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Les Productions Microbiennes

98. La séquence complète de 6,18 Mb du génome de la souche KT2440 de Pseudomonas putida a été publiée Cette séquence a été établie par un consortium comprenant The Institute for Genomic Research (TIGR), la Medizinische Hochschule Hannover, la Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung de Braunschweig), le Deutsches Krebsforschungszentrum de Heidelberg ainsi que Qiagen de Hilden. C'est, en effet, l'une des bactéries ayant démontré la plus grande versatilité dans son métabolisme. KE Neslon et al.; Environmental Microbiology 4 (DEC02) 799-808.

Le numéro de Décembre d'Environmental Microbiology est, d'ailleurs, consacré à l'analyse fonctionnelle du génome de cette bactérie. C'est un saprophyte du sol qui est habilité à exprimer des protéines hétérologues et plus généralement très utilisé dans des procédés industriels. On a, en effet, pu vérifier que malgré le fait que 85% des séquences codantes sont partagées avec Pseudomonas aeruginosa, les facteurs de virulence de cette dernière bactérie pathogène en sont absents. C'est le cas de l'exotoxine A et des systèmes de sécrétion de type III.

Cette séquence vient s'ajouter à celles de Burkholderia cepacia J23 15, Pseudomonas fluorescens PfO 01, Pseudomonas fluorescens SB W25, Rhodococcus sp. I24, Rhodococcus sp. RHA1 et Sphingomonas aromaticivorans F199.

Les chercheurs de Hannover résument les faits essentiels extraits de cette séquence dans C Weinel et al.; Environmental Microbiology 4 (DEC02) 809-818.

Quatre vingt pour cent du génome est homogène pour le contenu en GC, mais 105 îlots sont atypiques, et ce sont ceux qui contribuent à la versatilité métabolique. Vingt neuf des îlots portent des marques d'éléments mobiles, dont des introns de type II (introns catalytiques permettant une mobilité). Le plus grand de ces gènes code une protéine de surface riche en thréonine, avec une séquence très inusuelle.

D Stjepandic et al.; p.819-823 décrit les premières analyses cartographiques à haute résolution et fonctionnelles de ce génome. On trouvera, par ailleurs, quelques exploitations de ce génome dans les §132 et 133) .

La revue de LR Wackett; Nature Biotechnology 21 (FEB03) 136 138, porte sur les diverses voies métaboliques déduites.

La versatilité de cette bactérie est étonnante et, dès 1926, on recensait déjà 80 substrats utilisables par elle. C'est chez elle que l'on a découvert les oxygénases. Le génome révèle 33 gènes codant probablement des oxygénases.

Des souches de Ps.putida métabolisent ainsi de nombreuses substances naturelles comme vanilline,  pinène, limonène, mandélate, camphre, etc…, et des produits chimiques industriels comme bromoxynil (le gène correspondant est utilisé dans des plantes transgéniques résistantes à cette herbicide), styrène, methyl tertbutyl ether (MTBE), trichloréthylène et le la nitroglycérine. Les gènes codant les voies cataboliques des protocatéchuate, catéchol, p hydroxybenzoate, vanilline et arylsulfonates ont été identifiés sur le génome. On trouvera une figure illustrant une partie de ces conversions.

Les enzymes du métabolisme du toluène, des xylènes et des méthylbenzoates, se trouvent dans la souche mt-2 de Ps.putida sur le plasmide pWWO (TOL) maintes fois mentionné dans ce Bulletin. Sa séquence complète figure dans A Greated et al.; Environmental Microbiology 4 (DEC02) 856-871. Voir le § .Ce plasmide a été perdu par Pseudomonas putida KT2440, au cours de son entretien comme souche de laboratoire

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99. La séquence génomique de Clostridium acetobutylicum ATCC 824, permettait de prédire cette présence de protéines cellulosomiques. La plupart des gènes les codant sont groupés, comme chez les Clostridium cellulolytiques (Clostridium cellulovorans par exemple). L'un d'entre eux code CelG, une endoglucanase. Il a été cloné et surexprimé chez Escherichia coli, puis son produit caractérisé. Il a une forte affinité pour la cellulose, ce qui a facilité sa purification. Son expression chez Cl.acetobutylicum poussant sur divers substrat a été analysée. Alors que CelG est sécrétée chez C.cellulovorans poussant sur cellobiose ou cellulose, il ne l'est pas chez C.acetobutylicum poussant sur cellobiose ou glucose. On le détecte, cependant dans le milieu quand la bactérie pousse sur lichénanes (et xylose). AM Lopez-Contreras et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (FEB03) 869-877. Cette incapacité à hydrolyser la cellulose des Clostridium solvantogéniques reste cependant à expliquer, car c'est une importante limitation.

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102. L'utilisation du xylose des hémicelluloses est nécessaire à une bonne utilisation de la lignocellulose dans la production des solvants ou du bioéthanol.

Saccharomyces cerevisiae TMB 3399 est une souche diploïde dans laquelle ont été introduits les gènes de xylose réductase et de xylitol déshydrogénase de la levure utilisant le xylose, Pichia stipitis, ainsi qu'un gène de xylulokinase de S. cerevisiae. Le dérivé TMB 3400 a été sélectionné pour une meilleure utilisation après une mutagenèse par éthyl methanesulfonate.

On trouvera dans CF Wahlbom et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (FEB03) 740-746, une analyse moléculaire de mutants de TMB 3399, ainsi que de son dérivé amélioré TMB 3400, par les techniques d'expression globale sur glucose et xylose dans le premier cas et sur xylose uniquement dans le second. On observe chez S. cerevisiae TMB 3400 une expression stimulée de HXT5, codant un transporteur d'hexoses, de XKS1 codant une xylulokinase intervenant dans une des premières étapes de l'utilisation du xylose et, enfin, de SOL3, GND1, TAL1 et de TKL1, codant des enzymes de la voie des pentoses phosphates. De plus des régulateurs de transcription codés par YCR020C, YBR083W et YPR199C sont exprimés différemment dans les deux souches. La surexpression de YCR020C ou sa délétion n'affecte, cependant, pas l'utilisation du xylose. L'activité spécifique des xylose réductase et xylitol déshydrogénase est plus élevée pour S. cerevisiae TMB 3400.

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103###. Des chercheurs coréens montrent que l'on améliore la production de protéines hétérologues par Escherichia coli en supprimant la filamentation par co-expression des gènes ftsA et ftsZ qui interviennent dans la division cellulaire. La démonstration a été faite avec la production de leptine et d'IGF-1 (Insulin-like Growth Factor I) humains. KJ Jeong et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (FEB03) 1295-1298

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104. La production de trypsinogène bovin chez la levure Pichia pastoris est particulièrement mauvaise quand on utilise le promoteur fort de l'alcool oxydase classique avec la séquence leader d'origine. On peut expliquer cette surprise en admettant que cette protéine est toxique pour la levure. La substitution Lys6>Asp détruit le site de clivage d'activation du trypsinogène par l'entérokinase et la trypsine ce qui diminue la toxicité. Il suffit ensuite de procéder à un clivage alternatif par une dipeptidyl-aminopeptidase. C'est ce que montrent des chercheurs de Lilly Research Laboratories. J Hanquier et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (FEB03) 1108-1113.

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105. La levure méthylotrophe Pichia methanolica pourrait être utilisé pour la production de protéines hétérologues en utilisant le promoteur du gène de la méthanol-oxydase inductible (AUG1). On peut piloter la croissance de la levure sur mélange méthanol + glucose, puis la production hétérologue en jouant sur la concentration de méthanol. BE Mayson et al.; Biotechnology & Bioengineering 81 (05FEB03) 291-298. En réalité les auteurs ont utilisé une souche utilisant mal le méthanol, car délétée du gène AUG1. On peut ainsi mieux réguler l'expression par l'inducteur qui n'est pas consommé.

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106. La glycine bétaïne (N,N,N-triméthylglycine) est un osmoprotectant synthétisé en cas de stress physique. Elle est usuellement obtenue par oxydation en deux étapes de la choline. La cyanobactérie halotolérante Aphanothece halophytica procède autrement. Elle utilise deux N-méthyltransférases, dont l'une prélève les méthyles sur la S-adénosylméthionine pour les substituer à deux des trois hydrogènes, tandis que la seconde ne peut le faire que sur la diméthylglycine. Il n'y a, apparemment, aucune rétroinhibition par la bétaïne. Des substitutions ont permis de déterminer les acides aminés importants de ce point de vue. ER Waditee et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (14FEB03) 4932-4942.

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107. Des chercheurs d'Osaka décrivent comment optimiser la production d'hydrogène par une suspension à haute densité cellulaire de Rhodovulum sulfidophilum (une bactérie pourpre photoautotrophe connue également sous le nom de Rhodobacter sulfidophilus) produisant et consommant du poly(3-hydroxybutyrate) ou PHB comme substance de réserve. Dans les conditions décrites, la production à partir de PHB est plus importante qu'à partir du succinate (substrat classique dans ce cas). On cultive les cellules en aérobiose en substrat acétate pour stocker le PHB, puis on supprime le substrat, et la production d'hydrogène a lieu. I Maeda et al.; Biotechnology & Bioengineering 81 (20FEB03) 474-481.

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108. Le groupe de Zeikus à Michigan State University décrit une amélioration d'une pile à combustible biologique (utilisant des microorganismes dégradant un substrat, en l'occurence des boues activées de stations d'épuration). DH Park et al.; Biotechnology & Bioengineering 81 (05FEB03) 348-355. Les améliorations portent sur la conception des électrodes et sur le fait qu'on utilise un seul compartiment, ce qui abaisse le coût.

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109. Caldicellulosiruptor saccharolyticus (isolée en Nouvelle Zélande) est une bactérie hyperthermophile. On peut l'utiliser pour une production d'hydrogène, mais il faudrait, pour cela, éliminer les inhibitions par le substrat et le produit. La cinétique indique une inhibition non compétitive et non linéaire. L’hydrogène est un très fort inhibiteur quand on ne le soustrait pas rapidement du milieu. Sa présence induit, en effet, un basculement du métabolisme vers la production d'acide lactique.

Si on soustrait efficacement l'hydrogène, la fermentation du saccharose est alors inhibée par l'acétate. Il semble que, dans ce cas, c'est la force ionique qui est en cause. EW Van Niel et al.; Biotechnology & Bioengineering 81 (05FEB03) 255-262. Après cela, si on a encore envie d'utiliser cette bactérie peu complaisante…

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110. Des chercheurs de Bologne montrent qu'on peut utiliser des macroémulsions très stables dans des solvants organiques pour permettre une survie de longue durée de bactéries (Escherichia coli) ou levures (Saccharomyces cerevisiae ou Rhodotorula minuta). A Stefan et al.; Biotechnology & Bioengineering 81 (05FEB03) 323-328. Ces macro-émulsions sont obtenues par dispersion d'eau dans de l'isooctane à fortes concentrations (70 à 80% ) en présence de lécithines. Ces émulsions sont stables pendant des semaines. Les auteurs montrent, au passage que si on mélange deux de ces émulsions avec des bactéries marquées différemment (en l'occurence par la présence ou l'absence du plasmide F) que des échanges de masse ont lieu entre les différents domaines aqueux de l'émulsion.

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111. Les biofilms que j'avais comparé à des HLMs (Bulletin d'Avril 2002 §93) avec leurs cages d'escalier, vide-ordures, etc… sont maintenant bien connus dans le cas de Pseudomonas aeruginosa, par exemple. On vient de montrer que les espaces entre les piliers de cellules immobilisées dans la matrice polymérique enrobant les cellules sont maintenus ouverts, et difficiles à coloniser par d'autres bactéries, grâce à des surfactants rhamnolipidiques. ME Davey et al.; Journal of Bacteriology 185, n°3 (FEB03) 1027-1036.

La synthèse des rhamnolipides a lieu en milieu liquide, en phase stationnaire et dans certains conditions environnementales, sous la commande partielle de RpoS, et via le "quorum sensing" (mesure de densité des populations) par les systèmes RhlI-RhlR et LasI-LasR. Voir également le commentaire de M Espinosa-Urgel; Journal of Bacteriology 185, n°3 (FEB03) 699-700. Une article de vulgarisation sur les biofilms est paru avec dans Médecine/Science 19 (JAN03)

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112. Beaucoup de protéobactéries utilisent des acylhomosérine lactones (HSL dont le groupement acyle assure la spécificité) comme messages permettant de mesurer leurs densités de population (quorum sensing). Comme dans toutes les sociétés organisées, il existe des pickpockets. Dans ce cas, Variovorax paradoxus VAI-Cb utilise ces messages chimiques comme casse-croûte. On vient d'en découvrir un autre, Arthrobacter VAI-A, issu de la même culture qui a permis l'isolement de V. paradoxus VAI-C. La cinétique de l'utilisation de l'oxohexanoyl-HSL par cette bactérie est aberrante et indique qu'il doit se passer quelque chose d'anormal, donc intéressant. En réalité, la découverte des deux pickpockets à partir d'une même culture n'est pas une coïncidence, car il s'agit d'une bande de malfaiteurs dont Arthrobacter VAI-A utilise les restes du catabolisme de Variovorax paradoxus VAI-C. S Flagan et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (FEB03) 909-916.

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113. Des chercheurs de Princeton et de NEC Laboratories America montrent que le système de "quorum sensing" de Vibrio harveyi est, en fait, un détecteur à coïncidence des deux auto-inducteurs AI-1 et AI-2. Ces deux signaux chimiques sécrétés sont respectivement détectés par les capteurs LuxN et LuxPQ. KC Mok et al.; The EMBO Journal 22 (17FEB03) 870-881.

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