FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- Ek- I 14C faz dağılımı
- Ek - II Yarı sürekli yöntem
- Ek - III 14CO 2 tayini
VERİ VE RAPORLAMA
Eğer madde, çabuk bir şekilde önemli miktarda bozunmuyorsa; numuneleme zamanları, günlerin tam sayısına değil saatin tam sayısına tamamlanır. Test maddesinin (14C işaretlenmiş maddeler için) ya da artık derişimin (işaretlenmemiş maddeler için) artık aktivite tahminleri, hem çizgisel hem de yarı logaritmik olarak zamana karşı grafiğe aktarılır (bkz. Şekil 1a ve 1b). Eğer bozunma gerçekleşir ise FS şişeleri ile FT şişeleri sonuçları karşılaştırılır. Eğer test maddesi (FT) ve steril şişelerden (FS) elde edilen sonuçların ortalaması %10’dan daha az bir sapma gösterir ise, gözlemlenen bozunmanın büyük bir olasılıkla abiyotik olduğu varsayılabilir. Eğer FS şişelerindeki bozunma daha az ise, biyobozunmanın boyutunu tahmin etmek amacıyla FT’den (çıkarmayla) elde edilenleri düzeltmek için şekiller kullanılabilir. Ana dönüşüm ürünleri için isteğe bağlı olan analizler uygulandığında, test maddesi azalmasının çizimine ek olarak oluşumlarının çizimi ve azalması da gösterilmelidir. Gecikme faz süreci tL, doğrusal bölümün 0’a ekstrapole edilmesi ile bozunma eğrisinden (yarı logaritmik grafik çizimi) veya yaklaşık %10’unun bozunduğu zamanın tayin edilmesinden tahmin edilir (bkz. Şekil 1a ve 1b). Yarı logaritmik grafik çiziminden, birinci dereceden hız sabiti, “k” ve bunun zamana karşı ln (artık 14C aktivitesi ya da artık madde konsantrasyonu) çizgisel regresyonuyla standart hata tahmin edilir. Özellikle 14C ölçümleri ile gecikme fazı bitiminden sonra sadece eğimin başlangıç çizgisel kısmına bağlı veri kullanılır ve daha büyük miktarda daha belirsiz veri yerine az ve temsili veri seçmek için tercih sunulur. Belirsizlik ölçülmüş artık 14C aktivitelerinin tavsiye edilen doğrudan kullanımından gelen içsel hataları içerir (aşağı bakınız). Eğer bozunma çiftfazlı ise, bu iki farklı hız sabiti hesaplanması ile ilgili olabilir. Bu nedenle bozunma eğrisinin iki farklı fazı tanımlanır. Alt numuneler aynı şişeden çıkarıldığında, ya da bütün şişelerden her numunelemede ürün çıkarıldığında ortalama değerler kullanarak hız sabiti “k” ve yarı ömür t½ = ln2/k hesaplamaları her bir tekrar tüpü için yapılmalıdır (bkz. Başlık 1.8.9.2, son paragraf). İlk prosedür uygulandığında, hız sabiti ve yarı ömür, her ayrı tekrar için ve bir standart hata ile ortalama değer olarak rapor edilmelidir. Eğer test maddesinin yüksek derişimleri kullanılmış ise bozunma eğrisi, düz çizgiden (yarı logaritmik çizim) epey sapabilir ve birinci dereceden kinetikler geçerli olmayabilir. Buna bağlı olarak bir yarı ömrü tanımlamanın hiçbir anlamı olmayabilir. Bununla birlikte sınırlı veri aralığı için psödo birinci dereceden kinetikler uygulanabilir ve yarı ömür DT50 bozunması (bozunmanın %50’sine ulaşmak için geçen zaman) tahmin edilebilir. Ancak seçilmiş veri aralığına bağlı bozunma sürecinin, verilen veri grubunun sadece tanımlayıcısı olan DT50’yi kullanarak önceden bildirilemeyeceği de bilinmelidir. İstatiksel hesaplamaları ve eğri düzenlenmesini kolaylaştırmak için analitik araçlar kolayca kullanılabilir ve bu tür bir yazılımın kullanılması tavsiye edilir. Eğer özel kimyasal analizleri yapılır ise yukarıdaki toplam mineralizasyon gibi birincil bozunma için hız sabitleri ve yarı ömürler tahmin edilir. Eğer birincil bozunma sınırlama prosesi ise, bozunmaya ait tüm alanda yer alan veri noktaları bazen kullanılabilir. Bunun nedeni ölçümlerin, 14C aktivitesinin ölçümlerinin aksine doğrudan olmasıdır. Eğer 14C işaretlenmiş maddeler kullanılır ise, en azından test bitiminde, uygulanan başlangıç derişimin yüzdesi cinsinden kütle denkliği ifade edilmelidir.
Organik maddenin 14C işaretlenmiş kısmı biyolojik olarak bozunduğunda, 14C’ün bir kısmı biyokütlenin büyümesinde ve/veya hücre dışı metabolitlerin sentezinde kullanılırken büyük bir kısmı 14CO2’ye dönüştürülür. Bununla birlikte maddenin ‘nihai’ biyobozunmasında, karbonunun %100’ü 14CO2’ye dönüşmez. Biyosentez ile oluşmuş ürünlerin içindeki 14C, ‘ikincil mineralizasyondan’ dolayı sonradan yavaş bir şekilde 14CO2 salımı gerçekleştirir. Bu nedenlerden dolayı artık organik 14C aktivitesinin (CO2 karıştırmasından sonra ölçülen) ya da üretilen 14CO2’nin zamana karşı grafiği, bozunma tamamlandıktan sonra ‘kuyruklanma’ gösterir. Bu, verinin kinetik yorumlamasını karmaşık hale getirir ve bu amaçla sadece eğrinin başlangıç kısmı (gecikme fazı bittikten sonra ve yaklaşık olarak %50 bozunmaya ulaşmadan önce), bozunma hızı sabitinin tahmini için kullanılmalıdır. Eğer test maddesi bozunur ise toplam artık organik 14C aktivitesi, artan bozulmamış test maddesi ile ilgili olan 14C aktivitesinden her zaman daha büyük olur. Eğer test maddesi birinci dereceden reaksiyon ile bozunuyorsa ve ayrım sabiti α CO2 içine mineralize edilir ise, 14C kaybolma eğrisinin başlangıç eğimi (zamana karşı toplam 14C aktivitesi), ilgili test maddesi (ya da 14C ile işaretlenmiş test maddesi kısmı) derişimi eğrisinin eğiminin α ile çarpımı olacaktır. Doğrulanmamış toplam organik 14C aktivitesinin ölçümleri kullanıldığında buna bağlı olarak hesaplanmış bozunma hız sabiti korunumlu olacaktır. Çeşitli sadeleştirme hipotezine dayalı olarak ölçülmüş radyokimyasal aktivitelerden test maddesi derişiminin tahmini için gereken prosedürler, literatür (2), (9), (10), (11) de açıklanmıştır. Bu gibi prosedürler, çabuk bozunabilen maddeler için oldukça kolay bir şekilde uygulanabilmektedir.
Eğer “k”, eklenmiş derişimden bağımsız ise (örneğin test maddesinin farklı derişimlerinde hesaplanmış k yaklaşık olarak aynı ise), birinci derece hız sabitinin kullanılan test koşullarının, örneğin test maddesi, su numunesi ve test sıcaklığının, temsili olduğu kabul edilebilir. Sonuçlar ne derecede genellenebilirse ya da ekstrapole edilirse edilsin bir uzman değerlendirmesinden geçirilmelidir. Eğer test maddesinin yüksek derişimi kullanılır ise ve buna bağlı olarak bozunma birinci dereceden kinetikleri izlemez ise veri, birinci dereceden hız sabiti ya da ilgili yarı ömrün doğrudan tahmini için kullanılamaz. Bununla birlikte test maddesinin yüksek derişimi kullanılan bir testten elde edilmiş veri, toplam mineralizasyon derecesini ve/veya dönüşüm ürünlerinin saptanması ve nicel olarak tahmini için kullanışlı olabilir. Eğer biyobozunma dışındaki diğer kayıp süreçlerinin hızları biliniyor ise (örneğin hidroliz ya da uçuculuk), bunlar biyobozunma hızının yaklaşık olarak tahmini için test esnasında gözlemlenen net kayıptan çıkarılabilir. Hidroliz için veri, örneğin steril kontrolden ya da test maddesi yüksek derişimini kullanan paralel testten elde edilebilir. Doğrudan ve dolaylı 14CO2 tayini (bkz. başlık 1.8.9.4 ve Ek-III), sadece test maddesinin CO2’ye mineralizasyon boyutunu ölçmek amacıyla kullanılabilir. Radyokromatografi (RAD-TLC) ya da HPLC, 14C işaretlenmiş test maddesi derişimlerinin ve ana dönüşüm ürünleri oluşumunun (bkz. başlık 1.8.9.4, üçüncü paragraf) analizi için kullanılabilir. Doğrudan bir yarı ömür tahmini yapmak için hiçbir ana dönüşüm ürününün (belirlenen uygulanan test maddesi miktarı ≥ %10) olmaması gerekir. Eğer burada belirtildiği gibi ana dönüşüm ürünleri var ise detaylı veri değerlendirmesi gerekli olur. Eğer ana dönüşüm ürünlerinin davranışı, deneyimler ile makul bir şekilde değerlendirilemez (örneğin bozunma için kullanılan yol üzerine bilgi) ise bunlar testin tekrarını ve/veya dönüşüm ürünlerinin tanımlamasını (bkz. başlık 1.8.9.5, birinci paragraf) içerebilir. CO2’ye çevrilmiş test maddesi karbonunun oranı değişebildiği için (büyük ölçüde test maddesi ve mevcut olan diğer maddelerin derişimine, test koşullarına ve mikrobiyal topluluğa bağlı olarak) bu test, DOC azalan testte olduğu gibi nihai biyobozunmanın doğru tahminine izin vermez fakat sonuç, solunum ölçümü testi ile elde edilenler ile benzerdir. Bu nedenle mineralizasyon derecesi nihai biyobozunmanın minimum seviyesinden daha az ya da bu seviyeye eşit olacaktır. Nihai biyobozunmanın tam görünümünü elde etmek için (mineralizasyon ve biyokütle içine yerleştirme), test bitiminde 14C faz dağıtımının analizi uygulanmalıdır (bkz. Ek-I). Parçacık havuzu içindeki 14C, bakteriyel biyokütle içine yerleştirilmiş 14C’den ve organik parçacıklara emilmiş 14C’den meydana gelecektir.
Eğer referans madde beklenen süre içerisinde bozunmaz ise (anilin ve sodyum benzoat için, genellikle iki haftadan az), testin geçerliliği askıya alınır ve daha fazla doğrulanmalıdır, ya da buna alternatif olarak test, yeni su numunesi ile tekrar edilmelidir. Avrupa’da bulunan yedi laboratuvarın ISO dolanım-testinde, anilin için uyumlaştırılmış bozunma hız sabiti 20 oC’de 0,8 gün–1 ortalama ile 0,3’ten 1,7 gün-1 aralıkta ve ± 0,4 gün–1 (t½ = 0,9 gün) standart hata ile değişkenlik göstermiştir. Tipik gecikme süresi 1 ila 7 gündür. İncelenmiş sularda mililitre başına 103 ila 104 koloni oluşum birimi (CFU) bakteriyel biyokütle rapor edilmiştir. Zengin besinli Orta Avrupa sularındaki bozunma hızı, farklı trofik duruma bağlı olarak veya kimyasal maddelere önceden maruz kalmış olabileceğinden dolayı, kuzey oligotrofik sularınkine kıyasla daha büyüktür. Radyoaktif olarak işaretlenmiş maddeler için deneyin sonundaki geri kazanım (kütle denkliği) %90 ile %110 arasında olması gerekirken, işaretlenmemiş maddeler için deneyin başlangıcındaki başlangıç geri kazanım %70 ile %110 arasında olmalıdır. Bununla birlikte belirlenmiş aralıklar, sadece hedef olarak yorumlanmalı ve testin kabul edilebilirliği için kriter olarak değerlendirilmemelidir.
Çalışmanın türü (örneğin pelajik test ya da askıda tortu testi) ve aşağıdaki bilgiler test raporunda açık bir şekilde belirtilmelidir. Test maddesi ve referans madde(ler):
Yüzey suyu: Su numunesi için en az aşağıdaki bilgiler sağlanmalıdır:
ve isteğe bağlı olarak:
Ayrıca eğer askıda sediman testi yürütülmekte ise sediman hakkındaki aşağıdaki bilgiler sağlanmalıdır:
Test koşulları:
Eğer karanlık koşullar sağlanamaz ise, ‘dağıtılmış ışık’ koşulları hakkında bilgi:
Sonuçlar:
Sonuçların tartışılması.
Ek- I 14C faz dağılımı Prosedürü kontrol etmek amacıyla, toplam artık organik 14C aktivitesinin (TOA) rutin ölçümleri, absorblayıcı içinde yakaladıktan sonra, mevcut 14CO2’nin doğrudan tayinini kapsayan kütle denkliği ölçümleri ile desteklenmelidir (bkz. Ek-III). Pozitif 14CO2 oluşumu, uçuculuk ya da emme gibi abiyotik bozunma ya da diğer kayıp mekanizmalarının aksine biyobozunmanın doğrudan kanıtıdır. İlaveten, membran filtre ya da santrifüj ile parçacığın ayrıştırılmasından sonra, biyobozunma davranışını karakterize eden kullanışlı bilgi, çözünmüş hal (çözünmüş organik 14C aktivitesi, DOA) ve parçacıklı hal (parçacık organik 14C aktivitesi, POA) arasındaki TOA dağıtımının ölçümlerinden elde edilebilir. POA, yeni bir gözenekli gerecin sentez için kullanılan ve dolayısıyla parçacık biyokütle dağılımının içine dahil edilen test maddesi karbonuna ek olarak, mikrobiyal biyokütle ve diğer partiküllerin üzerine emdirilmiş test maddesinden meydana gelir. Çözünmüş 14C organik madde oluşumu, biyobozunmanın bitiminde DOA olarak tahmin edilebilir (bozunmaya karşı zaman grafiğindeki düzlük). Test maddesinin (polikarbonat filtreler belki uygun olabilir) yeterli miktarını emmeyen bir maddenin üzerine 0,22 μm ya da 0,45 μm membran filtresi kullanarak numunelerin süzülmesi ile seçilmiş numuneler içindeki artık 14C faz dağılımı tahmini yapılır. Eğer filtre üzerine test maddesinin emilimi ihmal edilemeyecek kadar büyük ise (deneyden önce kontrol edilmelidir) süzme yerine yüksek hızda santrifüj (2000 g; 10 dk.) kullanılabilir. Süzülmemiş numuneler için, Ek-III’te tanımlanmış olan süzme ve santrifüj işlemi devam ettirilir. Membran filtreleri uygun sintilasyon sıvısı içinde çözdürülür ve genellikle sönümü doğrulamak için sadece harici standart oran yöntemi kullanarak hesaplanır ya da numune oksitleyici kullanılır. Eğer santrifüj kullanılmış ise damıtılmış suyun 1-2 ml’indeki parçacık dağılımından oluşan topak yeniden askıya alınır ve küçük sintilasyon şişelerine nakil edilir. 1 ml damıtılmış su ile iki kez yıkandıktan sonra yıkama suyu küçük şişeye aktarılır. Eğer gerekli ise sıvı sintilasyon hesaplaması için süspansiyon jel içine yerleştirilir. Ek - II Yarı sürekli yöntem Dirençli maddelerin yeterli derecede bozunmasını sağlamak amacıyla birkaç aya uzatılmış inkübasyon gerekebilir. Normalde, orijinal su numunesinin karakteristiği test süspansiyonunun yenilenmesiyle değişmiyorsa, test süresi 60 günü geçmemelidir. Bununla birlikte eğer test maddesi bozunması ilk 60 gün içerisinde başlar ise test periyodu, test süspansiyonu yenilenmeden 90 güne kadar uzatılabilir. Uzun periyotlar için inkübasyon esnasında temel besin öğelerinin ve birincil karbon substratların su numunesinin olası kaybından dolayı mikrobiyal topluluğun çeşitliliği azalabilir. Bununla birlikte yavaş bozunan maddelerin bozunma hızının yeterli tayini için yarı sürekli test kullanılması tavsiye edilir. Eğer maddenin %20’nin bozunması için üç aylık bir inkübasyon süreci beklenmekte ise, var olan tecrübelere dayanarak, test yarı sürekli yöntem kullanarak başlatılmalıdır. Alternatif olarak, kesikli yöntem kullanılarak yaklaşık 60 günlük süre içerisinde hiçbir test maddesi bozunmaz ise, kesikli test yarı sürekli test ile değiştirilebilir. Önemli bir bozunma gerçekleştiğinde (örneğin > %20) yarı sürekli yöntem durdurulabilir ve test kesikli deney ile devam ettirilebilir. Yarı sürekli test içinde, her iki haftada bir yaklaşık test süspansiyonunun üçte bir hacmi, başlangıç derişimlere eklenmiş test maddesine taze eklenmiş su ile yer değiştirir. İsteğe bağlı askıda tortu test uygulanır ise, tortu, başlangıç derişiminin (0,01 ve 1 g/l arasında) değiştirilen suyuna eklenir. Askıda tortu katıları ile test yürüterek suyun yenilenmesi esnasında tamamen askıya alınmış sistemin elde edilmesi ve katı ve sıvılar için kalma süresinin benzer olması önemlidir. Aksi halde, kararsız fazlı homojen sıvı sistemlere benzerlik kaybolabilir. Bu nedenlerden dolayı, yarı sürekli yöntem kullanıldığında, belirli aralıkların düşük seviyelerinde askıda olan sedimanların başlangıç derişimi tercih edilir. Önceden belirlenmiş test maddesi eklemesi ile, başlangıç test maddesi derişimi, test süspansiyonunun kısmi yenilenmesiyle aşıldığını ve dolayısıyla test maddesinin yüksek derişimleri ile sık görülen adaptasyondan kaçınıldığını gösterir. Prosedür, tükenen besinlerin ve birincil substratların hem yeniden aşılanmasını hem de karşılanmasını içerdiğinden, orijinal mikrobiyal çeşitlilik yenilenir ve prensipte test süresi sonsuza kadar uzatılabilir. Yarı sürekli yöntem kullanıldığında, her yenileme sürecinde eklenmiş ya da çıkarılmış test maddesi miktarları için artık test maddesi derişiminin doğrulanması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Toplam ve çözünmüş test maddesi derişimi, az miktarda emici bileşikler için değiştirilebilir bir biçimde kullanılabilir. Log Kow değeri < 3 olan maddeler için (nötr yağı seven bileşikler için) belirli koşullar altında (0,1-1 g katı/litre) emme önemsizdir(< %5). Bu aşağıdaki hesaplama örneğinde gösterilmektedir. 0,1 g/l katılar litre başına yaklaşık olarak 10 mg karbona tekabül eder (karbon dağılımı, fc = 0,01). Aşağıdaki kabuller yapıldığında, Log Kow (test maddesi) = 3 Koc = 0,42 × Kow Ayrışma katsayısı, Kd = fC × Koc toplam derişimin çözünmüş dağılımı (C-su (Cw)/C-toplam (Ct): Cw/Ct = 1/(1 + Kd × SS) = 1(1 + Koc × fC × SS) = 1/(1 + 0,42 × 103 × 0,01 × 0,1 × 10–3) = 0,999 olarak belirlenir.
Eğer test maddesi uçucu değil ve uçucu dönüşüm ürünlerine dönüştürülemiyor ise rutin ölçümler için dolaylı yöntem, en az zaman alan ve en hassas ölçüm olur. Sadece süzülmemiş numuneler, örneğin 0,5 ml boyutta, küçük sintilasyon şişelerine aktarılır. Numuneler içindeki uygun aktivite ilk başlarda 5000 dpm-10 000 dpm’dir (80-170 Bq) ve minimum başlangıç aktivite yaklaşık 1 000 dpm’dir. 1-2 damla derişik H3PO4 ya da HCl ile 2-3 pH’a asitlendirmeden sonra CO2 uzaklaştırılır. CO2 uzaklaştırılması, 1/2-1 saatliğine hava ile kabarcıklanma ile uygulanabilir. Alternatif olarak küçük şişeler, 1-2 saatliğine güçlü bir şekilde çalkalanabilir (örneğin mikroplaka çalkalayıcı üzerinde) ya da gece boyunca daha nazik çalkalamaya bırakılır. CO2 uzaklaştırılma yönteminin etkinliği kontrol edilmelidir (hava ile çalkalama sürecinin süresini uzatarak). Sıvı numunelerin sayılması için uygun olan sintilasyon sıvısı eklenmeli, numune girdap karıştırıcısında (whirling mixer) homojenize edilmeli ve test kör numunelerinde (FB) bulunan arka plan aktivitesi çıkarılarak sıvı sintilasyonuyla radyoaktivite tayin edilmelidir. Test suyu çok renkli olmadıkça ya da yüksek parçacık derişimi içermedikçe numuneler tek tip bir sönümü gösterecektir ve dış standart kullanarak sönüm doğrulamalarını uygulamak için yeterli olacaktır. Test suyu yüksek oranda renkli ise dahili standart eklenmesi yoluyla sönüm doğrulaması gerekli olabilir. Parçacık derişimi yüksek ise, homojen çözelti ya da jel elde etmek mümkün olamayabilir veya numuneler arasında sönüm çeşitliliği büyük olabilir. Bu durumda yukarıdaki test bulamaçları için açıklanan hesaplama yöntemi kullanılabilir. Test askıda sediman testi olarak uygulandığında, 14CO2 ölçümü, test suyu/süspansiyonunun 10 ml homojen numunesini alarak ve uygun hızda (örn. 40 000 m/s2, 15 dk için) santrifüjleme suretiyle fazları ayırarak dolaylı olarak uygulanır. O zaman sıvı faz yukarıda açıklandığı gibi işleme tabi tutulmalıdır. Parçacık fazdaki (POA) 14C aktivitenin tayini, küçük hacimdeki damıtık su içine tortuyu yeniden askıya alarak, küçük sintilasyon şişelerine aktararak ve bir jel oluşturmak için (bu amaca yönelik özel sintilasyon sıvıları mevcuttur) sintilasyon sıvısı eklenerek yapılmalıdır. Partiküllerin doğasına dayanarak (örneğin organik maddelerin içerikleri) bir doku çözücü ile gece boyunca numune parçalamak ve sonra sintilasyon sıvısının eklenmesinden önce girdap karıştırıcısında homojenize etmek uygun olabilir. Alternatif olarak POA, numune oksitleyici kullanarak yeterli oksijen ile yakma ile tayin edilebilir. Sayımda, iç standartlar her zaman olmalıdır ve her bir bağımsız numunede iç standart eklemesi yapılarak sönüm doğrulama yapmak gerekli olabilir. Doğrudan 14CO2 tayini Eğer mevcut 14CO2 doğrudan ölçülecekse, test başlangıcında daha fazla şişe temin edilmeli, kullanılan şişeler pH 2-3’e asitlendirilmeli ve her ölçüm noktasında test şişelerinden ürün alınarak iç (test başlangıcında her test şişesine yerleştirilmiş) ya da dış absorplayıcı içine 14CO2 taşınması sağlanmalıdır. Absorplama ortamı olarak ya alkali (örneğin 1 N NaOH çözelti) ya da bir NaOH topağı, etanolamin ya da etanolamin-bazlı ve ticari olarak elde edilebilir absorplayıcılar kullanılabilir. Doğrudan 14CO2 ölçümü için şişeler, örneğin bütil kauçuk septa ile kapatılmalıdır.  Şekil 1a- Aritmetik veri çizim grafiği örneği (zamana karşı artık aktivitesi)  Şekil 1b- Yarı logaritmik veri çizim grafiği örneği (artık aktivitenin zamana karşı ln’i) Yüklə 5,29 Mb. Dostları ilə paylaş:
|