Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară a Banatului Timişoara Facultatea de Zootehnie şi Biotehnologii Doctorand: Ing

Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară a Banatului Timişoara

Facultatea de Zootehnie şi Biotehnologii
Doctorand:

Ing. Ivan (Boleman) Alexandra
REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT
ESTIMAREA VIABILITĂŢII EMBRIONILOR DE MAMIFERE DUPĂ CRITERII MORFOLOGICE ŞI TESTE DE COLORARE

Conducător ştiinţific:

Prof. Dr. Ing. Păcală Nicolae

2009

REZUMAT
Dezvoltarea embrionilor preimplantaţionali depinde de o serie de factori de origine maternă, dar şi de origine embrionară. Embrionii în stadii timpurii de dezvoltare pot creşte şi se pot diferenţia in vitro în absenţa factorilor endogeni care stimulează dezvoltarea acestora, însă manifestă adesea heterogenitate în parcurgerea stadiilor de dezvoltare, concomitent cu o variabilitate a competenţei de dezvoltare, necesitând pentru dezvoltare un timp mai îndelungat şi, cel mai frecvent, manifestă, ca răspuns la condiţiile de cultură suboptime, un număr mai redus de celule, comparativ cu embrionii dezvoltaţi in vivo.

Metodele de examinare a embrionilor au suferit schimbări semnificative în ultimii 20 de ani. Criteriile morfologice de apreciere a calităţii embrionilor au fost dezvoltate, astfel încât, să crească probabilitatea de selecţie a embrionilor apţi pentru transfer. În prezent, la bovine, transferul unui singur embrion în ziua a 3-a de la fecundaţie, asigură o rată de gestaţie de 10-30%, iar pentru un embrion în stadiul de blastocist se apreciază o rată de implantare de 40-60% (Mendoza, 2005). Îmbunătăţirea ratelor de gestaţie este strâns legată de creşterea preciziei de estimare şi selecţie a embrionilor.

Teza de doctorat intitulată ESTIMAREA VIABILITĂŢII EMBRIONILOR DE MAMIFERE DUPĂ CRITERII MORFOLOGICE ŞI TESTE DE COLORARE elaborată de doctoranda Ing. Ivan (căs. Boleman) Alexandra, sub îndrumarea domnului Prof. Dr. Ing. Nicolae Păcală, este compusă din două părţi, structurate pe 8 capitole, la care s-au adăugat concluziile generale şi recomandările. Teza cuprinde 203 de pagini din care prima parte (Studiul bibliografic) se întinde pe 59 de pagini, iar partea a doua (Cercetării proprii) cuprinde 144 de pagini.
Partea I a tezei, Studiul bibliografic, cuprinde 3 capitole, structurate astfel:
În capitolul I, intitulat Fecundaţia şi stadiile dezvoltării preimplantaţionale a embrionilor de mamifere, au fost prezentate stadiile parcurse în dezvoltarea preimplantaţională a embrionilor de mamifere.

În capitolul II, intitulat Mecanisme şi semnale implicate în dezvoltarea preimplantaţională a embrionilor de mamifere, au fost prezentate principalele mecanisme şi semnale implicate în dezvoltarea preimplantaţională a embrionilor de mamifere.

În capitolul III, intitulat Criterii morfologice şi teste de colorare pentru evaluarea calităţii embrionilor preimplantaţionali de mamifere, au fost prezentate diferite sisteme de evaluarea a calităţii embrionilor de mamifere după criterii morfologice şi teste de colorare.
În Partea a II-a a tezei, intitulată Cercetări proprii, am prezentat scopul lucrării, modelul experimental parcurs pentru atingerea obiectivelor propuse, modul de realizare al experimentelor, rezultatele şi discuţiile desprinse în urma cercetărilor efectuate.

Scopul lucrării a fost de a testa o serie de metode de evaluare a calităţii şi viabilităţii embrionilor de mamifere, în vederea selectării celei mai obiective, expeditive şi rentabile metode şi introducerea ulterioară a acesteia în lucrările practice efectuate în cadrul Laboratorului de Embriotransfer şi biotehnologii asociate embrionului şi în practica transferului de embrioni la speciile de interes zootehnic.

În vederea realizării obiectivelor propuse au fost parcurse o serie de etape de lucru după cum urmează:

1. 
   Obţinerea de embrioni. Pentru realizarea experimentelor am folosit embrioni de şoarece (în majoritatea cazurilor) obţinuţi in vivo şi embrioni de suine produşi prin fecundaţie in vitro.
   
2. 
   Aprecierea calităţii embrionilor după criterii morfologice şi realizarea de măsurători morfometrice în vederea stabilirii unei legături între calitatea embrionilor şi anumiţi parametrii morfologici cum ar fi: diametrul embrionului, grosimea zonei pelucide, diametrul blastomerelor;
   
3. 
   Alcătuirea unor grupuri de embrioni şi testarea viabilităţii acestora prin teste de colorare. Pentru această etapă am folosit 5 teste de viabilitate, pe bază de coloranţi vitali:
   

• 
  Metoda de colorare cu Trypan blue;
  
• 
  Metoda de colorare cu Neutral red;
  
• 
  Metoda de colorare cu Diacetat de fluoresceină;
  
• 
  Metoda de colorare cu Iodură de propidiu;
  
• 
  Metoda de colorare cu Diacetat de fluoresceină şi Iodură de propidiu.
  

4. 
   Testarea viabilităţii şi a capacităţii de dezvoltare în cultură a embrionilor de şoarece. Pentru această etapă s-au cultivat embrioni de şoarece, în stadii timpurii de dezvoltare (2, 4 şi 8 celule), în câteva variante de medii de cultură: mediul KSOM, mediul M16, mediul Ham’s Nutrient mixture 12 suplimentat cu 4% BSA (albumină serică bovină) şi pe mediul Ham’s Nutrient mixture 12 fără BSA. Observarea evoluţiei embrionilor s-a făcut pe o perioadă de 72 de ore, interval în care s-au apreciat stadiile de dezvoltare ale acestora.
   
5. 
   Testarea viabilităţii şi a capacităţii de dezvoltare în cultură a embrionilor de şoarece supuşi testelor de viabilitate cu Trypan blue, Neutral red, Diacetat de fluoresceină şi Iodură de propidiu. Embrionii de şoarece, supuşi protocoalelor de lucru specifice testelor de viabilitate amintite, au fost cultivaţi timp de 48 de ore în mediu de cultură adecvat (mediul M16). Evaluarea viabilităţii embrionilor s-a făcut în funcţie de capacitatea de dezvoltare a acestora în cultură, ulterior aplicării testului de viabilitate.
   
6. 
   Încercări de producere in vitro a embrionilor de suine şi evaluarea capacităţii de dezvoltare a acestora în cultură. Pentru producerea in vitro a embrionilor, am folosit ovocite recoltate din ovare provenite de la scroafe abatorizate. Ovocitele imature au fost maturate şi fecundate în laborator prin cultivarea pe medii specifice şi cultivate timp de 7 zile pe mediul de cultură SOF. Evaluarea maturării ovocitelor s-a făcut microscopic prin aprecierea gradului de dezvoltare a celulelor feeder şi prin teste de viabilitate: testul de viabilitate cu Trypan blue şi Neutral red. Ulterior etapei de fecundaţie s-au făcut observaţii cu privire la stadiile de dezvoltare atinse de embrionii obţinuţi.
   

Partea a II-a este alcătuită din 5 capitole, după cum urmează:

În capitolul IV, intitulat Obţinerea in vivo a embrionilor de şoarece, au fost prezentate modul de recoltare a embrionilor de şoarece, aspecte referitoare la prepararea mediilor de manipulare şi cultivare a embrionilor de mamifere şi compoziţia chimică a acestora şi modul de prelucrare a datelor rezultate în urma experimentelor efectuate.

În capitolul V, intitulat Stabilirea calităţii embrionilor de şoarece după criterii morfologice, am prezentat materialul şi metoda de lucru folosită pentru obţinerea embrionilor de şoarece de la femele cu ciclul normal, comparativ cu femelele supuse tratamentelor de superovulaţie şi criteriile morfologice folosite pentru evaluarea calităţii acestora.

În urma recoltării a 20 de femele donatoare rasa Swiss, cu ciclu normal, s-au obţinut 195 de embrioni, în medie 9,75±1,58 embrioni/femelă donatoare. De la femelele supuse la tratamentele de superovulaţie (37) au fost obţinuţi 741 de embrioni, în medie 20,58±2,60 embrioni/femelă donatoare.

Cei mai mulţi embrioni obţinuţi de la femelele cu ciclu normal au fost în stadiul de blastocist (76), în medie 3,80±0,98 embrioni∕femelă donatoare, valoare uşor mai ridicată, comparativ cu numărul de embrioni, în acelaşi stadiu de dezvoltare, obţinuţi de la femelele superovulate (122), la care media a fost de 2,45±1,75 embrioni∕femelă donatoare. Diferenţă apreciată statistic ca semnificativă (testul t, p≤0,05). La femele supuse tratamentelor de superovulaţie, cei mai mulţi embrioni obţinuţi au fost în stadiul de morulă (254), în medie 6,86±1,76. Compararea statistică a acestora cu embrionii în acelaşi stadiu de dezvoltare, obţinuţi de la femelele recoltate pe ciclu normal (67), în medie 3,35±1,15, a indicat diferenţe foarte semnificative statistic (testul t, p ≤0,001).

În urma aprecierii calităţii embrionilor pe baza criteriilor morfologice şi încadrării acestora în coduri de calitate s-a observat că cei mai mulţi embrioni obţinuţi (45,12%) de la femele recoltate pe ciclu normal au avut o calitate bună (codul de calitate 2), în medie de 4,40±2,63 embrioni∕femelă donatoare. În ceea ce priveşte embrionii obţinuţi de la femelele supuse tratamentelor de superovulaţie, cei mai mulţi embrioni recoltaţi (39,27%) au fost apreciaţi ca având o calitate satisfăcătoare (codul 3), în medie de 7,86±1,83 embrioni∕femelă donatoare.

Conform datelor obţinute, tratamentele de superovulaţie permit obţinerea unui număr de embrioni considerabil mai mare, comparativ cu numărul de embrioni obţinuţi de la femelele recoltate pe ciclu normal însă, adesea, o proporţie considerabilă dintre embrionii obţinuţi este încadrată în codul de calitate 4, cu o calitate slabă şi foarte slabă.

În capitolul VI, intitulat Aprecierea viabilităţii embrionilor de mamifere prin teste de viabilitate, am evaluat viabilitatea embrionilor de mamifere prin diferite metode de colorare. Metodele utilizate au testat atât capacitatea celulelor de a exclude anumiţi coloranţi cum sunt: Trypan bule sau Iodura de propidiu, cât şi de a încorpora şi de a transforma anumiţi coloranţi, ca de exemplu Neutral red şi Diacetatul de fluoresceină.

Rezultate referitoare la evaluarea viabilităţii embrionilor de şoarece după metoda cu Trypan blue

În cadrul primei grupe experimentale (Trypan blue 0,1 g/ml în mediu PBS) procentul de viabilitate al embrionilor a fost de 100%. La aceiaşi grupă experimentală, pe baza criteriilor morfologice, 40% dintre embrioni au fost evaluaţi ca fiind de calitate slabă şi foarte slabă (codul 4). Diferenţă asigurată statistic ca foarte semnificativă (testul χ²; p ≤0,001).

În cadrul celei de a 2-a grupe experimentale (Trypan blue 0,4 g/ml în mediu PBS) au fost constate diferenţe foarte semnificative statistic între procentul de embrioni viabili (97,77%) şi cel al celor neviabili (2,23%). Pe baza criteriilor morfologice, 28,88% dintre embrioni au fost încadraţi în codul de calitate 4. Diferenţă asigurată statistic ca foarte semnificativă (testul χ²; p ≤0,001).

În grupa a 3-a, după aplicarea testului de colorare (Trypan blue 0,1 g/ml în mediu M2), proporţia de embrioni viabili a fost de 92,30% şi 7,69% pentru embrionii neviabili. Pe baza criteriilor morfologice, 34,61% dintre embrioni au fost încadraţi în codul de calitate 4. Diferenţele au fost asigurate statistic ca foarte semnificative (test χ², p ≤0,001).

Pentru cea de a 4-a grupă experimentală (Trypan blue 0,4 g/ml în mediu M2), au fost de asemenea observate diferenţe foarte semnificative statistic între procentul de embrioni viabili (90,62%) şi cel al celor neviabili (9,37%). Pe baza criteriilor morfologice, procentul de embrioni de calitate slabă şi foarte slabă (codul 4) a fost de 56,25% (test χ², p ≤0,001).

În cadrul grupei a 5-a din experiment (Trypan blue 0,4%), au fost observate diferenţe foarte semnificative în ceea ce priveşte procentul de embrioni viabili (96,55%) şi cel al celor neviabili (3,44%). Aprecierea calităţii embrionilor pe baza criteriilor morfologice a indicat un procent de 34,48% de embrioni de calitate slabă şi foarte slabă (codul 4) (test χ², p ≤0,001).

Între cele 5 grupe experimentale, după aplicarea testului de colorare cu Trypan blue, nu au existat diferenţe semnificative din punct de vedere statistic (test χ², p>0,05), în ceea ce priveşte procentele de embrioni apreciaţi ca viabili şi cei neviabili.

Calculul coeficientului de corelaţie simplă a lui Pearson a indicat o corelaţie liniară pozitivă puternică (r = 0,914) între procentele de embrioni viabili, evaluaţi prin testul de viabilitate cu Trypan blue, şi a celor încadraţi în codurile de calitate 1, 2 şi 3. În cazul embrionilor evaluaţi ca neviabili s-a observat o tendinţă de scădere a corelaţiei dintre procentul de embrioni evaluaţi ca neviabili şi a celor încadraţi în codul de calitate 4 (r = 0,513).

Evaluarea viabilităţii embrionilor de şoarece pe baza criteriilor morfologice, comparativ cu testul de colorare cu Trypan blue, a indicat diferenţe foarte semnificative în ceea ce priveşte proporţia de embrioni de calitate slabă, neviabili. În urma aplicării testului de colorare cu Trypan blue am observat că pătrunderea colorantului în embrionii de calitate slabă, cu grad avansat de fragmentare, s-a făcut diferit. Numărul embrionilor evaluaţi ca neviabili prin această metodă a fost mult redus, comparativ cu numărul de embrioni evaluaţi ca nesatisfăcători pe baza criteriilor morfologice. Acest lucru considerăm că se datorează faptului că testul de colorare cu Trypan blue testează integritatea membranei celulare, iar în cazul embrionilor de calitate slabă, deşi a avut loc fragmentarea blastomerelor, zona pelucidă a rămas intactă o perioadă mai îndelungată şi nu a permis pătrunderea colorantului în celulă.

Rezultate referitoare la evaluarea viabilităţii embrionilor de şoarece după metoda cu Neutral red

Pentru evaluarea viabilităţii cu testul cu Neutral red am folosit 4 soluţii de colorare, de concentraţii diferite: 1%, 2%, 0,5% şi 0,1%. Procentele de embrioni viabili, observate în urma aplicării testului de colorare cu Neutral red, au fost ridicate la toate cele patru concentraţii folosite. Valorile maxime au fost obţinute pentru concentraţia de 1% NR (94,11%) şi, respectiv, 2% NR (93,02%). În urma comparării statistice a rezultatelor obţinute la cele 4 grupe experimentale, diferenţele au fost nesemnificative (testul χ² p>0,05).

La utilizarea în concentraţii mici a colorantului (0,1% şi 0,5%), nu s-au observat diferenţe în ceea ce priveşte gradul de penetrare a membranei celulare nici în cazul ovocitelor, nici al embrionilor testaţi. Neutral red este un colorant foarte puternic penetrant pentru membranele celulare fapt pentru care, utilizarea unor concentraţii ridicate de colorant, nu se justifică (1 - 2%).

Aplicarea coeficientului de corelaţie simplă a lui Pearson a indicat o corelaţie liniară foarte puternică (r = 0,988) între procentele de embrioni viabili, evaluaţi prin testul de colorare cu Neutral red, şi a celor încadraţi în codurile de calitate 1, 2 şi 3. În cazul embrionilor evaluaţi ca neviabili şi cel al embrionilor încadraţi în codul de calitate 4, corelaţia a fost mult mai scăzută (r = 0,239).

Acumularea intracelulară a colorantului are loc, în cantităţi mai reduse, şi în cazul embrionilor de calitate slabă, cu diferite grade de fragmentare. Acest lucru poate conduce la erori în procesul de evaluarea şi creşte subiectivitatea acestui test în evaluarea viabilităţii embrionilor.

Neutral red este un colorant cationic capabil de a penetra cu uşurinţă membranele celulare şi de a se acumula la nivelul lizozomilor. Studii recente au evidenţiat faptul că, alături de modificările produse la nivel mitocondrial, modificarea permeabilităţii membranei lizozomale reprezintă un eveniment declanşator al apoptozei celulare (Wei Chen, et al., 2005). Pe baza acestor considerente, capacitatea de legarea a colorantului Neutral red la membrana lizozomală scade în embrionii cu grad foarte avansat de fragmentare. Cantitatea de colorant acumulată în embrionii nesatisfăcători, deşi redusă comparativ cu cea acumulată în embrionii cu blastomere nefragmentate, poate induce erori de evaluare a viabilităţii, ceea ce creşte subiectivitatea acestei metode.

Rezultate referitoare la evaluarea viabilităţii embrionilor de şoarece după metoda cu Diacetat de fluoresceină

Pe baza criteriilor morfologice, din cei 37 de embrioni testaţi, 18 (64,8%) dintre aceştia au fost evaluaţi ca slabi/foarte slabi, iar în urma testului de viabilitate cu Diacetat de fluoresceină 15 embrioni (35,2%) au fost evaluaţi ca neviabili. Diferenţă asigurată statistic şi interpretată ca distinct semnificativă (test χ², p ≤0,01).

Aplicarea testului cu Diacetat de fluoresceină a indicat activitate enzimatică şi în embrionii cu grad avansat de fragmentare care, conform metodei după criterii morfologice, au fost încadraţi în codul de calitate 4, cu o calitate slabă şi foarte slabă. Testul de viabilitate cu Diacetat de fluoresceină pentru testarea activităţii esterazice din celule este simplu, rapid şi poate fi folosit cu eficienţă pentru testarea activităţii enzimatice a celulelor şi, totodată, a integrităţii membranei celulare.

Rezultate referitoare la evaluarea viabilităţii embrionilor de şoarece după metoda cu Iodură de propidiu

Prin metoda cu Iodură de propidiu au fost evaluaţi 53 de embrioni, împărţiţi în 2 grupe experimentale (Iodură de propidiu 50 μl/ml mediu PBS şi Iodură de propidiu 50 μl/ml mediu M2).

Pentru prima grupă experimentală, la care s-a testat viabilitatea embrionilor cu soluţia Iodură de propidiu 50 μl/ml mediu PBS, procentul de embrioni viabili a fost de 82,14%, iar a celor neviabili a fost de 17,86%. Diferenţa a fost estimată ca foarte semnificativă (testul χ², p ≤0,001). Pentru grupa a doua, din cadrul experimentului (Iodură de propidiu 50 μl/ml mediu M2), procentul de embrioni viabili a fost de 80%, iar a celor neviabili a fost de 20%. Diferenţa a fost estimată ca foarte semnificativă (testul χ², p ≤0,001).

Aplicarea coeficientului de corelaţie a lui Pearson a indicat o corelaţie foarte strânsă (r = 0,989) între cele două metode utilizate pentru evaluarea calităţii şi viabilităţii embrionilor de şoarece, ceea ce sugerează utilizarea testului de colorare cu Iodură de propidiu ca o metodă obiectivă pentru evaluarea viabilităţii embrionilor.

În urma testelor efectuate nu au existat diferenţe semnificative din punct de vedere statistic (test χ², p>0,05) între grupele experimentale, ceea ce indică faptul că solvenţii folosiţi pentru prepararea soluţiei de colorare (mediul PBS – grupa 1 şi mediu M2 – grupa 2 ) nu influenţează semnificativ rezultatele, alegerea acestuia rămânând un considerent economic.

Acest test de viabilitate permite marcarea celulelor cu membrana celulară deteriorată şi în care nu mai este prezentă activitate metabolică. Testul de viabilitate cu Iodură de propidiu este un test rapid, protocolul de lucru este simplu şi neinvaziv pentru celulele viabile în interiorul cărora Iodura de propidiu nu poate pătrunde. Legarea selectivă, doar la nivelul nucleului celulelor în care nu mai este prezentă activitate metabolică, indică testul de viabilitate cu Iodură de propidiu, ca fiind obiectiv şi neinvaziv. Acesta se poate utiliza pentru testarea viabilităţii embrionilor de mamifere, fără a ridica probleme asociate cu toxicitatea la nivel celular, datorată acumulării şi incapacităţii de metabolizare a substanţelor de marcare utilizate.

Rezultate referitoare la evaluarea viabilităţii embrionilor de şoarece după metoda cu Diacetat de fluoresceină şi Iodură de propidiu

Pentru evaluarea viabilităţii embrionilor prin testul cu Diacetat de fluoresceină şi Iodură de propidiu am utilizat un amestec al celor doi coloranţi care să ne permită marcarea simultană atât a celulelor viabile cât şi a celor neviabile. Embrionii consideraţi viabili au emis fluorescenţă verzuie la expunerea la o sursă de fluorescenţă cu o lungime de undă de 494-518 nm, lungime de undă corespunzătoare spectrului de absorbţie pentru fluoresceină şi cei consideraţi neviabili au emis fluorescenţă roşie, la expunerea la o sursă de fluorescenţă cu o lungime de undă de 515-560 nm, corespunzătoare pentru Iodura de propidiu.

În urma aplicării testului de viabilitate cu Diacetat de fluoresceină şi Iodură de propidiu din cei 28 de embrioni evaluaţi, 25 (86,22%) au fost apreciaţi ca fiind viabili (au emis fluorescenţă verzuie la expunerea la o sursă de fluorescenţă cu o lungime de undă de 494-518 nm) şi 4 (13,79%) au fost apreciaţi ca fiind neviabili (au emis fluorescenţă roşie la expunerea la o sursă de fluorescenţă cu o lungime de undă de 515-560 nm).

Compararea statistică a datelor obţinute a indicat diferenţe foarte semnificative (testul χ2, p ≤0,001) între procentul de embrioni viabili şi cel al embrionilor apreciaţi ca fiind neviabili.

Imaginile 6,36; 6,37; 6,38; 6,39 indică avantajele folosirii, în paralel, a celor doi coloranţi (Diacetat de fluoresceină şi Iodură de propidiu) pentru testarea viabilităţii embrionilor. Totodată, ele evidenţiază neajunsurile tehnicii de evaluare a viabilităţii embrionilor pe baza criteriilor morfologice. Evaluarea viabilităţii embrionilor doar pe baza criteriilor morfologice nu oferă informaţii cu privire la prezenţa activităţii enzimatice şi metabolice în celule.

Deşi, din aceste puncte de vedere, folosirea testelor de viabilitate pe bază de coloranţi, capabili să marcheze prezenţa sau absenţa în celule a activităţii metabolice, pare a fi mai obiectivă. Coloranţii ridică totuşi problema toxicităţii la nivel celular.

În capitolul VII, intitulat Determinarea viabilităţii embrionilor de şoarece prin cultivarea in vitro pe termen scurt, am urmărit modul de dezvoltare în cultură al embrionilor de şoarece supuşi colorării cu coloranţi vitali şi modul de dezvoltare a embrionilor de şoarece pe diferite medii de cultură (M 16, KSOM, HAM F 12 suplimentat cu 4% BSA şi HAM F12 fără BSA). Cu embrionii care s-au dezvoltata până în stadiul de morulă şi blastocist au fost efectuate câteva măsurători morfometrice (grosimea zonei pelucide, diametrul interior şi exterior, perimetrul interior şi exterior al embrionului).

Rezultate referitoare la aprecierea dezvoltării in vitro a embrionilor de şoarece supuşi testelor de colorare pentru evaluarea viabilităţii şi calităţii acestora

Metodele de colorare, deşi se doresc a fi neinvazive pentru embrioni, folosesc anumiţi coloranţi care au capacitatea de a penetra zona pelucidă şi de a ajunge în interiorul embrionilor unde fie se acumulează, fie intră în diferite căi metabolice şi suferă diferite transformări (Diacetatul de fluoresceină este hidrolizat sub acţiunea esterazelor celulare la fluoresceină). Cultivarea embrionilor s-a făcut pe o perioadă de 48 de ore.

După 24 de ore de cultivare in vitro pe mediu M 16, la toate variantele experimentale a fost atins stadiul de morulă. Diferenţele procentuale între proporţia de embrioni care au evoluat până în stadiul de morulă au fost asigurate statistic ca fiind distinct semnificative (testul χ² , p ≤0,01), 56,66% pentru grupul control, 21,73% pentru grupul tratat cu FDA şi Pi, 19,04% pentru grupul testat cu Neutral red şi 16,66% pentru grupul testat cu Trypan blue.

După 48 de ore de cultivare, procentul de embrioni care au continuat dezvoltarea a fost redus, faţă de proporţia de embrioni retardaţi (test χ², p ≤0,001). Doar la grupul control au fost embrionii au evoluat până în stadiul de eclozare (13,33%). La restul grupelor experimentale, embrionii şi-au continuat dezvoltarea până în stadiul de blastocist expandat (FDA şi Pi - 4,34% şi NR – 4,76%), blastocist propriu-zis (FDA şi Pi - 13,04% respectiv 4,76% pentru grupul tratat cu Neutral red) şi morulă compactă (4,76% pentru grupul tratat cu Neutral red).

În urma cultivării s-a putut observa că şi embrionii expuşi colorării cu Neutral red au fost capabili să evolueze în dezvoltare până în stadiu de blastocist expandat (4,76%). Aceste rezultate, indică capacitatea celulelor de a metaboliza coloranţi folosiţi. Deşi, procentul de embrioni retardaţi a fost mare pentru ambele teste folosite (FDA şi Pi – 73,91%, respectiv 80,95% pentru testul cu Neutral red) totuşi nu au fost semnificative statistic (p>0,05), faţă de procentul de embrioni observaţi ca retardaţi în grupul de control.

Surprinzător a fost procentul de embrioni retardaţi, observat la grupul de embrioni testaţi cu Trypan blue (87,55%), comparativ cu procentul de embrioni retardaţi observat la grupul de control (56,68%). Diferenţă asigurată statistic ca semnificativă (p≤0,05).

Embrionii care au reuşit să se dezvolte până în stadiul de blastocist, indică faptul că aceştia sunt capabili să metabolizeze coloranţii (Diacetatul de fluoresceină şi Neutral red) dar, procentul mare de embrioni întârziaţi indică o oarecare încetinire până la blocarea capacităţii de dezvoltare a acestoara.

Rezultate referitoare la evaluarea viabilităţii embrionilor de şoarece prin cultivarea in vitro pe durată scurtă de timp

Capacitatea de dezvoltare a embrionilor, pe parcursul cultivării in vitro, a variat foarte mult, între cele 4 variante experimentale (M 16, KSOM, HAM F 12 suplimentat cu 4% BSA şi HAM F12 fără BSA). La 24 de ore de cultivare, două dintre variantele experimentale folosite s-au detaşat: mediul Nutrient mixture Ham F 12, suplimentat cu BSA, în care 19,14% dintre embrioni au fost în stadiul de blastocist incipient, respectiv 8,51% embrioni în acelaşi stadiu de dezvoltare în mediul M 16.

După 48 de ore de cultivare, la 3 dintre variantele experimentale (KSOM, M16 şi Ham F 12 cu 4% BSA) s-au observat diferenţe foarte semnificative statistic (test χ² , p ≤0,001) între embrionii în stadiul de blastocist expandat. Procentul cel mai mare de embrioni în stadiul de blastocist expandat a fost observat în mediul M 16 (34,02%), iar cel mai mic în mediul HAM F 12 cu 4% BSA (6,38%).

După 72 de ore de cultivare, mediul M16 a fost singurul mediu în care 14,90% dintre embrioni au atins stadiul de blastocist eclozat.

La ambele variante de mediu Nutrient mixture Ham F12 (suplimentat cu 4% BSA, respectiv fără BSA), după 72 de ore de cultivare, toţi embrionii obţinuţi au fost încadraţi ca retardaţi sau degeneraţi. Proporţii ridicate de embrioni degeneraţi au fost observate şi la mediul KSOM (63,04%). Între mediul KSOM şi HAM F 12, suplimentat cu 4% BSA, nu au fost observate diferenţe semnificative statistic (test χ² , p>0,05), în ceea ce priveşte proporţia de embrioni retardaţi, respectiv degeneraţi.

Rezultate referitoare la efectuarea de măsurători morfometrice pe embrionii de şoarece obţinuţi in vivo şi supuşi cultivării ulterior evaluării viabilităţii acestora prin teste de viabilitate

Parametrii urmăriţi în cadrul experimentelor realizate au fost: grosimea zonei pelucide, diametrul interior şi exterior al embrionului, perimetrul interior şi exterior al embrionului. Determinarea parametrilor s-a realizat cu ajutorul softului Quick Photo Micro 2.2.

La embrionii supuşi cultivării in vitro s-a observat o tendinţă de creştere a valorilor parametrilor urmăriţi. Grosimea zonei pelucide a variat de la 9,8±1,7 µm la embrionii în stadiul de morulă recoltaţi la 72 de ore de la observarea dopului vaginal, până la 11,1±1 µm, la embrionii cultivaţi in vitro şi supuşi colorării, cu coloranţi vitali. Diferenţa fiind nesemnificativă statistic (p>0,05). O variaţie asemănătoare se poate observa şi la ceilalţi parametrii studiaţi: diametrul interior (de la 98,4±3,3 µm, la 111,6±3,2 µm,) şi exterior al embrionului (de la 116,7±2,5 µm, la 129,4±4,8 µm), perimetrul interior (de la 302±0,5 µm, la 338±0,4 µm) şi perimetrul exterior (de la 352±0,8 µm, la 391±0,4 µm). Aceleaşi diferenţe se observă şi în cazul embrionilor în stadiul de blastocist (6,2±0,5 µm la embrionii recoltaţi în stadiul de blastocist la 72 de ore de la observarea dopului vaginal şi 8,7±1 µm la embrionii supuşi testelor de colorare anterior cultivării).

Valorile obţinute la măsurarea parametrilor embrionilor cultivaţi in vitro, fără a fi supuşi colorării în vederea evaluării viabilităţii, au fost uşor mai ridicate, comparativ cu valorile observate la embrionii obţinuţi in vivo, recoltaţi la 72 de ore de la observarea dopului vaginal (10,8±1,2 µm la embrionii cultivaţi in vitro respectiv 9,8±1,7 µm pentru grosimea zonei pelucide a embrionilor recoltaţi în stadiul de morulă la 72 de ore de la observarea dopului vaginal), diferenţele nu au fost semnificative statistic (p>0,05).

Embrionii supuşi testelor de viabilitate au avut valori uşor mai ridicate, comparativ cu embrionii cultivaţi in vitro, fără a fi coloraţi, însă nu au fost observate diferenţe semnificative statistic între aceste valori (10,8±1,2 µm, respectiv 11,1±1 µm, pentru grosimea zonei pelucide la morulele supuse testelor de viabilitate şi 7,3±1 µm, şi 8,7±1 µm, pentru embrionii în stadiul de blastocist).

În capitolul VIII, intitulat Evaluarea viabilităţii embrionilor produşi in vitro, am urmărit evaluarea viabilităţii embrionilor de suine produşi in vitro pornind de la ovocite recoltate din ovare provenite de la scroafe abatorizate. Protocolul de lucru a inclus maturarea in vitro a ovocitelor, urmată de fecundaţia in vitro a acestora şi cultivarea in vitro a zigoţilor obţinuţi timp de 7 zile pe mediul de cultură SOF (Synthetic oviductal fluid).

În urma experimentelor realizate am observat că ovocitele cu cumulus ooforus (COC) se maturează in vitro într-o proporţie mai mare (73,68%), comparativ cu ovocitele fără cumulus ooforus (9,67%), diferenţele au fost distinct semnificative (p ≤0,001).

Referitor la ratele de fecundaţie in vitro, cei mai mulţi embrioni s-au obţinut din ovocitele cu cumulus ooforus (73,68%), comparativ cu ovocitele fără cumulus (9,67%), diferenţele au fost foarte semnificative statistic (p ≤0,001).

După parcurgerea protocolului în vederea fecundaţie in vitro, la 72 de ore de cultivare dintre cele 28 de ovocite cu celule cumulare evaluate ca fecundate am obţinut 2 embrioni în stadiul de două celule (7,14%) şi 9 embrioni în stadiul de 4 celule (32,14%), 20 dintre ovocite (71,43%) au fost evaluate ca degenerate.

După 7 zile de cultivare în mediul SOF, din cele 28 de ovocite cu celule cumulare s-au obţinut 2 embrioni în stadiul de morulă (7,14%), 3 embrioni în stadiul de 8 celule (10,71%), 5 în stadiul de 4 celule (17,86%), 1 în stadiul de 2 celule (3,57%) şi 17 degeneraţi (60,71%). Compararea statistică a datelor obţinute a indicat diferenţe foarte semnificative între numărul de embrioni degeneraţi şi cei aflaţi în curs de dezvoltare (test χ², p ≤0,001).

Ratele foarte reduse de dezvoltare a embrionilor indică mediul SOF ca fiind nesatisfăcător pentru a asigura cerinţele embrionilor de suine produşi in vitro aflaţi în dezvoltare, şi determină un procent foarte mare de embrioni degeneraţi (60,71%).

Rezultate referitoare la aprecierea viabilităţii ovcitelor de suine prin colorarea cu Trypan blue şi Neutral red

Capacitatea de dezvoltare a ovocitelor include abilitatea acestora de a forma un embrion viabil după parcurgerea procedeului de fertilizare in vitro. Această abilitate este condiţionată de maturarea citoplasmatică şi nucleară a ovocitei. În condiţii naturale, ovocitele prezintă o competenţă ridicată de dezvoltare, dar atunci când mediul natural este înlocuit cu un mediu artificial, iar procesul se desfăşoară în cadru experimental, capacitatea de dezvoltare a ovocitelor scade drastic în ciuda optimizărilor aduse în acest domeniu (Lucid, et al., 2003, Rath et al., 1995, Nimann, et al., 2001).

În urma cultivării în mediul de maturare pe baza aspectului morfologic, la 46 de ore, 42% dintre ovocitele cultivate în prima variantă experimentală (TCM –IVM suplimentat cu 10% FSB - ser fetal bovin) şi 50% dintre ovocitele cultivate în mediu TCM-IVM suplimentat cu 10% FSB şi hormonii au fost apreciate ca fiind maturate. Diferenţa nu a fost semnificativă (Test χ² p>0,05).

În urma aplicării testului de colorare cu Trypan blue, din totalul de 52 de ovocite cultivate în mediu de maturare TCM-IVM suplimentat cu 10% FSB, 100% au fost apreciate ca fiind viabile (au rămas necolorate după expunerea la Trypan blue). Acelaşi procent (100%) a fost observat şi pentru ovocitele cultivate pe mediu TCM-IVM, suplimentat cu 10% FSB şi hormoni. Diferenţe foarte semnificative (test χ² , p ≤0,001) au fost observate între proporţia de ovocite evaluate ca fiind viabile comparativ cu cele neviabile. Nu au fost observate diferenţe semnificative (test χ² , p>0,05) între rezultatele obţinute prin cele două variante de mediu de maturare.

În urma aplicării testului de colorare cu Neutral red, din 55 de ovocite cultivate pe mediul TCM-IVM suplimentat cu 10%FSB, 39 (70,90%) au fost evaluate ca fiind viabile, iar 16 (29,10%) au fost evaluate ca fiind neviabile. Compararea statistică a rezultatelor obţinute a indicat diferenţe foarte semnificative (test χ² , p ≤0,001) între procentul de ovocite evaluate ca fiind viabile, comparativ cu procentul de ovocite neviabile.

Dintre cele 24 de ovocite cultivate pe mediul TCM-IVM suplimentat 10% FSB şi hormoni, 19 (79,16%) au fost evaluate ca fiind viabile, iar 5 (20,08%) au fost evaluate ca fiind neviabile. Compararea statistică a rezultatelor obţinute a indicat diferenţe foarte semnificative (test χ² , p ≤0,001) între procentul de ovocite evaluate ca fiind viabile, comparativ cu procentul de ovocite neviabile.

Nu au fost observate diferenţe semnificative (test χ², p>0,05) între proporţia de ovocite viabile, obţinută în mediul suplimentat doar cu 10% FSB (70,90%), comparativ cu proporţia de ovocite viabile, obţinută în mediul suplimentat cu 10% FSB şi hormoni (79,16%).

Concluzii generale

1. 
   Deşi aplicarea tratamentelor de superovulaţie influenţează calitatea embrionilor obţinuţi cei mai mulţi embrioni (39,27%) au fost încadraţi în codul de calitate 3, comparativ cu embrionii obţinuţi de la femelele recoltate pe ciclu normal care au fost încadraţi în codul de calitate 2 (45,12%), totuşi aplicarea tratamentelor de superovulaţie permite obţinerea unui număr de embrioni considerabil mai mare, în medie 20,58±2,60 embrioni/femelă donatoare, comparativ cu numărul mediu de embrioni obţinuţi de la femelele recoltate pe ciclu normal 9,75±1,58 embrioni/femelă donatoare.
   
2. 
   Testul de viabilitate cu Diacetat de fluoresceină şi Iodură de propidiu poate fi folosit cu succes pentru evaluarea viabilităţii embrionilor de şoarece. Acesta asigură marcarea simultană a celulelor în care este prezentă activitate enzimatică şi a celor în care activitatea metabolică a încetat.
   
3. 
   În urma testelor efectuate nu au existat diferenţe semnificative din punct de vedere statistic (test χ², p>0,05) între grupele experimentale la care dizolvarea colorantului s-a realizat direct în mediul PBS şi mediul M 2, ceea ce indică faptul că solventul folosit pentru prepararea soluţiei de colorare nu influenţează semnificativ rezultatele, alegerea acestuia rămânând un considerent economic.
   
4. 
   Referitor la embrionii supuşi testelor de colorare şi cultivaţi pe durată scurtă de timp (48 de ore) în mediul M 16, se observă că procentul de embrioni porniţi în dezvoltare scade după primele ore de cultivare. Astfel, doar la grupul control au fost observaţi embrioni în stadiul de blastocist eclozat (13,33%). La restul grupelor experimentale embrionii şi-au continuat dezvoltarea până în stadiul de blastocist expandat (FDA şi Pi 4,34% şi NR – 4,76%), blastocist propriu-zis (FDA şi Pi - 13,04% respectiv 4,76% pentru grupul tratat cu Neutral red). Diferenţele dintre grupele experimentale şi lotul martor au fost nesemnificative statistic (p>0,05).
   
5. 
   În urma aplicării testelor de viabilitate se poate observa că doar testele cu FDA+Pi şi NR au permis dezvoltarea embrionilor până în stadiul de blastocist expandat (4,34% şi respectiv 4,76%). Surprinzător, embrionii supuşi testării cu TB şi-au oprit dezvoltarea în stadiul de morulă (12,5%).
   
6. 
   Referitor la intervalul de timp în care s-a efectuat cultivarea embrionilor de şoarece produşi in vivo (24 – 72 de ore), se observă că o proporţie mare din embrionii porniţi în dezvoltare în primele ore de cultivare se prezintă ca retardaţi spre sfârşitul intervalului. La 48 de ore de cultivare in vitro cei mai mulţi embrioni retardaţi s-au observat în mediul KSOM (36,95%), iar proporţia cea mai redusă s-a observat în mediul Nutrient mixture Ham F 12, cu 4% BSA (2,12%). Diferenţele au fost apreciate ca foarte semnificative (test χ2 , p≤0,001). La 72 de ore de cultivare, procentele de embrioni degeneraţi au crescut în mediul KSOM (63,04%), Nutrient mixture Ham F 12, cu 4% BSA (46,80%) şi au fost de 100% în mediul Ham F 12, fără BSA.
   
7. 
   În ceea ce priveşte mediile de cultivare utilizate pentru cultivarea embrionilor de şoarece produşi in vivo (KSOM, M 16, Ham F 12 cu 4% BSA şi Ham F 12 fără BSA), se observă că mediul M 16 a fost singurul mediu care a susţinut dezvoltarea embrionilor până în stadiul de blastocist eclozat (14,90%). Un număr redus de embrioni au evoluat până în stadiul de blastocist expandat în mediul KSOM (8,69%) şi în mediul Ham F 12 suplimentat cu 4% BSA (6,38%).
   
8. 
   Cultivarea in vitro a embrionilor de şoarece pe medii de cultură sintetice determină creşterea uşoară a grosimii zonei pelucide. Valorile obţinute variază de la 9,8±1,7 µm, la embrionii în stadiul de morulă recoltaţi la 72 de ore de la observarea dopului vaginal, până la 11,1±1 µm, la embrionii cultivaţi in vitro şi supuşi colorării, cu coloranţi vitali. Diferenţele sunt nesemnificative (p>0,05).
   
9. 
   Grosimea zonei pelucide, la embrionii supuşi testelor de viabilitate, a avut valori uşor mai ridicate, comparativ cu embrionii cultivaţi in vitro fără a fi coloraţi, însă nu au fost observate diferenţe semnificative statistic între aceste valori (p>0,05) (10,8±1,2 μm, respectiv 11,1±1 μm pentru grosimea zonei pelucide la morulele supuse testelor de viabilitate şi 7,3±1 μm şi 8,7±1 μm pentru embrionii în stadiu de blastocist).
   
10. 
    Referitor la ratele de fecundaţie in vitro, cei mai mulţi embrioni se obţin din ovocitele cu cumulus ooforus (73,68%), comparativ cu ovocitele fără cumulus (9,67%), diferenţele sunt foarte semnificative statistic (p ≤0,001).
    
11. 
    Ratele foarte reduse de dezvoltare a embrionilor indică mediul SOF ca fiind nesatisfăcător pentru a asigura cerinţele embrionilor de suine produşi in vitro, aflaţi în dezvoltare, şi determină un procent foarte mare de embrioni degeneraţi (60,71%).
    
12. 
    Utilizarea testelor de viabilitate (Trypan blue şi Neutral red) pentru evaluare viabilităţii ovocitelor pot să completeze metoda de evaluare pe baza aspectului morfologic, însă nu o pot înlocui în totalitate. De asemenea, trebuie acordată atenţie modului în care capacitatea de dezvoltare şi formare a viitorului embrion este afectată de utilizarea coloranţilor vitali în stadii incipiente ale procesului de formare.
    

Recomandări

1. 
   Pentru prepararea soluţiei de lucru cu Diacetat de fluoresceină recomandăm utilizarea acetonei ca solvent, deoarece asigură o dizolvare rapidă, în proporţie de 90%, a Diacetatului de fluoresceină şi previne rămânerea în suspensie a colorantului.
   

2. 
   Pentru evaluarea viabilităţii embrionilor de mamifere recomandăm utilizarea în paralel a metodei după criterii morfologice si a testului de viabilitate prin colorare simultană cu Diacetat de fluoresceină (FDA) şi Iodură de propidiu (Pi), deoarece acesta creşte precizia evaluării şi permite testare atât a celulelor viabile (FDA), cât şi celulelor neviabile (Pi).
   

3. 
   Nu recomandăm cultivarea in vitro a embrionilor în medii de cultură simple, complexe şi sintetice pe o perioadă mai mare de 48 de ore, deoarece după acest interval s-a observat stagnarea dezvoltării acestora şi apariţia proceselor degenerative. De asemenea, în cazul embrionilor supuşi anterior testelor de colorare, nu recomandăm cultivarea pe o perioadă mai lungă de 24 de ore, deoarece pe lângă influenţa negativă a mediului artificial, utilizarea coloranţilor determină scăderea viabilităţii embrionilor aflaţi în cultură.
   

4. 
   În urma rezultatelor observate nu recomandăm utilizarea mediului SOF pentru cultivarea embrionilor de suine produşi in vitro deoarece, acesta nu poate asigura cerinţele embrionilor de suine aflaţi în dezvoltare şi determină un procent mare de embrioni degeneraţi (60,71%).
   

5. 
   Pentru procedeele de obţinere in vitro a embrionilor de suine recomandă utilizarea ovocitelor cu cumulus ooforus a căror rată de producere a embrionilor este de aproximativ 40%. În urma utilizării ovocitelor fără celule cumulare, în cadrul procedeelor de producere in vitro a embrionilor, se obţine un număr redus de embrioni de calitate foarte proastă.