TezYazimSablonu

3.gereç ve yöntem

Çalışma, Ekim 2010 - Şubat 2012 tarihlerinde Yakın Doğu Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalında gerçekleştirilmiştir. Çalışmaya toplam 200 gönüllü katılmıştır. Çalışma kapsamında vücut kitle indeksinin ≥ 30 kg/m² bireylerden 110 kişilik obez çalışma grubu oluşturulmuştur. VKİ ≤ 24.9 kg/m² olan kişilerden ise 90 kişilik kontrol grubu oluşturulmuştur. Proje kapsamında çalışmaya katılan bireylerin yaşlarının on sekizden büyük ve altmış yaştan da küçük olmasına dikkat edilmiştir. Ayrıca çalışmaya katılan kişiler diyabet hastası olmayan ve hormonal tedavi görmeyen bireylerdir. Çalışma kapsamında her gönüllünün sağlık bilgileri alınmış, bel ve kalça çevresi, kilosu, boyu ölçülmüştür. Çalışmada gönüllülerden biyokimyasal analizler için 5ml periferik kan lityum heparinli tüplere ve genetik araştırma için de 2 ml kan potasyum etilen diamin tetra asetik asitli (K₂-EDTA’lı) tüplere alınmıştır. Lityum heparinli tüpe alınan kandan ayrılan plazma biyokimyasal analizler için kullanılmıştır. K₂-EDTA’lı tüpe alınan periferik kandan deoksiribonükleik asit (DNA) izole edilmiştir. Kan örnekleri alınan kişilerde açlık sürelerinin sekiz saatten az olmamasına özen gösterilmiştir. Ayrıca kan örnekleri alındıktan sonra yarım saat içinde santrifüj edilerek plazmalar ayrılmıştır. Plazma leptin, adiponektin, resistin ve açlık insülin düzeyleri ölçümü için plazma örnekleri -80°C’de muhafaza edilmiştir.
Biyokimyasal analizlerde açlık glukoz, total kolesterol, düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL), yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) ve trigliserit düzeyleri Gazimağusa Devlet Hastanesi, Biyokimya Laboratuarında ölçülmüştür. Adiponektin, leptin ve resistin plazma düzeylerinin enzim bağlı immunosorbent analiz (ELISA) yöntemi ile ölçülmesi Yakın Doğu Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Multidisipliner Laboratuarında gerçekleşmiştir. DNA izolasyonları Yakın Doğu Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Doku ve Hücre Kültürü Laboratuarı ve Yakın Doğu Üniversitesi Hastanesi, Tıbbı Genetik Laboratuarında yapılmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ve enzim kesimi işlemleri Yakın Doğu Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Doku ve Hücre Kültürü Laboratuarında gerçekleştirilmiştir. Açlık insülin düzeyi belirlenmesi ise Yıldız Özkan Laboratuarında yapılmıştır.
Çalışma başlatılmadan önce Yakın Doğu Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Değerlendirme Etik Kurul’undan onay alınmıştır. Kan örnekleri alınan hastalara bilgilendirilmiş gönüllü onam formu imzalatılmıştır.

3.1.Kullanılan Cihazlar

Hassas terazi

Otomatik pipet

Çeker ocak

Otoklav

Distile su cihazı

Buzdolabı ve derin dondurucu (+4C, -20C, -80C)

Soğutmalı satrifüj

Jel görüntüleme sistemi

Yatay elektroforez aleti

PZR cihazı

Isı bloğu

pH metre

Masa üstü mini satrifüj

Etüv

Güç kaynağı

Mikroplate okuyucu

Mikroplate yıkayıcı

Klinik biyokimya analiz cihazı

3.2.Kullanılan Tampon ve Çözeltiler

3.2.1.DNA İzolasyonu İçin Kullanılan Tampon ve Çözeltiler

Lizis Tamponu

4.15 gr amonyum klorür (NH₄Cl), 0.5 gr potasyum bikarbonat (KHCO₃) ve 100 µl 0.5 M Na₂EDTA 500 ml ditile su içinde çözündürülmüştür. Hazırlanan tampon steril edildi ve +4°C’de muhafaza edilmiştir.

Nükleaz Tamponu

0.605 gr tris baz, 11.69 gr sodyum klorür (NaCl) ve 2 ml 0.5 molar Na₂EDTA 500 ml distile su içinde çözündürülmüştür. Hazırlanan tampon steril edildi ve +4°C’de muhafaza edilmiştir.

TE (Tris-EDTA) Tamponu

0.24 gr tris baz ve 200 µl 0.5 molar Na₂EDTA 100 ml distile su içinde çözündürülmüştür. Hazırlanan tampon steril edildi ve +4°C’de muhafaza edilmiştir.

0.5 M Na₂EDTA Tamponu

46.53 gr etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) ve 5 gr sodyum hidroksit (NaOH) 250 ml distile su içinde çözündürülmüştür. Tampon, sodyum hidroksit ve hidroklorik asit kullanılarak pH 8’e ayarlanmıştır. Hazırlanan tampon oda ısısında muhafaza edilmiştir.

7.5 M Amonyum Asetat Tamponu

57.8 gr amonyum asetat 100 ml distile su içinde çözündürüldü ve 0.22 mikronluk filtreden geçirtilerek siterilize edilmiştir. Hazırlanan tampon +4°C’de muhafaza edilmiştir.

%10’luk Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Tamponu

10 gr sodyum dodesil sülfat 100 ml distile su içinde çözündürüldü ve 0.22 mikronluk filtreden geçirtilerek siterilize edilmiştir. Hazırlanan tampon oda ısısında muhafaza edilmiştir.

Proteinaz K Çözeltisi

Proteinaz K çözeltisi 10 mg/ml olacak şekilde ditile su eklenerek çözündürüldü. Çözelti -20°C’de muhafaza edilmiştir.

3.2.2.Agaroz Jel Elektroforez Çözeltileri

Etidyum Bromür

Steril su ile 10 mg/ml olacak şekilde hazırlanmıştır.

TAE (Tris-Asetat EDTA) (50X)

292 gr tris baz, 57.1 gr glasial asetik asit ve 100 ml 0.5 M Na₂EDTA 1000 ml distile su içinde çözündürüldü. Hazırlanan çözelti steril edildi ve oda ısısında muhafaza edilmiştir.

Agaroz Jel Yükleme Tamponu

10 mM Tris-HCl, 0.03% bromofenol mavisi, 0.03% ksilen siyanol, 60% gliserol ve 60 mM EDTA içeren hazır yükleme tamponu kullanıldı. Tampon -20°C’de muhafaza edilmiştir.

3.2.3.PZR Reaksiyonu İçin Kullanılan Çözeltiler

DreamTaq PCR Master Mix (2X)

Fermentas marka DreamTaq PCR Master Mix (2X) kullanıma hazır olarak temin edilmiştir. -20°C’de muhafaza edilmiştir.

Primerler

Liyofilize şekilde hazır temin edilen primerler derişimi 20 µM olacak şekilde steril su ile sulandırılarak hazırlanmıştır. -20°C’de muhafaza edilmiştir.

3.2.4.Restriksiyon Enzim Kesimi Reaksiyonu İçin Kullanılan Kimyasallar

MspI Restriksiyon Enzimi

Restriksiyon enzim kesimi reaksiyonunda kullanılan MspI enzimi kullanıma hazır olarak temin edilmiştir. -20°C’de muhafaza edilmiştir.

10X Tango Tamponu

33 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat, 66 mM potasyum asetat içeren tampon kullanıma hazır olarak satın alınmıştır. -20°C’de muhafaza edilmiştir.

3.2.5.Kullanılan Kitler

Leptin ELISA kiti (DRG)

Adiponektin ELISA kiti (BioVendor)

Resistin ELISA kiti (BioVendor)

İnsülin kiti (Conbas)