Xashimova iqbolxonning

8.Floresan immunoassay.
Immunofloresan usuli (RIF, immunofloresan reaktsiyasi, Koons reaktsiyasi) - ftorxrom bilan konjugatsiyalangan antikorlar yordamida o'ziga xos antijenlarni aniqlash usuli . U yuqori sezuvchanlik va o'ziga xoslikka ega.
U yuqumli kasalliklarning ekspress diagnostikasi (sinov materialida patogenni aniqlash), shuningdek, antikorlar va sirt retseptorlari va leykotsitlar markerlarini ( immunofenotiplash ) va boshqa hujayralarni aniqlash uchun ishlatiladi.
Diagnostika amaliyotida lyuminestsent antikorlar (zardob) yordamida yuqumli materiallarda, hayvonlar to'qimalarida va hujayra madaniyatida bakterial va virusli antigenlarni aniqlash keng qo'llaniladi. Floresan zardoblarini tayyorlash ma'lum ftoroxromlarning (masalan, izotiosiyanat ) qobiliyatiga asoslanadi. fluorescein ) zardob oqsillari bilan ularning immunologik o'ziga xosligini buzmasdan kimyoviy bog'lanish.
Usulning uch turi mavjud: to'g'ridan-to'g'ri, bilvosita, to'ldiruvchi. To'g'ridan-to'g'ri RIF usuli ftorxromlar bilan etiketlangan antikorlar bilan immun zardoblari bilan davolash qilingan to'qimalar antijenlari yoki mikroblar floresan mikroskopning UV nurlarida porlash qobiliyatiga asoslangan. Bunday lyuminestsent sarum bilan ishlov berilgan smeardagi bakteriyalar hujayra atrofi bo'ylab yashil chegara shaklida porlaydi.
Bilvosita RIF usuli ftorxrom bilan etiketlangan antiglobulin (antikor) sarum yordamida antigen-antikor kompleksini aniqlashdan iborat . Buning uchun mikroblarning suspenziyasidan olingan smearlar antimikrobiyal quyon diagnostik sarumning antikorlari bilan davolanadi. Keyin mikrob antigenlari bilan bog'lanmagan antikorlar yuviladi va mikroblarda qolgan antikorlar smearni ftorxromlar bilan etiketlangan antiglobulin ( quyonga qarshi ) sarum bilan davolash orqali aniqlanadi . Natijada murakkab mikrob + antimikrobiyal quyon antikorlari + ftorxrom bilan belgilangan quyonga qarshi antitelalar hosil bo'ladi . Bu kompleks to'g'ridan-to'g'ri usulda bo'lgani kabi floresan mikroskopda kuzatiladi.
Mexanizm. Shisha slaydda sinov materialidan smear tayyorlanadi, olovga o'rnatiladi va patogen antigenlarga qarshi antikorlarni o'z ichiga olgan immun quyon zardobi bilan ishlanadi. Antigen-antikor kompleksini hosil qilish uchun preparat nam kameraga joylashtiriladi va 37 ° C da 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi, so'ngra antijen bilan bog'lanmagan antikorlarni olib tashlash uchun izotonik natriy xlorid eritmasi bilan yaxshilab yuviladi. Keyin preparatga quyon globulinlariga qarshi floresan antiglobulin zardobi qo'llaniladi, 37 ° C da 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi, so'ngra preparat izotonik natriy xlorid eritmasi bilan yaxshilab yuviladi. Floresan antiglobulin zardobining antigenga mahkamlangan o'ziga xos antikorlar bilan bog'lanishi natijasida nurli antigen-antikor komplekslari hosil bo'ladi, ular floresan mikroskopda aniqlanadi.
 Asosiy maqsadlar floresan immunoassay .
Asosiy vazifalardan biri immunoassay - an'anaviy heterojen ( ajratish operatsiyalari bilan) bilan ijobiy taqqoslanadigan oddiy bir hil ( ajratishsiz ) usullarni ishlab chiqish . Ikkinchisi erkin antijenlarni bog'langan antikorlardan ajratish operatsiyasini o'z ichiga oladi, bu operatsiya tahlil davomiyligini oshiradi va xatolar manbai bo'lishi mumkin. Yangi immunoassay usullarining yana bir maqsadi tizimning muvozanatini tezlashtirishdir , bu tahlil qilish uchun zarur bo'lgan vaqtni qisqartiradi .
Immunologiyaning jadal rivojlanishi bu, Bazel immunologiya institutida to'plangan eksperimental tajriba taqdimotini o'z ichiga olgan " Immunologik usullar " seriyasining uchinchi kitobida aks ettirilgan . U ikkitadan immunologiyada rekombinant DNKdan foydalanishga oid besh bobni o'z ichiga oladi boblarda oqsillarni ajratish uchun yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasidan foydalanish tasvirlangan Alohida boblar quyidagi masalalarni ko'rib chiqadi: limfotsitlarning membrana antijenlarini aniqlash uchun monoklonal antikorlardan foydalanish , gistologik moslashuv antijenlarini tiplash , ikki o'lchovli elektroforez yordamida oqsillarni tahlil qilishning yangi usullari , B-hujayralarning o'sishini qo'llab-quvvatlovchi limfokinlar . To'rt bobda klonlangan B- va T -hujayra liniyalari va gibridomalarni yaratish va boshqarish tasvirlangan va yana to'rtta revmatoid omil ishlab chiqaruvchi hujayralarni aniqlashning yangi usullarini muhokama qiladi . Ikki bob lyuminestsent hujayralarni saralash va suyultirishni cheklash tahlili kabi umumiy immunologik usullarga bag'ishlangan va nihoyat, oxirgi to'rt bobda maxsus immunologik savollarni o'rganish uchun hayvonlarning
ayrim turlari (qushlar, qo'ylar va amfibiyalar) bilan ishlashda qo'llaniladigan murakkab usullar ko'rib chiqiladi. Xuddi shu hujayralar yordamida madaniyatni bitta hujayra klonlash yoki tahlil qilish bilan boshlash mumkin cheklovchi seyreltme usuli bilan . Ba'zi hollarda B-hujayra prekursorlarining populyatsiyasi B-220, AA4.1 yoki GF1.2 antijenlariga monoklonal antikorlar yordamida ijobiy tanlov yordamida sof shaklda boyitiladi yoki hatto izolyatsiya qilinadi. Bunday holda, stakanlarga adsorbsiya qilish ( penning ), rozet hosil qilish yoki lyuminestsent hujayra saralash usullari qo'llaniladi . Yagona hujayralar mikromanipulyatsiya orqali mikromassivlarning dumaloq tubi quduqlariga joylashtirilishi va 200 µl WEHI-K yoki tozalangan IL-3 ishtirokida yetishtirilishi mumkin. Bunday holda, muhit har 3 srda o'zgartiriladi va Limbro panellari quduqlarida va to'qima kulturalarida musbat kulturalar ko'paytiriladi .
Sitometriyadagi eng qiyin muammolardan biri o'ziga xos bo'lmagan binoni bilan bog'liq . Haddan tashqari sezgir hujayra saralovchi floresan molekulalarni aniqlaydi - odatda ko'zdan kattaroq. Shuning uchun, saralovchi bilan ishlashda ishlatiladigan reagentlar bo'lishi kerak yuqoriroq boshqa tahlil usullariga qaraganda tozalash darajasi . Umumiy qoida sifatida, heterolog sarumlar to'g'ridan - to'g'ri flüoresan mikroskopiyada foydalanish uchun etarlicha o'ziga xos bo'lsa ham, afinitetli sorbentlarda tozalanishi kerak . Monoklonal antikorlar har doim tozalashni talab qilmaydi . Biz zardob bilan to'ldirilgan va sarum bo'lmagan muhitda, shuningdek, astsit suyuqliklarida (albatta, tegishli suyultirishda) yetishtirilgan ko'plab mAb ishlab chiqaruvchi gibridomalarning supernatantlaridan muvaffaqiyatli foydalandik. Bilvosita usullar bo'lsa floresan bo'yash , madaniyat suyuqliklarida ifloslantiruvchi molekulalarning ta'siri minimallashtiriladi. Agar ftorxrom -konjugatsiyalangan antikorlar immunoglobulinlar uchun qat'iy xos bo'lsa, immunoglobulin bo'lmagan molekulalar hujayralar bilan bog'langan bo'lsa ham , bu molekulalar aniqlanmaydi (flüoresans bilan). Ascitik suyuqliklardan foydalanish holatida monoklonal antikorlarning faolligi odatda shunchalik yuqoriki, ifloslantiruvchi immunoglobulinlar va boshqa komponentlarning ta'siri ko'pincha aniqlanmaydi. Biroq, to'g'ridan-to'g'ri konjugatsiya bilan ftorxromli antikorlarning preparatlari, ularda immunoglobulin bo'lmagan tabiatdagi oqsil aralashmalarining mavjudligi yuqori darajadagi noaniq bo'yashga olib kelishi mumkin . Shuning uchun hujayralarni saralashda ishlatiladigan har qanday konjugat ehtiyotkorlik bilan tozalanishi kerak. Savdoda mavjud bo'lgan
tahliliy tizimlarga talablar doimiy ravishda oshib bormoqda. Albatta, lyuminestsent Elishay usullari ularni qondirishi mumkin. Yangi usullar tez, ko'p qirrali va arzon narxlarda sodda bo'lishi kerak . Avtomatlashtirish ushbu maqsadlarga erishishga yordam beradi. O'rganish uchun ariza turli fermentlar va floroforlar , avtomatlashtirish vositalari va tahlil sxemalari . Ushbu bobda tasvirlangan usul bu yo'nalishdagi qadamdir. Biz tomonidan ishlab chiqilgan raqobatbardosh usul etiketli antikorlardan va yangi bo'yoq-ferment juftligini qo'llash bilan bog'liq. Tahlil vaqti - 60 soniya, bitta aniqlash uchun reaktivlarning narxi sakkiz tsentdan kam. Tahlil bitta nuqta o'lchoviga asoslangan va oqim - in'ektsiya tizimi tomonidan avtomatik ravishda amalga oshiriladi .
Demak, belgilangan antikor kontsentratsiyasida muvozanat nisbati bog'langan va erkin antigen kontsentratsiyasi miqdoriy jihatdan umumiy kontsentratsiyaga bog'liq ligand . Bu nisbat har qanday immunoassay asosida yotadi . Shunday qilib , agar tahlil qilingan tizimga belgilangan antigen miqdori kiritilgan bo'lsa, antigenning noma'lum konsentratsiyasini ham aniqlash mumkin. Noma'lum antikor konsentratsiyasi etiketli antikorlar yordamida aniqlanadi . Radionuklidlar, fermentlar, qizil qon tanachalari , lyuminestsent va xemiluminesans zondlar yoki metallar kabi antikor yoki antigenni belgilash uchun turli xil etiketkalash vositalaridan foydalanish mumkin. Radioimmunoassay (RIA) va ferment immunoassay ( ELISA) da antigen, immunoradiometrik ( IRMA) va immunofermentativ (IFMA) tahlilida esa antikor etiketlanadi. Ko'pgina immunoassay texnikasi bog'langan va erkin etiketli antijen yoki antikorlarni alohida aniqlashni talab qiladi. Shuning uchun bu usullar ancha og'ir va uzoqdir.
Ko'rib chiqilayotgan ATR tizimlari to'g'ri burchak ostida lyuminestsent signalni aniqlashga asoslangan . Bundan tashqari, aks ettirilgan nurning yo'li bo'ylab aniqlashdan foydalanishingiz mumkin . Ushbu rejimda signalni aniqlash uchun ishlarda ham kvarts plitalari , ham kvarts optik tolalari ishlatilgan. reaktsiyani aniqlash chegarasi FIT antikorlari bilan o'n daqiqalik inkubatsiyadan so'ng IgG tekis va tolali to'lqin o'tkazgichlar uchun mos ravishda 3,0 va 1,5 mkg/ml ga etadi.