University of medicine and pharmacy of craiova
Yüklə 118,66 Kb.
|
|
UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE DIN CRAIOVA FACULTATEA DE MEDICINA TEZA DE DOCTORAT Dinamica şi semnificaţia citokinelor în cele 3 faze ale evoluţiei marilor arşi Coordonator Stiinţific, Prof.Univ. Dr. Florea Purcaru Doctorand, Novac Marius Bogdan
Craiova
2010 CUPRINS
DATE GENERALE. Stadiul cunoaşterii. I. Evaluarea şi definirea categoriei marilor arşi Arsurile ramân o importantă cauză de mortalitate şi morbiditate pe plan mondial. Complicaţiile infecţioase care includ sepsisul, şocul septic şi insuficienţa organică multiplă reprezintă o patologie comună la pacienţii cu arsuri moderate şi severe. În 1992 a fost stabilit un consens al definiţiilor pentru diagnosticul SIRS şi MODS (7).În anul 2001, The International Sepsis Definitions Conference care a avut loc la Washington D. C., prin întâlnirea a 29 participanţi din Europa şi America de Nord, a revizuit şi actualizat definiţiile referitoare la SIRS, sepsis, MODS. Scopul acestei conferinţe a fost de a identifica metodologia pentru creşterea acurateţii, a reabilitării şi/sau a utilizării clinice a definiţiei sepsisului. În ianuarie 2007, American Burn Asociation a organizat o Conferinţă de consens pentru definirea unui consens al sepsisului şi infecţiei la arşi. Utilizând sistemul acestei clasificări, la Conferinţa de Consens din 2001 s-a implementat o schemă de clasificare numita PIRO: condiţii Predispozante, natura şi extensia Injuriei, natura şi magnitudinea Răspunsului organismului, şi gradul disfuncţiei Organelor. Statusul inflamator postagresional a fost definit clinic ca SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome). SIRS poate duce la sindromul de disfuncţie organică multiplă (MODS) şi moarte, în special dacă apar complicaţiile infecţioase Evaluarea leziunilor de arsură Clasificare: în raport cu agenţii vulneranţi arsurile se clasifică în:
Clasificarea leziunilor de arsură Arsura este o boală care debutează în momentul lezării tegumentelor, are o evoluţie sistemica , afectează toate sistemele şi organele arsului şi se continuă mult timp după ce leziunile locale au fost vindecate. Toate aceste elemente necesită o supraveghere a bolnavului ars cu evaluarea leziunilor şi stabilirea unui prognostic. În acest sens s-a propus o clasificare a arsurilor ţinându-se seama de două repere histologice: joncţiunea dermo-epidermică delimitată de stratul bazal al epidermului (epiteliu germinativ) şi anexele cutanate, reprezentate de foliculul pilos, glandele sebacee şi sudoripare, elemente deosebit de importante, deoarece ele sunt tapetate de un epiteliu germinativ, esenţial în vindecare. II. Fiziopatologia şocului la marii arşi în cele 3 faze evolutive Trigger-ul răspunsului sistemic Leziunea locală de arsură este rezultatul unui transfer de caldură asupra ţesuturilor şi reprezintă o entitate dinamică. Sistemul imunitar de apărare acţionează împotriva infecţiei, prin ambele mecanisme de apărare, înnăscută sau naturală şi dobândită. Apărarea adaptativă implică o rearanjare a genelor, produce celule T şi B înalt specializate pentru recunoaşterea antigenilor. Apărarea prin imunitate înnăscută, în contrast, este rapid mobilizabilă şi este bactericidă. Citokinele proinflamatorii (TNF-alfa, IL-1beta, IL-12, interferon) şi chemokinele (IL-8 şi altele) joacă un rol esenţial în apărarea locală. Anticorpii naturali, alternativa căii complementului şi inflamaţia locală sunt mecanisme de apărare înnăscută (9).
Ţesuturile devitalizate acţionează ca un self-antigen şi reprezintă un puternic activator al sistemului complementului. În acelaşi timp, limfokinele stocate în ţesuturi sau produse de celulele lezate stimulează invazia monocitelor şi le potenţează maturizarea, acestea fiind celulele responsabile cu devitalizarea şi curăţarea arsurii prin procesul de fagocitoză sistemică, ceea ce agravează cea de a doua insultă. Teoria „two-hit“ (63), se referă la faptul că două evenimente secvenţiale activatoare pot determina un răspuns maxim care poate provoca o inflamaţie sistemică. Răspunsul organismului la injuria termică se manifestă prin multiple modificări care acţionează în sens constructiv sau distructiv, în funcţie de managementul cazului. Aspecte fiziologice ale răspunsului la injuria termică Faza I sau faza de iniţiere a inflamaţiei Injuria ţesuturilor duce la activarea a cinci iniţiatori ai inflamaţiei, iniţiatori care sunt interactivi şi provoacă elaborarea mediatorului secundar sau a semnalului efector. Faza a II-a sau răspunsul fagocitar De la nivelul epicentrului leziunii spre site-urile receptoare ale celulelor endoteliale vasculare are loc difuziunea chemokinelor, cu activarea neutrofilelor şi a chemokinelor cu specificitate pentru neutrofile. Răspunsul sistemic are o serie de acţiuni pozitive
Răspunsul sistemic previne inflamaţia la nivelul altor ţesuturi prin neutralizarea moleculelor care induc inflamaţia, ca de exemplu citokinele, proteazele şi oxidanţii, care intră în sistemul sanghin, prin diminuarea răspunsului proinflamator al leucocitelor circulante. Chiar dacă răspunsul local al ţesutului distrus este predominant proinflamator, multe celule antiinflamatoare sau modulatoare sunt produse la nivel local. S-a constatat că deşi se produc în general mediatori proinflamatori locali, concentraţia celulelor antiinflamatoare este mai mare la nivelul inflamaţiei locale decât concentraţia lor sanghină. Răspunsul sistemic normal poate fi imunosupresiv ! In ATI se ştie că trauma poate induce imunosupresie. Intensa activare a răspunsului sistemic normal, instalat posttraumă, poate induce un status de paralizare a imunităţii, aşa numita „imunosupresie endogenă” (100). La pacienţii traumatizaţi, nivelul sanghin al mediatorilor proinflamatori ca TNF-alfa, IL-1beta şi IL-12 poate fi nedetectabil sau neschimbat, în timp ce concentraţia de IL-4, IL-6, IL-10, prostaglandina E2 este crescută. Imunosupresia indusă de traumă poate perturba funcţia limfocitară şi inhiba reacţia întârziată de hipersensibilitate. Fiziopatologia manifestărilor sistemice la marii arşi Evoluţia clinică la marii arşi se caracterizează secvenţial prin SIRS, sepsis, şocul septic, MODS, manifestări care depind de stadiul în care se intervine terapeutic. Manifestările sistemice generate de leziunea de arsură apar atunci când arsura acoperă peste 25% din suprafaţa corporală în cazul unui adult sănătos, dar sunt frecvente şi în suprafeţe mai mici (10-15%) în cazul copiilor, al bătrânilor şi adulţilor taraţi sau cu leziuni inhalatorii. Din punct de vedere fiziopatologic, manifestările sistemice generate de leziunea de arsură parcurg două etape esenţiale, parţial suprapuse peste cele clinice:
Mecanismul de apărare al organismului agresat acţionează iniţial prin intermediul imunităţii naturale şi anume prin recunoaşterea receptorilor (TLR-tool-like receptors) care interacţionează cu moleculele prezente în microorganisme. Citokinele proinflamatorii reglează adeziunea moleculară între neutrofile şi celulele endoteliale . Subgrupele celulelor T sunt modificate în sepsis: celulele Th (CD4+) pot fi împărţite în celule Th1 sau Th2. Celulele Th1 secretă în special citokine proinflamatorii, iar Th2 citokine antiinflamatorii (178).
Termenul de citokine sau imunocite a fost folosit iniţial pentru separarea unui grup de proteine imunomodulatoare, denumite de asemenea imunotransmiţători, de un alt grup de factori de creştere, sau factori peptidici regulatori care modulează proliferarea şi bioactivitatea celulelor non-imune. Conceptul iniţial ”o celulă producătoare - o citokină -o celula ţintă” a fost invalidat de studierea mai atentă a fiecarei citokine în parte. Citokinele acţionează pe un spectru foarte larg asupra celulelor, mai larg decât hormonii. Poate cea mai importantă caracteristică a citokinelor care le deosebeşte de hormoni, este că acestea nu sunt produse de celule specializate organizate în ţesuturi glandulare. Faptul că citokinele sunt secretate ca şi proteinele, înseamnă că locul unde se formează nu prezice locul unde vor acţiona (36). Tipul, durata, şi de asemenea aria activităţilor celulare induse de o anumită citokină poate fi influenţată considerabil de microclimatul celulei, depinzând, de exemplu, de stadiul de maturare al celulei, de tipul de celule ce o înconjoară, de concentraţia de citokine, de combinaţia de celule prezentă în momentul respectiv şi chiar de secvenţa temporală a multiplelor citokine ce acţionează pe aceeaşi celulă (62). Citokinele sunt reglatori pozitivi sau negativi ai ciclului celular, ai diferenţierii, ai migrării, ai supravieţuirii celulare, ai apoptozei, ai transformării. Citokinele sunt nişte arme puternice cu două tăişuri care pot fi triggerul unei cascade de reacţii şi pot avea reacţii secundare dincolo de efectul terapeutic aşteptat. Receptorii citokinici Receptorii şi citokinele corespondente au fost subdivizate în câteva familii bazate pe structură şi activitate, citokinele acţionând asupra celulelor ţintă prin legarea lor de receptorii de membrană specifici.
IV. Imunomodularea adaptativă la marii arşi Sistemul imun al pielii Ţesutul limfoid asociat pielii cuprinde keratinocite, celule Langerhans epidermale, celule T, celule endoteliale ale vaselor cutanate şi ganglioni limfatici regionali (14). Acest complex poartă denumirea de sistem imun al pielii (SIS-skin imun system). In urma unei arsuri, reacţia care apare este caracterizată de hipermetabolism şi catabolism, care compromit sistemul imun şi duce la apariţia MODS. Mediatorii fazei acute sunt citokinele proinflamatorii, ca IL-1, IL-6, IL-8, TNF, sau a citokinelor antiinflamatorii ca IL-10, creşterea sintezei citokinelor pro-inflamtorii contribuind la instalarea hipermetabolismului şi a catabolismului (75). Limfocitele T există în număr mare la nivel tegumentar, aproximativ 90% din aceste celule găsindu-se la nivelul unităţii perivasculare dermice. Majoritatea sunt reprezentate de fenotipul celulelor T de memorie (CD45RO), cealaltă izoformă (CD45RA) fiind reprezentată de fenotipul celulelor T naive. Sepsisul şi insuficienţa multiorganică reprezintă cea mai importantă cauză de deces în terapia intensivă a arsului. Pacienţii cu sepsis prezintă o masivă apoptoză în organele limfoide. Limfocitele T dispar rapid după injuria termică, o creştere a acestora fiind observată abia după 48 de ore. Această lezare severă a limfocitelor este considerată a fi strâns legată de imunosupresia severă care apare după injuria termică. Limfocitele T de la nivelul pielii, datorită localizării superficiale şi stimulării antigenice permanente, determină un răspuns imun caracteristic (184). Injuria termică este frecvent asociată cu o supresie a imunităţii şi o pierdere a subpopulaţiilor limfocitare sanghine şi de la nivelul organelor limfoide. Limfocitele T reprezintă principalele celule ale sistemului imunitar.
După instalarea SIRS, răspunsul imun scade în mod drastic. În primul stadiu al SIRS, citokinele proinflamatorii (IL-1, TNF-alfa) sunt produse ca răspuns la injurie. Dacă injuria originală este severă, mediatorii proinflamatori apar în circulaţia sistemică, astfel că citokinele antiinflamatorii pot interveni rapid pentru a regla inflamaţia iniţială. Dacă mecanismele de reglare ale răspunsului inflamator nu sunt funcţionale, o reacţie masivă inflamatorie poate determina o multiplă insuficienţă organică. Imunopatogenia răspunsului imun la marii arşi Citokinele în răspunsul imun postarsură Prezenţa citokinelor produse de monocite, macrofage, neutrofile, implică o amplificare importantă a răspunsului imun la infecţie şi determină o implicare directă în patogenia sepsisului postarsură. TNF-α şi IL-1 sunt produse precoce în raport cu activarea celulară şi reprezintă un stimul potent de activare a altor celule la nivel local sau la distanţă. Cascada citokinică. Cascada citokinică este alcătuită din 4 trepte:
Celulele responsabile de realizarea treptei I sunt macrofagele, iar citokinele implicate la acest nivel sunt IL-1 şi TNF-.
Celulele responsabile sunt limfocitele CD4 Th1, iar citokinele principale implicate sunt reprezentate de IL-2 şi IFN , şi în mai mică măsură de IL-12.
Treapta a III-a se realizează de către limfocitele CD4 Th2, prin citokinele aferente: IL-4, IL-10, IL-13.
Această treaptă se realizează, prin inhibinele complexului citokinic TGF-, care are o componentă inhibitoare asupra celulelor limfoide CD4 Th1, CD8 şi B, precum şi asupra celulelor NK. Celulele B sunt activate de celulele Th2 la nivel ganglionar. Citokinele reprezintă o componentă a sistemului imun. Citokinele proinflamatorii sunt produse în mare parte de monocite şi macrofage, TNF-α şi IL-1ß sunt reglatori precoce ai răspunsului imun şi ambii determină eliberarea secundară a altor citokine, Il-6, IL-8. IL-10 este o citokină antiinflamatoare care reduce sinteza mediatorilor proinflamatori. Evaluarea precoce a pacienţilor cu traume majore şi prognosticul precoce al acestora este dificil de efectuat, tocmai din cauza multiplelor variabile existente . Arsurile severe determină un răspuns imun adaptativ prin producerea de citokine eliberate sub influenţa celulelor Th 2. În cele mai multe cazuri, creşterea răspunsului de tip Th2 nu apare imediat după producerea injuriei termice, ci s-a remarcat că răspunsul Th2 este precedat de un răspuns tip Th 1. Celulele Th1 joacă un rol major în iniţierea răspunsului celular imun, iar celulele Th2 determină producerea de anticorpi şi joacă un rol în producerea de citokine. De altfel, răspunsul celulelor Th2 a fost legat de supresia imunităţii celulare. Imunosupresia şi dezvoltarea ulterioară a sepsisului sunt recunoscute ca o complicaţie majoră a injuriei termice (21). V. Evoluţie, prognostic Prognostic vital Ambele tipuri de citokine, pro şi antiinflamatoare, apar în circulaţia sistemică în caz de şoc septic, MODS şi imunosupresie, contribuind la creşterea mortalităţii. Alterarea precoce a nivelului seric al IL-6 şi IL-10 poate constitui un marker predictiv pentru identificarea pacienţilor cu risc crescut de mortalitate după trauma arsurii. Aceste citokine, alături de TNF pot fi utilizate ca factori predictivi ai mortalităţii, dar numai în interiorul a 24 ore, aceşti parametri nu pot fi consideraţi predictivi, dacă decesul survine mai târziu, după 6-15 zile. Aceste date demonstrează că răspunsul inflamator iniţial se corelează direct cu mortalitatea precoce şi nu cu cea tardivă.
Vindecarea plăgilor este un proces dinamic, interactiv care implică mediatori solubili, celule sanghine, matrix extracelular şi celule parenchimale. Procesul de vindecare al plăgilor are trei faze: inflamaţia, formarea ţesutului şi remodelarea tisulară. Procesul de cicatrizare ajunge la numai 20% în momentul închiderii plăgii, în primele 3 săptămâni, după care începe procesul de cicatrizare şi asuplizare a plăgii. Niciodată cicatricea nu va avea aceeaşi supleţe ca pielea intactă, maximul care se poate atinge este de 70% din supleţea pielii intacte (14). Epidermul are capacitatea de cicatrizare graţie celulelor suşe. Celulele suse cutanate reprezintă aproximativ 10% din keratinocitele stratului bazal epidermic. Aceste keratinocite din jurul ţesutului lezat, migrează şi proliferează la nivelul marginilor epidermice şi dermice pe care le acoperă în întregime cu un strat monocelular. Rezultatele cercetărilor în domeniul vindecării plăgilor de arsură rămân limitate, datorită unei înţelegeri încă incomplete a mecanismelor fundamentale celulare ale procesului de cicatrizare. PARTEA SPECIALĂ. I.Scopul si obiectivele studiului Pornind de la dorinţa şi necesitatea de a identifica o posibilă rezolvare a problemelor ridicate de aspectul complex al modificărilor sistemice care intervin la pacienţii cu arsuri severe, s-a născut ideea realizării lucrării de faţă, cu titlul “Dinamica şi semnificaţia citokinelor în cele 3 faze ale evoluţiei marilor arşi”. Complexitatea şi importanţa deosebită a problematicii analizate m-au dirijat în intenţia de a realiza un studiu de profunzime în această direcţie, deoarece combaterea complicaţiilor determinate de arsură reprezintă un deziderat major.
In acest sens, mi-am propus să studiez în dinamică nivelul seric al unor citokine proinflamatorii (IL-1, IL-6, TNF-α) şi antiinflamatorii (IL-10), în funcţie de o serie de parametri clinici (suprafaţa corporală arsă, gradul arsurii, vârstă, sex, comorbidităţi, indice prognostic, etc.). Luând în considerare interacţiunile şi legătura strânsă care există între factorul local şi cel sistemic, mi-am propus să realizez un studiu imunohistochimic al leziunii locale de arsură, corelat cu reacţia sistemică care, în ultimă instanţă pleaca tot de la nivel local. Citokinele, ca polipeptide de semnalizare intercelulară produse de către celulele activate pe parcursul inflamaţiei şi care participă la producerea acesteia, sunt cel mai important stimulator al reacţiei sistemice, astfel că prin evaluarea lor în dinamică mi-am propus să monitorizez curba de evoluţie a citokinelor la cazurile cu arsuri severe, în vederea depistării momentului care anunţă decompensarea, în acest scop propunându-mi şi stabilirea unui cut-off specific pentru fiecare citokină studiată. Obiectivele propuse a fi atinse sunt următoarele
II.Material si metoda Studiul prospectiv efectuat a cuprins un lot de 92 pacienţi cu arsuri severe în perioada ianuarie 2005 – martie 2009. Studiul s-a desfăşurat în serviciul ATI şi Clinica de Chirurgie Plastică şi Recuperatorie din cadrul Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă din Craiova în perioada ianuarie 2005 – decembrie 2008, analizând 92 pacienţi cu arsuri severe (35-67% suprafaţă corporală) internaţi în aceste servicii, care au reprezentat 14,30 % din numărul total al pacienţilor arşi internati si care au prezentat arsuri < 35% sau peste 67 % suprafaţa corporala. Pacienţii au fost selecţionaţi dintr-un număr de 643.pacienţi adulti arşi admişi în cadrul Departamentului de Arşi din Clinica de Terapie Intensivă şi Clinica de Chirurgie Plastică şi Recuperatorie a Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă Craiova, în această perioadă. Au fost selecţionaţi pacienţii care prezentau arsuri severe întinse pe 35-67% suprafaţă corporală, cazurile sub 35% suprafaţă corporală şi peste 70% suprafaţă corporală fiind excluse, deoarece am considerat că la un procent de arsură sub 35% riscul vital este mai mic şi recuperarea este satisfacătoare, iar la un procent de arsură peste 70%, riscul vital este foarte mare, iar evoluţia locală şi sistemică este grevată de multiple complicaţii S-a stabilit iniţial protocolul de investigare şi setul de parametri cuantificabili şi a unor parametri specifici de urmărire a cazurilor. S-a avut în vedere evaluarea clinică, evaluarea de laborator şi managementul fiecărui caz. S-a avut în vedere evaluarea clinică cu întocmirea unei fişe specifice a arsului, cu evaluarea suprafeţei arse. În vederea stabilirii corecte a severităţii evoluţiei arşilor şi a evaluării obiective a prognosticului, am utilizat scoruri prognostice bazate pe date clinice şi paraclinice obiective, cât mai rapid şi uşor de obţinut. In acest sens am utilizat scoruri de prognostic ca indicele prognostic (IP),scorul Baux, scor ABSI (Abbreviated Burn Severity Index) -Tobiasen, scorul Blot, scor MODS (Multiple Organ Disfunction Scores), scorul Apache II (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II), MPM (Mortality Probability Model). Loturile de pacienţi incluse în studiu au fost structurate în funcţie de suprafaţa corporală arsă,gradul arsurii, ţinând cont de patologia asociată. Am exclus din studiu pacienţii care au prezentat la admisie comorbidităţi , realizând astfel un lot omogen de studiu. Facem precizarea că o serie dintre aceste scoruri sunt utilizate în terapie intensivă, pentru calcularea unui scor prognostic al mortalităţii, la toţi pacienţii, nu numai la pacienţii arşi. Am folosit şi aceste scoruri de prognostic, deoarece evoluţia generală din primele ore a arsului în Terapia Intensivă este similară cu cea a pacienţilor cu traume de altă natură, încercând în acest fel să cuantificăm patologia sistemică indusă de arsură. Pentru realizarea studiului imunologic s-a recoltat sânge periferic, care a fost prelucrat în vederea utilizării probei pentru evaluarea prin metoda ELISA, probele fiind recoltate în momentul admisiei în Departamentul de Arşi, apoi recoltarea a fost efectuată în zilele 3, 5, 7, 14 iar la unele cazuri recoltarea s-a efectuat şi în ziua a 21-a, la pacienţii care au supravieţuit până în această zi. La cazurile soldate cu deces, recoltarea nu a putut urma aceeaşi procedură de evaluare în dinamică, dar a fost sugestivă pentru evoluţia cazurilor. Pentru studiul imunohistochimic, materialul cercetat a fost reprezentat de fragmente de tegument (ce conţineau atât zonă de ţesut sănătos cît şi zonă lezională) recoltate de la un număr de 92 pacienţi care au prezentat arsuri de gradul IIa,IIb,IIb/III şi gradul III în zile diferite de la producerea arsurii, probele tisulare fiind recoltate în zilele 1, 5, 7 şi 14 din momentul producerii injuriei termice. Pentru prelucrarea statistică a datelor s-au folosit pachetele software EPI2000, distribuit de OMS, SPSS, specializat în calcule statistice ştiinţifice, produs de firma SPSS şi modulul Data Analysis al programului MICROSOFT EXCEL, impreuna cu suita XLSTAT pentru MS Excel.
Yüklə 118,66 Kb. Dostları ilə paylaş:
|