Xashimova iqbolxonning

immunoassay (qisqartirilgan ELISA , ingliz fermenti bilan bog'liq immunosorbent tahlili , Elishay ) - bu o'ziga xos antigen-antikor reaktsiyasiga asoslangan turli xil birikmalar, makromolekulalar, viruslar va boshqalarni sifat yoki miqdoriy aniqlash uchun laboratoriya immunologik usuli. Shakllangan kompleksni aniqlash signalni ro'yxatga olish uchun yorliq sifatida ferment yordamida amalga oshiriladi.

Elishayning mohiyati va tasnifi

O'rganish ob'ektlarining xilma-xilligi - past molekulyar og'irlikdagi birikmalardan tortib viruslar va bakteriyalargacha va Elishayni o'tkazish uchun sharoitlarning xilma-xilligi tufayli ushbu usulning ko'plab variantlari mavjud.
Tahlilning birinchi bosqichida (analitning bog'lanishi sodir bo'ladi) immunokimyoviy o'zaro ta'sir turiga ko'ra tasniflash mumkin. Agar tizimda faqat tahlil qilingan birikma va unga mos keladigan bog'lanish markazlari (antigen va o'ziga xos antikorlar) mavjud bo'lsa, u holda usul raqobatdosh emas . Agar birinchi bosqichda tizim bir vaqtning o'zida tahlil qilinadigan birikmani va uning analogini (ferment bilan belgilangan analit yoki qattiq fazada immolizatsiya qilingan tahliliy modda) o'z ichiga olsa, cheklangan miqdordagi maxsus bog'lanish joylari uchun raqobatlashsa, u holda usul raqobatbardosh hisoblanadi .
bo'lmagan Elishay formatiga misol " sendvich " usulidir . Tahlil qilingan antigenni o'z ichiga olgan eritma immobilizatsiyalangan antikorlar bilan tashuvchiga qo'shiladi. Birinchi bosqichda inkubatsiya jarayonida qattiq fazada antigen-antikor kompleksi hosil bo'ladi. Keyin tashuvchisi bog'lanmagan komponentlardan yuviladi va ferment bilan belgilangan maxsus antikorlar qo'shiladi. Ikkilamchi inkubatsiyadan va antikor-ferment konjugatining ortiqcha miqdorini olib tashlaganidan so'ng , tashuvchining fermentativ faolligi aniqlanadi, bu test antijenining dastlabki kontsentratsiyasiga mutanosibdir . Muayyan immunokompleksni aniqlash bosqichida antijen, xuddi immobilizatsiyalangan va etiketli antikorlar molekulalari orasiga joylashtirilgan , bu " sendvich" usuli nomining keng qo'llanilishiga sabab bo'lgan . Fermentativ reaksiya (rangli reaksiya) vodorod peroksid va rangsiz birikma bilan ifodalangan substrat ishtirokida sodir boʻladi, u peroksidaza reaktsiyasi jarayonida tadqiqotning yakuniy bosqichida rangli reaksiya mahsulotiga oksidlanadi. Bo'yashning intensivligi aniqlangan o'ziga xos antikorlar miqdoriga bog'liq. Natija spektrofotometrik yoki vizual tarzda baholanadi .
" Sendvich " - usuli faqat kamida ikkita antijenik determinant yuzasida mavjud bo'lgan antijenlarni tahlil qilish uchun ishlatilishi mumkin . Turli infektsiyalar uchun immunoassay fermenti uchun ko'plab test tizimlari ushbu formatga asoslanadi: OIV infektsiyasi, virusli gepatit, sitomegalovirus , herpes , toksoplazma va boshqa infektsiyalar.
Qattiq fazali Elishayning raqobatbardosh sxemalari orasida ikkita asosiy format mavjud:

1. 
   To'g'ridan-to'g'ri raqobatbardosh Elishay formati qattiq fazada immobilizatsiyalangan o'ziga xos antikorlardan foydalanadi va ferment bilan belgilangan va etiketlanmagan antigen immobilizatsiyalangan antikor bilan bog'lanish uchun raqobatlashadi.
   Immobilizatsiyalangan antikorlarga analit va belgilangan antigenning belgilangan konsentratsiyasini o'z ichiga olgan eritma qo'shiladi, inkubatsiya qilinadi va tashuvchini bog'lanmagan komponentlardan yuvgandan so'ng, qattiq fazada hosil bo'lgan o'ziga xos immun komplekslarning fermentativ faolligi qayd etiladi. Aniqlangan signalning kattaligi antigen konsentratsiyasiga teskari bog'liqdir.
   To'g'ridan-to'g'ri sxemaning afzalligi - kam sonli bosqichlar, bu tahlilni avtomatlashtirishni osonlashtiradi. Sxemaning kamchiliklari orasida ferment konjugatlarini sintez qilish usullarining murakkabligi , shuningdek namuna komponentlarining ferment faolligiga mumkin bo'lgan ta'siri kiradi.
   
2. 
   Bilvosita raqobatbardosh Elishay formatida ferment bilan belgilangan antikorlar (o'ziga xos yoki ikkilamchi) va qattiq fazada immobilizatsiyalangan antigen-oqsil tashuvchi
   konjugat qo'llaniladi. Belgilangan turlarga qarshi antikorlardan foydalangan holda bilvosita sxema Elishayning eng keng tarqalgan sxemalaridan biridir. Tashuvchi yuzasida antigen-oqsil konjugati immobilizatsiya qilinadi , unga aniqlanishi kerak bo'lgan antijeni va belgilangan konsentratsiyasi belgilanmagan o'ziga xos antikorlarni o'z ichiga olgan eritma qo'shiladi, inkubatsiya qilinadi va bog'lanmagan komponentlar olib tashlangandan so'ng belgilangan konsentratsiyali etiketli turlarga qarshi antikorlar qo'shiladi. Inkubatsiya va tashuvchini yuvishdan so'ng, qattiq fazada hosil bo'lgan o'ziga xos immun komplekslarning fermentativ faolligi aniqlanadi va signal qiymati aniqlanayotgan antigen konsentratsiyasiga
   teskari proportsionaldir . Umumjahon reagentdan foydalanish - anti- turga qarshi antikorlar - turli antijenlarga antikorlarni aniqlash imkonini beradi. Bundan tashqari, tahlil qilingan namuna va etiketli reagent tizimga turli bosqichlarda kiritiladi, bu esa namunadagi turli effektorlarning ferment yorlig'ining katalitik xususiyatlariga ta'sirini yo'q qiladi. Biroq, bunday tahlil sxemasi qo'shimcha bosqichlarni joriy etish tufayli uni amalga oshirishni murakkablashtiradi.
   

Har qanday immunokimyoviy tahlil usullari singari, Elishay ham noto'g'ri ijobiy va noto'g'ri salbiy natijalar berishi mumkin. Masalan, turli infektsiyalarga qarshi antikorlarni aniqlashda noto'g'ri ijobiy natijalar romatoid omil tufayli yuzaga kelishi mumkin , bu insonning o'z immunoglobulinlari G ga qarshi immunoglobulin M; turli tizimli kasalliklar, metabolik kasalliklar yoki dori-darmonlarni qabul qilishda hosil bo'lgan antikorlar tufayli; yangi tug'ilgan chaqaloqlarda bunday noto'g'ri ijobiy reaktsiyalar bolaning tanasida onaning immunoglobulini G ga M-antikorlarning shakllanishi tufayli yuzaga kelishi mumkin. Bundan tashqari, poliklonal faollashuv sindromi noto'g'ri ijobiy natijalarning sababi bo'lishi mumkin . Shu bilan birga , maxsus moddalar - superantigenlar - B-limfotsitlar tomonidan turli infektsiyalarga antikorlar ishlab chiqarishni rag'batlantirmaydi. Amalda, bu bir vaqtning o'zida ko'plab patogenlarga antikor titrining o'ziga xos bo'lmagan ortishi bilan ifodalanadi. ^{[ 1]} Antikorlarni aniqlashda noto'g'ri-salbiy natijalar immunitet tanqisligi holatlari, shuningdek, reaktsiyani shakllantirishdagi texnik xatolar bilan bog'liq bo'lishi mumkin.
Shunday qilib, ferment immunoassayning shubhasiz afzalliklari tufayli: foydalanish qulayligi, tezligi, qayd natijalarini avtomatlashtirish hisobiga ob'ektivlik, turli sinflarning immunoglobulinlarini o'rganish imkoniyati (bu kasalliklarni erta tashxislash va ularning prognozi uchun muhim), bu Hozirgi vaqtda laboratoriya diagnostikasining asosiy usullaridan biri.
Ferment immunoassay paytidagi xatolar
Ferment immunoassay (ELISA) natijasida yuzaga keladigan muammolarni 3 guruhga bo'lish mumkin: 1) pasport ma'lumotlariga signal va fon nuqtai nazaridan nomuvofiqlik; 2) kalibrlash egri chizig'idagi nuqsonlar, shu jumladan nazorat sarumining e'lon qilingan diapazonga tushmasligi; 3) tahlil natijasining klinik ko'rinishga mos kelmasligi, ya'ni butun plastinkada yoki alohida namunalarda tahlil qiluvchi moddaning o'lchangan va kutilayotgan kontsentratsiyasi o'rtasidagi sezilarli farqni aniqlash . Ro'yxatda keltirilgan muammolar ham Elishay jarayonida xatolik, ham ishlab chiqarish nuqsoni natijasi bo'lishi mumkin. Qoida tariqasida, nikohni aniqlash faqat ishlab chiqaruvchi tomonidan qaytariladigan mahsulotlarni o'rganishda mumkin. Nikohning mavjudligini tasdiqlash oqibati sifatsiz mahsulotlarni ishlab chiqaruvchi tomonidan almashtirishdir. Biroq, ob'ektning OPF bilan bog'langanda, klinik laboratoriya sotib olingan mahsulot to'g'ri qo'llanilishiga ishonch hosil qilishi kerak.
Ushbu maqola ikkita maqsadni ko'zlaydi, bir tomondan, noto'g'ri natijalarga olib keladigan harakatlarni tahlil qilish, boshqa tomondan, nazoratsiz xatolar yuzaga kelishiga yordam beradigan vaziyatni tekshirish va bartaraf etish yo'llarini taklif qilish. Noto'g'ri natijaga olib keladigan noto'g'ri harakatlar tahlilning har qanday bosqichida - tahlildan oldingi, analitik yoki keyingi tahliliy bosqichda amalga oshirilishi mumkin . Ushbu maqola asosan IFAning o'zini amalga oshirish bilan bog'liq. Noto'g'ri tahlil natijalariga olib kelishi mumkin bo'lgan tahlildan oldingi va keyingi bosqichlarda klinik laboratoriyaning ayrim harakatlari ham ko'rib chiqiladi .
Preanalitik bosqich
Tahlil natijasi va klinik ko'rinish o'rtasidagi nomuvofiqlikning sabablaridan biri Elishay uchun bemorlardan qon namunalarini olish usuli hisoblanadi. Laboratoriya tadqiqotlari uchun qon zardobini olish uchun rasmiy hujjatlar bilan tartibga solingan qon namunalarini olish va qayta ishlash usulining yo'qligi klinik muassasalarga keng diapazondagi bir martalik qon namunalarini olishning turli tizimlaridan foydalanish imkonini beradi.
Tashqi soddaligiga qaramay, bu tizimlar juda murakkab tuzilishga ega: maxsus kimyoviy reagentlar qo'shilishi bilan pıhtı shakllanishi tezlashadi, eritrotsitlar gemolizini bostirish va hujayralarning tizim devorlariga yopishishini oldini olish uchun boshqa tabiatdagi kimyoviy vositalar qo'llaniladi; qonning suyuq va qattiq fazalarini yaxshiroq ajratish uchun inert jismoniy vositalar qo'llaniladi. Ushbu qo'shimchalarning barchasi immunoassayga sezilarli aralashish ta'siriga ega bo'lishi mumkin . Ushbu tizimlarni ishlab chiqaruvchilarning faoliyatini tartibga soluvchi mavjud hujjatlar ikkinchisini aralashuvning sabablari va mexanizmlarini o'rganishga majburlamaydi. Shunday qilib, laboratoriya amaliyotida u yoki bu bir martalik tizimdan foydalanishni boshlagan iste'molchi mahsulotning natijaga ta'siri haqida ma'lumotga ega emas. Shu bilan birga, adabiyotlar tahlili shuni ko'rsatadiki, bir xil namuna olish tizimi bir tahlil qiluvchining o'lchangan kontsentratsiyasini oshirib yuborishi va boshqasining o'lchangan kontsentratsiyasini kam baholay oladi. Interferentsiya kattaligiga qo'shimcha ta'sir namuna va tizim o'rtasidagi aloqa davomiyligi, atrof-muhit harorati, namunani aralashtirish darajasi va tashish fakti bilan ta'sir qilishi mumkin (Vlasov va boshq., 2006). Ushbu vaziyatni bartaraf etishning mumkin bo'lgan usuli tanlangan bir martalik qon yig'ish tizimidan foydalangan holda qiyosiy tajribalar o'tkazish bo'ladi. Bunday tajribalarda nazorat qilish uchun avval ma'lum bir laboratoriyada qabul qilingan sarumlarni olish usuli olinadi. Tajriba davomida har bir tahlil qiluvchi modda uchun bir martalik tizim tomonidan kiritilgan tizimli xatoning kattaligi va belgisi aniqlanadi . Tadqiqot natijasi har bir analit uchun normal qiymatlarning laboratoriya ichidagi diapazonlarini takomillashtirishdir . Turli xil katalog raqamlariga ega bir xil ishlab chiqaruvchining mahsulotlari turli xil kimyoviy va fizik vositalarni o'z ichiga olishi mumkin, shuning uchun bir martalik qon to'plash tizimidan foydalangan holda qiyosiy tajribalar ma'lumotlarini boshqa tizimga o'tkazib bo'lmaydi.
Laboratoriya diagnostikasi uchun qon namunalarini olishni tartibga soluvchi hujjatlarning yo'qligi Elishay to'plamlari iste'molchilarining kutilmagan, ammo qonuniy savollariga olib kelishi mumkin. Ushbu da'volardan birining mohiyati ko'rsatmalarda kapillyar qondan olingan sarumdagi tahlil qiluvchi moddalarning normal qiymatlari diapazonlarining yo'qligi hisoblanadi. Venoz va kapillyar qon gaz va biokimyoviy tarkibida farq qiladi, bu Elishayning nazoratsiz aralashuviga olib kelishi mumkin. Barmoqdan qon olayotganda, uni interstitsial suyuqlik bilan suyultirmasdan, etarli hajmdagi namunani olish qiyin. To'qimalarning suyuqligi test tizimining tarkibiy qismlari uchun begona matritsadir. Shunday qilib, natijani to'g'ri talqin qilish ehtimoli juda shubhali.
Tahlil natijasi va klinik ko'rinish o'rtasidagi nomuvofiqlik oddiy qoidalarga rioya qilmaslik natijasi bo'lishi mumkin. Agar namunalar ilgari muzlatilgan bo'lsa, muzlatish paytida yuzaga keladigan kontsentratsiya gradientini yo'q qilish uchun ularni aralashtirish kerak. Mexanik aralashmalar mavjud bo'lganda, pipetka uchiga tushmaslik va natijada inkubatsiya muhitiga kiritilgan namuna hajmini o'zgartirish uchun namunani santrifüj qilish kerak . Shu bilan birga, uzoq vaqt davomida yuqori tezlikda santrifüjlash va santrifüjga yo'l qo'ymaslik kerak.
immunoassayda nazoratsiz aralashuvga yo'l qo'ymaslik uchun bakteriostatiklar bilan stabilize qilinmasligi kerak .
Analitik bosqich
Analitik bosqich uchun binolar, asboblar va idishlarga qo'yiladigan umumiy talablar muhim ahamiyatga ega.
Xonalar doimiy harorat va namlikni saqlab turishi kerak. Juda quruq havo muqarrar ravishda quduqlardan notekis bug'lanish tufayli plastinkada chekka ta'sirga olib keladi. Haroratning oshishi immunoassayda amalga oshirilgan barcha reaktsiyalar tezligining oshishiga olib keladi (antigen va antikorlarning cho'kishi, xromogen fermentativ konversiyasi). Ushbu qoida qo'lda to'plamlar uchun ko'rsatmalarda ko'rsatilgan xona harorati oralig'i uchun ham amal qiladi - 18-25ºS. Harorat rejimiga rioya qilmaslik spektrofotometrga adekvat bo'lmagan signalga va hatto antikor va antigen reaktsiyasining kinetik va muvozanat parametrlarining o'zgarishiga olib kelishi mumkin. Muammoni hal qilishning eng yaxshi usuli xonani konditsioner qilishdir. Muqobil variant - xona haroratini talab qiladigan Elishay inkubatsiyalarini haroratni boshqariladigan shakerda o'tkazish.
Yarim avtomatik pipetkalar, spektrofotometrlar, avtomatik analizatorlarning dozalash va o'lchash qismlari davriy tekshiruvdan o'tkaziladi. Tekshiruvdan o'tmagan asboblar noto'g'ri natijalar manbai bo'lishi mumkin. Bularga rondelalar va termostatik boshqariladigan shakerlar (silkichlar ) kiradi . Yuvish moslamalari dozalashning to'g'riligini va quduqlardan suyuqlikni olib tashlashning to'liqligini vizual nazorat qilishni talab qiladi, ortiqcha o'sishni oldini olish choralarini talab qiladi . Ushbu oddiy qoidalarga rioya qilmaslik tahlilda yuqori fonga va dublikatlar o'rtasidagi yuqori o'zgarish koeffitsientiga, past tahliliy darajali kalibrlash namunalarining " noto'g'ri kelmasligiga " va analit konsentratsiyasi past bo'lgan sarumlarning noto'g'ri aniqlanishiga olib keladi .
Shakerlar butun tahlilda (butun plastinkada) natijalarni ortiqcha baholash yoki kam baholash manbai bo'lishi mumkin. Ma'lumki, turli ishlab chiqaruvchilarning bir xil chayqash tezligiga o'rnatilgan shakerlar haqiqiy tezlikda sezilarli farqlarni ko'rsatadi. Xuddi shu ishlab chiqaruvchidan bir xil markadagi shakerlarni sotib olayotganda ham xuddi shunday muammoga duch kelishi mumkin. Ikki xil shakerda bir xil tahlillarni o'tkazish orqali operator bir xil bemor namunasida o'lchangan analit konsentratsiyasidagi sezilarli farqni aniqlay oladi. Ushbu natijaning sababi ko'pincha namunalarning "ochilish" darajasining inkubatsiya paytida plastinkani silkitish tezligiga bog'liqligi. Xuddi shu nomdagi laboratoriya asbob-uskunalarining turli birliklaridan foydalanganda turli xil tahlil natijalarini olishning oldini olish uchun taxometr yordamida shakerlarni haqiqiy tezlikda tekislash, har bir qurilmaning tezligini aniqlash va laboratoriya ichidagi normal diapazonlarni tuzatish tavsiya etiladi. har bir analit uchun qiymatlar .
Elishay jarayonida laboratoriya shisha idishlaridan qayta foydalanilganda, plastinkada yuqori fon aniqlanishi mumkin, past tahliliy darajali kalibratorlarning " ajralmasligi " , alohida namunalardagi analit konsentratsiyasi noto'g'ri aniqlanishi mumkin . Buning sababi ko'pincha Elishayning oldingi sinovlaridan olingan plastmassa va shisha idishlarda oqsil komponentlari yoki xromogenning cho'kishi yoki yuvish vositalarining to'liq yuvilmaganligi . Bir martali ishlatiladigan sarf materiallaridan foydalanish yuqorida tavsiflangan muammolarni bartaraf etishning eng oson yo'li.
deionizatsiyalangan suv sifati uchun maxsus talablarga ega bo'lishi kerak . Konsentrlanganlarni suyultirish va to'plamning liyofillangan tarkibiy qismlarini qayta qurishda yangi tayyorlangan suvdan foydalanish to'g'riroq bo'ladi, chunki suv turganda pH o'zgaradi, idish shishasi oqadi va o'sish paydo bo'ladi . Kerakli suv sifati uni ishlab chiqarish uchun qurilmalarga talablarni qo'yadi - vaqti-vaqti bilan metall qismlarning korroziyasi yo'qligiga ishonch hosil qilish va plastik shlanglarda ortiqcha o'sishni oldini olish kerak.