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Mars 2003 n°204

Une version plus complète de ce bulletin est accessible sur le site de l'INRA www.inra.fr. sous son nom dans : Information Scientifique et Technique puis Publications INRA en ligne.

Le signe ### dans cette version papier indique quelques développements supplémentaires ou des commentaires additionnels consultables dans la version électronique. André BERKALOFF

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Concepts et Techniques

2. La firme canadienne SemBioSys Genetics a breveté sous l'US Patent n°6 509 453 (21JAN03), l'utilisation des protéines enveloppant les gouttelettes lipidiques des graines ou "oil bodies" d'oléagineux comme matrices d'affinité pour purifier un produit. Cela fait plusieurs années que la firme étudie ces protéines. Ici elle fusionne une des protéines associées à une séquence spécifique d'une ligand donné et l'on récolte les gouttelettes avec le ligand fixé.

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3. Le photoblanchiment de la GFP (Green Fluorescent Protein) est une technique très utilisée pour suivre les mouvements de structures ou protéines cellulaires. Elle serait encore plus utile si on pouvait activer la fluorescence dans une cellule avec une longueur d'onde, une intensité et une durée précises. Des chercheurs de Moscou décrivent l'utilisation d'un tel allumage sélectif de la fluorescence d'une protéine naturellement non fluorescente. C'est la chromoprotéine d'Anemonia sulcata (une anémone de mer très commune) qui a été utilisée, et dont le gène a été muté pour fluorescer irréversiblement en rouge. DM Chudakov et al.; Nature Biotechnology 21 (FEB03) 191-194. On peut ainsi suivre le devenir d'une protéine ainsi marquée.

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4. Les nanocristaux semi-conducteurs luminescents (quantum dots) ont été proposés (voir WCW Chan et al.; Current Opinion in Biotechnology 13 (FEB02) 40-46) comme supports pour bioconjugaison de molécules allant jusqu'à des peptides, protéines et ADNs. On peut faire varier leur luminescence, avec une seule source d'illumination, en jouant sur les interactions entre électrons, trous et environnement dans le cristal. Ce sont des cristaux de CdSe (surtout), CdTe, CdS, ZnSe ou InP, InAs. Ils peuvent être utilisés, soit après endocytose, soit pour marquer des protéines de surface avec des cristaux conjugués à des anticorps. On peut ainsi suivre des cellules tout au long du développement comme le montrent JK Jaiswal et al.; Nature Biotechnology 21 (JAN03) 47-51.

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5. Une nouvelle technique de détection électronique des anticorps, une fois chargés par leur antigène, (voir le Bulletin de Février §153 sur les techniques de détection des pathogènes) est décrite dans OA Saleh et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (04FEB03) 820-824.

Celle-ci détecte le changement de volume lors de la formation du complexe à la surface de particules colloïdales de latex. On la mesure par un passage dans un pore sans aucun marquage. Il n'y a aucune raison pour que cela ne puisse marcher pour toutes sortes de complexes ligands-récepteur, au sens large.

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6. Les protéines synthétisées par les ribosomes du réticulum endoplasmique transitent dans sa lumière à travers un complexe de la membrane associé au ribosome. Ce pore est franchissable par de petites molécules. Si on interrompt la synthèse des protéines, une petite molécule, le 4-méthyl-umbelliféryl--D-glucopyranoside, peut passer. Ce n'est pas le cas si on interrompt seulement le transit par la cycloheximide. La protéine bouche le pore au cours de sa synthèse, mais si le pore est vide, les petites molécules passent, apparemment, librement. A Roy et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (14FEB03) 4397-4403.

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7. Mcm1 (Minichromosome maintenance) est une protéine qui est également nécessaire à l'expression des gènes de début du cycle cellulaire chez Saccharomyces cerevisiae. Cette protéine s'associe de façon ponctuée à la chromatine. On vient de montrer qu'elle est implantée au niveau des origines de réplication des chromosomes. Ceci s'explique par son rôle au début de la réplication des chromosomes. Elle se fixe de façon coopérative en de nombreux sites des séquences autonomes de réplication (ARS). VK Chang et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (21FEB03) 6093-6100.

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Les Productions Végétales

Les gènes et les génomes

9. Le repérage de gènes rarement exprimés d'un génome donné à partir de cDNAs exige une énorme redondance dans les banques de cDNAs pour avoir une chance de disposer de marqueurs de la totalité du génome. R Schulz et al.; Plant Journal 32, n°5 (DEC02) 845-857 se sont attaqués à ce problème à propos de la betterave. Celle-ci est, en effet, très peu connue sur le plan moléculaire génomique.

Les chercheurs berlinois ont traité 159 936 clones de cDNA par des méthodes informatiques à haut débit. Ils ont ainsi pu regrouper les séquences en 30 444 paquets de séquences génomiques. Un échantillon de 10 961 clones cDNA, un par paquet, a été séquencé. Les résultats montrent que 89% de ces ESTs (Expressed Sequence Tags) correspondent bien à des gènes uniques. Cela signifie qu'il existe environ 25 000 gènes chez la betterave.

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L'expression génique

10. Les chercheurs de Bayer BioScience à Ghent (ex-Plant Genetic Systems) décrivent un système transitoire de "silencing". Il est appelé SVIS (Satellite Virus-Induced Silencing System). Il utilise un virus satellite du virus (STMV de la Mosaïque du Tabac comme vecteur pour le transfert d'un ARN inhibiteur et la souche U2 du TMV pour fournir, en trans, l'appareil de réplication, ainsi que la protéine de mobilisation du virus. V Gossele et al.;The Plant Journal 32, n°5 (DEC02) 859-866.

L'intérêt est de découpler le système de réplication et le système de "silencing", ce qui renforce ce dernier. Les auteurs montrent qu'il est possible, ainsi, de bloquer des gènes appartenant à plusieurs voies, fortement et rapidement et dans différents tissus. On peut; même, induire une répression simultanée d'un gène endogène et d'un transgène en plaçant les séquences inductrices en tandem dans le vecteur. Ceci fonctionne bien chez le Tabac et les auteurs ont sentiment que cela doit également fonctionner chez d'autres Solanacées.

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11. Des chercheurs de Grenoble utilisant la formation du trichome d'Arabidopsis comme modèle, ont montré qu'un nouveau type de protéine participe à la régulation du gène GLABROUS1 (GL1) indispensable à la formation de cette cellule unique. Ils ont repéré un cDNA codant la protéine GeBP (GL1 enhancer Binding Protein) se fixant sur la séquence cis régulatrice amont du gène.

GeBP et ses trois homologues d'Arabidopsis comportent deux régions dont une, C-terminale, correspond à une "leucine-zipper". Les deux régions sont nécessaires au fonctionnement. Cette protéine est surtout exprimée dans les méristèmes végétatifs et dans les primordias foliaires très jeunes. La localisation fait penser à une activité nucléolaire (???). Les auteurs ont, alors, analysé la régulation de l'expression de GeBP et montré que celle-ci est stimulée par KNAT, ce qui laisse supposer que GeBP agit comme un répresseur de la formation des feuilles. J Curaba et al.; Plant Journal 33, n°2 (JAN03) 305-317.

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Le développement

12. Une plante peut être à croissance définie (déterminée) ou indéfinie (indéterminée). Les mutants pinhead/zwille d'Arabidopsis sont souvent modifiés en plants à croissance déterminée. PINHEAD (PNH) est exprimé dans le domaine central du méristème caulinaire dans les tissus prévasculaires, ainsi que dans partie supérieure (adaxiale) des organes latéraux.

On vient de montrer que l'expression ectopique sur la face abaxiale des organes latéraux entraîne un recourbement vers le haut des feuilles, indiquant une perte de la coordination morphogène entre les deux faces de la feuille et, en particulier, de celle des divisions cellulaires entre ces deux faces. Plus intéressant est le fait que le déplacement de l'expression de PNH vers la périphérie de l'embryon cause la croissance indéterminée du cotylédon. Ceci souligne l'importance des informations positionnelles dans l'organogenèse. KL Newman et al.; The Plant Cell 14 (DEC02) 3029-3042.

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13. LEAFY COTYLEDON1 (LEC1) d'Arabidopsis est un régulateur important du développement embryonnaire normal. Il suffit à déclencher un développement embryonnaire dans des cellules végétatives.

LEC1 code une sous-unité HAP3 (CBF des mammifères) du facteur de transcription se fixant sur le motif régulateur CCAAT. On détecte plusieurs homologues de ce gène dans le génome, L1L (LEC1-LIKE), ainsi que des gènes non homologues ayant des effets analogues. La suppression de l'expression de L1L induit des anomalies du développement embryonnaire différentes de ceux des mutants lec1. Ces deux facteurs semblent avoir des rôles légèrement différents.

L'expression de L1L sous la commande des séquences régulatrices de LEC1 supprime le phénotype des mutants lec1, ce qui indique une redondance fonctionnelle, mais régulée différemment. L1L, représente donc une nouvelle classe de sous-unité HAP3 chez les plantes. RW Kwong et al.; The Plant Cell 15 (JAN03) 5-18.

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14. Le patron d'expression génique lors de la régénération d'une tige à partir des racines chez Arabidopsis est décrit dans AJ Cary et al.; Plant Journal 32, n°6 (DEC02) 867-877.

Cette organogenèse est, classiquement, induite en deux étapes. On provoque la formation d'un cal avec de l'auxine, puis on provoque, dans ce cal, la formation de la tige par un traitement aux cytokinines. Le méristème caulinaire se forme pendant la deuxième étape au moment de la transition du développement hormone-dépendant à la phase hormone indépendante (détermination caulinaire). L'expression des gènes CUP-SHAPED COTYLEDON 1 et 2 (CUC1 et 2), puis WUSCHEL (WUS) débute un peu avant ce stade, tandis que celle de SHOOTMERISTEMLESS (STM) et CLAVATA1 (CLV1) est contemporaine de la détermination caulinaire. CUC1 est exprimé tôt lors de l'induction caulinaire par les cytokinines au niveau du cal, mais cette expression se focalise, ensuite, au niveau des territoires présomptifs du développement de la tige. Au cours du développement zygotique, normal cette expression est rapidement focalisée.

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15. Les microfibres de cellulose sont orientées dans la paroi des cellules végétales et cette orientation dépend des effets mécaniques subis par la cellule. Les mécanismes induisant cette orientation, pourtant très intéressante pour les applications (antiverse, solidité des produits structuraux d'origine végétale, comme le bois), sont restés longtemps inconnus.

Un mutant d'Arabidopsis appelé fragile fiber (fra1), présentant une très grande fragilité mécanique, a été caractérisé. R Zhong et al.; The Plant Cell 14 (DEC02) 3101-3117. Ce mutant montre que l'hypothèse d'une intervention des microtubules du cytosquelette est un peu simpliste, car les microtubules ne sont pas affectés, alors que les microfibres sont désordonnées. Le gène FRA1 code une protéine "kinesin-like" avec un domaine liant les microtubules.

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16. Le mutant thermosensible d'Arabidopsis rsw3 présente un défaut dans sa cellulose et possède des racines gonflées radialement. On vient de montrer qu'il est affecté dans la sous-unité catalytique d'une glucosidase II, enzyme modifiant les N-glycanes des glycoprotéines lors du contrôle de qualité dans le reticulum endoplasmique. Des sous-unités  ont été identifiées chez Arabidopsis et le riz. Les gènes correspondant aux mutants rsw1 et rsw2 agissent sur les propriétés des enzymes déjà produites, et donc plus rapidement. JE Burn et al.; The Plant Journal 32, n°6 (DEC02) 949-960.

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17. Beaucoup de plantes soumises à une submersion s'allongent pour qu'une partie (souvent les inflorescences) reste émergée. C'est le cas des riz d'estuaires, par exemple, qui peuvent atteindre une taille d'une dizaine de mètres. Ce mécanisme a été étudié dans le cas de Rumex palustris, chez qui ce sont les pétioles qui s'allongent. Ceci est dû, au moins dans ce cas, par l'éthylène piégé dans la plante sous l'eau. Mais ceci se passe même dans les parties aériennes dégagées, probablement, dans ce cas, pour compenser la perte d'éthylène ainsi causée(!!!)..

Cette néo-production d'éthylène est associée à une stimulation de l'expression des gènes d'une ACC synthase (ACS1) et d'une ACC oxydase (ACO1). LA Voesenek et al.; Plant Journal 33, n°2 (JAN03) 341-352.

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18. Les gène homéotiques floraux régulés par APETALA3 (AP3) et PISTILLATA (PI) ont été caractérisés avec des réseaux d'expression basés sur 9216 ESTs d'Arabidopsis. M Zik et al.; The Plant Cell 15 (JAN03) 207-222.Les réseaux ont été confrontés avec des messagers de plusieurs mutants et de lignées transgéniques qui expriment mal ou pas du tout AP3 et/ou PI. Les résultats indiquent que ces deux gènes ne modifient l'expression que d'un petit nombre de gènes. Ceci signifie que beaucoup de gènes impliqués dans le développement des pétales et des étamines sont des gènes qui ne sont pas tissus spécifiques. Peu de gènes à expression modifiée codent des facteurs de transcription. Ceci signifie qu'AP3 et PI régulent directement les gènes sans facteurs de transcription interposés. Comme les pétales et étamines sont, comme le reste des organes floraux, des dérivés de feuilles, on devrait trouver parmi ces gènes des gènes de développement des feuilles.

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La Physiologie des Plantes

19. Des chercheurs de Cadarache ont publié une revue sur la chlororespiration. G Peltier et al.; Annual Review of Plant Biology 53 (2002) 523–550.

La chlororespiration est un système de transport d'électrons relativement contesté, interagissant, au niveau des thylakoïdes, avec le système de transport des électrons provenant de la photosynthèse.

Son existence a été l'objet de querelles continues, la possibilité d'interactions redox avec les mitochondries, notamment par les plastoquinones qui sont des intermédiaires dans les deux cas, ayant pu être invoquée.

La chlororespiration apparaît comme une voie relativement mineure dans les thylakoïdes des chloroplastes. Elle pourrait, cependant, jouer un rôle dans régulation de la photosynthèse en modulant le cycle des électrons autour du photosystème I. Dans des plastes non photosynthétiques les transporteurs d'électrons de cette voie sont plus abondants et pourraient jouer un rôle dans le bilan énergétique.

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20. L'expression de deux gènes d'invertases pariétales du caryopse (grain) d'orge (HvCWINV1 et HvCWINV2, pour Hordeum vulgare Cell Wall INVertase) et de deux transporteurs d'hexoses potentiels (HvSTP1 et HvSTP2, pour Sugar Transport Protein). Aucune enzyme correspondante n'a pu être identifiée dans la vacuole. On a, pourtant, trouvé un gène codant une sucrose:fructane 6-fructosyltransférase (HvSF6FT1), qui est une invertase acide soluble. .

HvSF6FT1 est fortement exprimé dans les régions flanquant les faisceaux vasculaires de la plante mère et, dans une moindre mesure, dans les cellules de chargement de l'albumen (filiales) qui persistent jusqu'à maturité et n'accumulent aucun amidon durant ce temps.

Inversement, HvCWINV2 est exprimé de façon précoce dans le style puis dans le péricarpe où l'amidon s’accumule de façon transitoire de façon transitoire et disparaît à la fin du développement du fruit. HvSTP2 a le même patron d'expression

Les transcrits de HvCWINV1 sont détectables dans la première couche cellulaire de cellules de l'albumen et dans la région la plus externe du nucelle. HvSTP1 est très faiblement exprimé dans le péricarpe, mais à plus haut niveau dans l'albumen syncytial. et dans les cellules de chargement évoquées plus haut. W Weschke et al.; Plant Journal 33, n°2 (JAN03) 395-411.

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21. Les gènes MYC2 (de type bHLH) et MYB2 (de type MYB) d'Arabidopsis codent des activateurs transcriptionnels dans la voie de signalisation de l'acide abscissique (ABA). H Abe et al.; The Plant Cell 15 (JAN03) 63-78.

L'induction du gène de défense contre la déshydratation rd22, est assurée par l'acide abscissique. On a pu reconnaître dans le promoteur de ce gènes des séquences reconnaissant les facteurs de transcription de types MYC et MYB. Des Arabidopsis transgéniques surexprimant des cDNAs MYC2 et:ou AMYB2 sont plus sensibles à l'ABA et des réseaux d'expression confirme la surexpression de gènes cibles de l'ABA. L'inactivation par insertion des deux gènes donne l'effet inverse attendu.

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22. Le transporteur de nitrates NRT1.1 (CHL1) est exprimé dans les cellules de garde des stomates. Dans des cellules normales, le nitrate induit une dépolarisation de la membrane et une ouverture du stomate. Les mutants chl1 voient cette fonction de transporteur d'anions supprimée et la commande de l'ouverture par les nitrates éliminée. FQ Guo et al.; The Plant Cell 15 (JAN03) 107-117.

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23. L'acide abscissique (ABA) provoque la fermeture des stomates. Deux mutants alléliques d'Arabidopsis, ost1-1 et ost1-2 incapables de limiter leurs pertes évaporatoires ont été caractérisés par des chercheurs du CNRS à Gif. Les mutations récessives ost1 entraîne un blocage de cette commande des stomates par l'ABA, ainsi que de celle de l'ouverture photoinduite par l'ABA, mais sans affecter la commande par la lumière et le CO2. C'est donc bien une altération de la commande par l'ABA.

Le gène OST1 a été cloné et les auteurs ont pu constater qu'il est exprimé dans les cellules de garde des stomates et dans les tissus vasculaires. Son produit est une kinase activée par l'ABA (AAPK). OST1 agit dans l'intervalle entre la perception de l'ABA et la production des oxygènes réactifs qui en découle. AC Mustilli et al.; The Plant Cell 14 (DEC02) 3089-3099.

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24. Les transcriptions déclenchées par l'ABA est permise par la phosphorylation, dans le noyau et au niveau de la sérine 102, d'un facteur, TRAB1, se liant à l'ADN au niveau des éléments de réponse à l'ABA dans les séquences régulatrices et autorisant la transcription. Y Kagaya et al.; The Plant Cell 14 (DEC02) 3177-3189.

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25. CTR1 code un régulateur négatif de la réponse à l'éthylène chez Arabidopsis. Le domaine C-terminal de CTR1 ressemble aux protéines kinases Raf, notamment à Raf-1, tandis que le reste de la protéine en est différent.

Plusieurs mutations suppriment la fonction kinase qui est nécessaire à l'activité de CTR1. Le domaine N-terminal n'a pas d'effet sur la fonction kinase, mais est indispensable à l'interaction avec le récepteur de l'éthylène et provoque l'interruption du signal éthylène. Y Huang et al.; Plant Journal 33, n°2 (JAN03) 221-233.

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26. L'idée d'utiliser des anticorps pour immunomoduler des enzymes n'est pas nouvelle. Pour que cela puisse marcher, il faut modifier les anticorps, car ils ne sont pas faits pour fonctionner intracellulairement, notamment à cause du cytoplasme réducteur qui empêche la formation des ponts disulfures. De plus, peu d'anticorps reconnaissent les sites actifs d'enzymes et, de ce fait ne neutralisent pas leur fonction. Des chercheurs d'Unilever utilisent des anticorps de camélidés (ce sont des anticorps monocaténaires) pour moduler les fonctions enzymatiques chez les plantes. SA Joblin et al.; Nature Biotechnology 21 (JAN03) 77-80.

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28. On savait que le locus SOS1 (Salt Overly Sensitive 1) d'Arabidopsis intervient dans l'homéostasie du sodium et du potassium. Des mutations sos1 rendent la plante sensible à une forte concentration de Na⁺ et une faible concentration de K⁺. Il code un transporteur antiport Na⁺/ K⁺.Voir, par exemple, H Shi et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97 (06JUN00) 6896-6901.

Le même groupe complète la démonstration en surexprimant le gène, commandé par le promoteur classique 35S, ce qui en présence de l'ion Na⁺ entraîne, par une modification post transcriptionnelle, l'accumulation du messager de SOS1. Le tout diminue la concentration en Na⁺ dans toute la plante. H Shi et al.; Nature Biotechnology 21 (JAN03) 81-85.

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29. Protéines kinases et protéines phosphatases commandent de façon opposée les fonctions de nombreuses protéines. Les signaux émis à partir des phytochromes sont régulés de cette façon.

On vient de montrer que les phytochromes interagissent fonctionnellement avec la sous-unité catalytique de la Ser/Thr-protéine phosphatase 2A, FyPP. Cette interaction est modulée par l'état de phosphorylation et la conformation spectrale (rouge ou rouge lointain) du phytochrome.

FyPP déphosphoryle le phytochrome A de l'avoine en présence de Fe⁺⁺ ou Zn⁺⁺. Cette enzyme est surtout présente dans les organes floraux, avec des effets sur la période de floraison. Les phytochromes ont, ainsi, un effet sur la photopériode. DH Kim et al.; The Plant Cell 14 (DEC02) 3043-56.

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30. TOC1 (TIMING OF CAB EXPRESSION1) est un composant important de l'horloge circadienne d'Arabidopsis permettant une intégration des signaux lumineux dans la régulation circadienne et dans les réponses morphogénétiques qui en résultent. P Mas et al.; The Plant Cell 15 (JAN03) 223-236. Les auteurs font partie de Department of Cell Biology and Institute for Childhood and Neglected Diseases, Scripps Research Institute, La Jolla, comme quoi les exclusives entre disciplines sont quand même bien moins évidentes aux Etats-Unis que chez nous.

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31. La lumière bleue active les canaux à Ca⁺⁺ dans les cellules du mésophylle d'Arabidopsis par la voie de la phototropine qui en est un récepteur.

Ces photorécepteurs constituent une classe de kinases particulières aux plantes. Chez Arabidopsis, phot1 et phot2 possèdent des fonctions partiellement recouvrantes. Des mutants de cryptochrome (une autre catégorie de récepteurs de la lumière bleue) ne sont pas affectés dans leurs canaux Ca⁺⁺. S Stoelzle et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (04FEB03) 1456-1461.

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32. Des chercheurs de Malaga montrent que, chez la fraise, la production de vitamine C (acide L-Ascorbique) utilise la voie de l'acide galacturonique, un composant de la paroi. Le gène GalUR, d'une D-galacturonate réductase NADPH-dépendantea été caractérisé. Ce qui est intéressant est que la réduction de la solubilisation de la paroi par répression d'une pectate lyase endogène fait baisser la teneur en vitamine C. F Agius et al.; Nature Biotechnology 21 (FEB03) 177-181.

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