değerlerin ağırlıklandırılmasında, farklı varyansları yansıtmak için dikkat gösterilmelidir (Geriye kalan bilgi için bakınız kaynak 18).
Son halka testinden elde edilen verilerin analizinde (2), diğer uygun modeller kullanılabilir durumdayken aşağıdaki model kullanılarak lojistik eğri oluşturulmuştur.
Y: Test sonunda canlı ebeveyn hayvan başına gençlerin toplam sayısı (her kap için hesaplanmış)
x: madde derişimi
c: x = 0 olduğunda gençlerin tahmini sayısı
x0: popülasyondaki EC50
b: eğim parametresi
Bu model farklı durumlar için yeterli görülmektedir, fakat bu modelin uygun olmayacağı testlerde olacaktır. Yukarıda önerilen modelin geçerliliği için kontrol yapılmalıdır. Bazı durumlarda, düşük derişimlerde geliştirilmiş etki yaratan hormesis modelinin kullanılması uygun olabilir (19).
Diğer etki derişimleri,EC50 hesaplamasında kullanılan modelin farklı parametreler halinde ifade edilerek kullanılması tercih edilmesine rağmen örneğin EC10 veya EC20 değerleri de hesaplanabilir.
-
Test raporu
Test raporu aşağıdakileri içermelidir.
-
Test maddesi:
- Fiziksel doğası ve ilgili fizikokimyasal özellikler;
- saflığı da içeren kimyasal tanımlama verileri;
-
Test türleri :
- klon (genetik olarak yazılı olsa da) , tedarikçi veya kaynak (biliniyorsa) vekültür koşulları kullanılır.Daphnia magna’dan farklı bir tür kullanılırsa, bu durum raporlanmalı ve gerekçelendirilmelidir.
-
Test koşulları
-
kullanılan işlem (örneğin; yarı statik veya akış yollu, hacim, litre başına yüklenen Daphnia sayısı);
-
ışığa maruz kalma zamanı ve ışık şiddeti;
-
test dizaynı (örneğin; tekrar sayıları, tekrar başına ebeveyn sayısı);
-
kullanılan kültür ortamının detayları;
-
eğer kullanılıyorsa, eklenen organik madde ve kompozisyonu, kaynağı, hazırlama yöntemi, stokların TOC/COD değerleri, test ortamında sonuçlanan TOC/COD’ un hesaplaması;
-
miktarı (mg C/Daphnia/gün şeklinde), besleme planını (örneğin; yiyecek tiplerini, deniz yosununun spesifik ismini ve eğer biliniyorsa, ırk ve kültür koşulları), içeren, besleme ile ilgili ayrıntılı bilgi;
-
stok çözeltilerini hazırlamada kullanılan yöntem ve yenileme sıklığı (eğer kullanılıyorlarsa, çözücü ve dağıtıcı ve derişimleri verilmelidir).
-
Sonuçlar
-
test maddesinin kararlığı ile ilgili herhangi bir ön çalışmanın sonuçları;
-
tanımlanan test derişimi ve test kapları içindeki test maddesinin derişimini belirlemek için yapılan tüm analizlerin sonuçları (Bakınız EK-IV içindeki örnEk-Veri kağıtları); yöntemin geri kazanım etkinliği ve tayin sınırı da rapor edilmelidir.
-
test kapları içerisindeki su kalitesi (örneğin pH, sıcaklık ve çözünmüş oksijen derişimi TOC ve/veya COD ve gerekli olduğunda sertlik) (EK-III’ teki örnEk-Veri kağıdına bakınız);
-
her ebeveyn hayvan tarafından yaşatılan canlı yavruların tam kaydı (EK-III, EK-III’ teki örnEk-Veri kağıdına bakınız);
-
ebeveyn hayvanlara ait ölü sayıları ve ölümün gerçekleştiği gün (EK-III, EK-III’ teki örnEk-Veri kağıdına bakınız);
-
kontrol doğurganlığı için varyasyon katsayısı (test sonundaki canlı ebeveyn hayvan başına toplam canlı yavru sayısı esasına göre);
-
test sonundaki ebeveyn hayvan başına toplam canlı yavru ağırlığına (gram) karşı gelen test maddesi derişiminin grafiği;
-
üreme için en düşük etki gözlenen derişim (LOEC) uygulanan istatistiksel prosedürlerin açıklaması ile birlikte ve hangi boyuttaki etkilerin algılanabileceğinin belirtileri ve üreme için etki gözlenmeyen derişim (NOEC); uygun olduğunda, ebeveyn hayvanların ölüm oranları için LOEC/NOEC de rapor edilmelidir.
-
uygun olduğunda, üreme ve güven aralıkları için ECx ve hesaplaması için kullanılan bir uydurulmuş model grafiği, doz-tepki eğrisinin eğimi ve onu standart hatası;
-
gözlenen diğer biyolojik etkiler veya ölçümler: diğer herhangi bir biyolojik etki gözlendiğinde ve ölçüldüğünde (örneğin ebeveyn hayvanların büyümesi) haklı gerekçeleri de içerecek şekilde rapor edin;
-
test yönteminden herhangi bir sapmanın açıklaması.
-
KAYNAKLAR
-
OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 March 1993.
-
OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No.6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.
-
Baird D.J., Barber J., Bradley M.C., Soares A.M.V.M. and Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, 257 -265.
-
Elendt B.P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
-
EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
-
Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol. ,47, 775-782.
-
ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrat es and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 pp.
-
Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley M.C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.) pp 144-148.
-
Parkhurst B.R., Forte J.L. and Wright G.P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, 1-8.
-
Cowgill U.M. and Milazzo D.P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), 185 -196.
-
Korshikov (1990 ). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, 209.
-
Sims I.R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 2053-2058.
-
Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459-466.
-
Dunnett C.W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.
-
Dunnett C.W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.
-
Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117.
-
Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, 510-531.
-
Draper N.R. and Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.
-
Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
-
Wilson E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
-
Poole R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, p 532.
-
Meyer J.S., Ingersoll C.G., McDonald L.L. and Boyce M.S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, 1156-1166.
Ek-I
Tamamen tanımlanmış Elendt m7 ve m4 ortamlarının hazırlanması
Elendt M7 ve M4 ortamlarına alıştırma
Bazı laboratuvarlar su piresinin M4 (1) ve M7 ortamına doğrudan transferinin zorluğu konusunda tecrübelidirler. Fakat, dereceli alıştırma ile bazı başarılar elde edilir, örneğin sahip olunan ortamı %30’ luk Elendt ortamına hareket ettirerek, daha sonra % 60 Elendt ve daha sonra %100 Elendt ortamına hareket ettirerek. Alıştırma periyodunun bir ay boyunca devam ettirilmesi gerekebilir.
Hazırlama
Eser elementler
İlk önce her eser elementin uygun saflıkta su içinde kendi stok çözeltileri (I) hazırlanır, örneğin iyonu giderilmiş, damıtılmış ve ters ozmoz yapılmış su ile. Bu stok çözeltilerinden (I) bütün eser elementleri içeren ikinci bir stok çözeltiler hazırlanır (II) (birleştirilmiş çözelti), örnek olarak:
Stok çözeltiler I
(tek madde)
|
Suya eklenen miktar
mg/l
|
Derişim (M4 ortamına bağlı olarak)
kat
|
Birleşik stok çözelti II’ yi hazırlamak için aşağıdaki miktarları stok çözelti I’den
suya ekleyin
ml/l
|
M4
|
M7
|
H3BO3
|
57 190
|
20.000
|
1,00
|
0,25
|
MnCl2 *4 H2O
|
7 210
|
20.000
|
1,00
|
0,25
|
LiCl
|
6 120
|
20.000
|
1,00
|
0,25
|
RbCl
|
1 420
|
20.000
|
1,00
|
0,25
|
SrCl2 *6 H2O
|
3 040
|
20.000
|
1,00
|
0,25
|
NaBr
|
320
|
20.000
|
1,00
|
0,25
|
Na2MoO4*2H2O
|
1 260
|
20.000
|
1,00
|
0,25
|
CuCl2 * 2H2O
|
335
|
20.000
|
1,00
|
0,25
|
ZnCl2
|
260
|
20.000
|
1,00
|
1,00
|
CoCl2 * 6 H2O
|
200
|
20.000
|
1,00
|
1,00
|
KI
|
65
|
20.000
|
1,00
|
1,00
|
Na2SeO3
|
43.8
|
20.000
|
1,00
|
1,00
|
NH4VO3
|
11.5
|
20.000
|
1,00
|
1,00
|
Na2EDTA*2 H2O
|
5000
|
2.000
|
-
|
-
|
FeSO4* 7 H2O
|
1 991
|
2.000
|
-
|
-
|
Na2EDTA veya FeSO4 çözeltileri teker teker hazırlanır, beraber dökülür ve hemen otoklavlama yapılır. Bu aşağıdakini verir
|
2 1itre Fe-EDTA
çözeltisi
|
|
1000-kat
|
20.0
|
5.0
|
M4 ve M7 ortamı
M4 ve M7 ortamı stok çözelti II kullanarak hazırlanır, makro-besinler ve vitaminler aşağıdaki gibidir:
|
Suya eklenen miktar
mg/l
|
Derişim (M4 ortamına bağlı olarak)
kat
|
Ortamı hazırlamak için eklenen stok çözelti miktarı
ml/l
|
M4
|
M7
|
Stok çözelti II birleştirilmiş eser elementler
|
|
20
|
50
|
50
|
Makro-besin stok çözeltisi
(tek madde)
|
CaCl2 * 2 H2O
|
293 800
|
1 000
|
1.0
|
1.0
|
MgSO4 * 7 H2O
|
246 600
|
2000
|
0.5
|
0.5
|
KCl
|
58 000
|
10 000
|
0.1
|
0.1
|
NaHCO3
|
64 800
|
1 000
|
1.0
|
1.0
|
Na2SiO3 * 9 H2O
|
50 000
|
5000
|
0.2
|
0.2
|
NaNO3
|
2 740
|
10 000
|
0.1
|
0.1
|
KH2PO4
K2HPO4
|
1 430
1 840
|
10 000
10 000
|
0.1
0.1
|
0.1
0.1
|
Birleştirilmiş Vitamin stok’u
|
_
|
10 000
|
0.1
|
0.1
|
Birleştirilmiş Vitamin çözeltisi, aşağıda gösterildiği gibi 3 vitamin 1 litre suya eklenerek hazırlanır:
|
Tiamin hidroklorür
|
750
|
10 000
|
_
|
_
|
Siyanokobalamin (B12)
|
10
|
10 000
|
_
|
_
|
Biotin
|
7.5
|
10 000
|
_
|
_
|
Birleştirilmiş vitamin stok çözeltisi küçük miktarlar halinde donmuş olarak depolanır. Vitaminler kullanmadan önce ortama kısa eklenir.
Dostları ilə paylaş: |
