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Les Protéines et les Enzymes

114.### Les laccases sont des glycoprotéines monomériques catalysant une réduction à 4 électrons de l'oxygène tout en assurant une oxydation à un électron du substrat sans engendrer de peroxydes. Elles pourraient assurer la dégradation d'aromatiques polycycliques ou constituer le compartiment cathodique d'une pile à combustible. Elles font, cependant, font partie des enzymes difficiles à exprimer de façon hétérologue. La laccase de Myceliophthora thermophila (MtL) a été exprimée sous une forme fonctionnelle dans S.cerevisiae par le groupe de Frances Arnold. Le niveau d'expression et l'activité ont été nettement améliorés par évolution dirigée. La modification la plus importante de ce point de vue a été l'introduction d'un site de clivage par la protéase Kex2 dans la partie C-terminale de la préprotéine. Cela faisait partie d'une stratégie d'adaptation de la protéine aux protéases de l'hôte d'adoptif susceptibles d'assurer la maturation. Mais l'amélioration de l'activité a été accompagnée par une baisse de la stabilité. Un seul cycle de mutation-sélection a suffi pour la rétablir, et au-delà. L'introduction d'un glycane de 120 monomères sur l'un des sites de glycosylation est détectée. T Bulter et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (FEB03) 987-995.

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115.### La valorisation des raffles de maïs par conversion en bioéthanol doit être dix fois plus efficace qu'actuellement pour pouvoir être économiquement acceptable. Deux articles discutent d'améliorations potentielles de la dégradation de la lignocellulose.

L'une des stratégies utilisées et d'hydrolyser la cellulose en sucres utilisables par des organismes capables de les fermenter. Une autre est de réaliser l'ensemble des opérations par un même microorganisme en lui faisant exprimer en proportions adéquates les enzymes nécessaires.

Pour la dégradation initiale ont peut utiliser, soit des hydrolyses chimiques, soit des enzymes à des prix qui doivent être raisonnables. Dans ce dernier cas, deux stratégies existent dans la nature, celle utilisant des enzymes isolées, et celle (anaérobie) utilisant des complexes comme les cellulosomes où les enzymes sont assemblées sur un squelette non enzymatique portant des domaines dits cohésines permettant d'y fixer diverses enzymes possédant des motifs, appelés dockerines, reconnaissant les cohésines correspondantes.

L'article de MT Rincon,et al.; Journal of Bacteriology 185, n°3 (FEB03) 703-713, décrit la diversité des protéines du squelette support (échafaudage) des enzymes face à la diversité des dockerines chez Ruminococcus flavefaciens. Les auteurs en concluent qu'on pourrait utiliser cette diversité en montant des cellulosomes alternatifs en fonction des besoins.

Des minicellulosomes de Clostridium acetobutylicum ont été montés par des chercheurs de l'INSA de Toulouse (F Sabathe et al.; Journal of Bacteriology 185, n°3 (FEB03) 1092-1096) autour de la protéine d'échafaudage CipA. C.acetobutylicum contient bien un cellulosome, mais il n'est même pas capable de dégrader la cellulose cristalline, ce à quoi il va falloir remédier pour faciliter la conversion de la bactérie en un producteur de solvants à partir de la cellulose. Le groupe de Toulouse, associé à celui de Bellaich à Marseille s'y emploie. F Sabathe et al ont monté un minicellulosome qui contient la mini-CipA, plus la cellulase Cel48A, plus une troisième protéine. Ce cellulosome n'est encore que très modérément cellulolytique, il n'est toujours pas actif sur cellulose cristalline.

Des combinaisons de plusieurs enzymes de la cellulolyse sont annoncées dans un commentaire de RH Doi; Journal of Bacteriology 185, n°3 (FEB03) 701-702

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116. CelI est une endoglucanase processive, grignotant certaines formes de cellulose, non cellulosomale, de Clostridium thermocellum. Ces protéines ont usuellement un domaine catalytique C-terminal lié à un domaine reconnaissant la cellulose CBM3c (pour carbohydrate-binding module type 3c), dont on suppose qu'il fournit individuellement les chaînes de cellulose au site catalytique. CelI contient également un module CBM3b C-terminal. Ce domaine est supposé permettre la fixation sur la surface des fibrilles de cellulose.. Son gène, celI, comporte, en réalité, une délétion de 53 pb dans la partie codant CBM3b qui engendre un changement de phase de lecture, et donc une modification de la partie aval de la protéine qui l'empêche de se fixer sur la cellulose cristalline. C'est ce qu'ont montré des chercheurs israéliens et de l'University of Newcastle-upon-Tyne R Gilad et al.; Journal of Bacteriology 185, n°2 (JAN03) 391-398.

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117. La cellulase Cel5A d'un Bacillus alcalophile contient deux autres CBMs, BspCBM17 et BspCBM28 en tandem (Bsp pour Bacillus sp.). Les deux modules se ressemblent beaucoup, mais les acides aminés critiques pour la reconnaissance de la cellulose ne sont pas conservés.

Leurs capacités de liaison ont été caractérisées pour BspCBM28 qui a pu être produit séparément et à partir de CcCBM17 de Clostridium cellulovorans car BspCBM17 n'a pu être exprimé en dehors de la cellulase.

CcCBM17 et BspCBM28 reconnaissent deux sites sur la cellulose amorphe : l'un avec une forte affinité et l'autre avec faible affinité. Ces deux modules n'entrent pas en compétition pour le site à haute affinité, ce qui suggère qu'ils reconnaissent deux sites différents. Le polypeptide comprenant les deux modules en tandem, BspCBM17/CBM28, de Cel5A, se lie à la cellulose avec une affinité supérieure à celles de CcCBM17 et BspCBM28, ce qui indique une coopérativité entre les deux modules. L'utilisation de mutants indique que les CBMs, soit modifient l'activité du module catalytique de Cel5A, soit ciblent l'enzyme vers des zones de la cellulose différant dans la sensibilité à l'hydrolyse. AB Boraston et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (21FEB03) 6120-6127.

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119. Les odeurs d'aisselles embaumant le métro aux heures de pointe sont liées à l'activité de Corynébacteries sur des substrats inodores. Celles-ci produisent de l'acide 3-méthyl-2-hexénoique et un acide apparenté, 3-hydroxy-3-méthylhexanoïque. Les chercheurs de Givaudan ont purifié leurs précurseurs inodores. Ces acides sont liés de façon covalente à une glutamine qui est libérée par une aminoacylase Zn⁺⁺ dépendante. Elle a été purifiée à partir de Corynebacterium striatum Ax20,et le gène correspondant, agaA, a été cloné et exprimé chez Escherichia coli. L'enzyme est très spécifique de la glutamine et relativement œcuménique pour l'acide gras.

Le gène agaA est très proche de plusieurs gènes codant des enzymes impliquées dans le clivage de N-substituants acyle et aryle d'acides aminés. A Natsch et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (21FEB03) 5718-5727. C'est une belle illustration de l'apport des techniques moléculaire à des productions cosmétiques.

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