Xashimova iqbolxonning

4.Ferment immunoassay yordamida kichik molekulyar moddani aniqlash.
Tibbiyot amaliyotida immunoassay usullari keng qo'llanila boshlandi. Zamonaviy tibbiyotning barcha sohalarida immunoassay asosan diagnostika va tahliliy maqsadlarda qo'llaniladi. Ayniqsa, ular past va juda past konsentratsiyalarda biologik komponentlarni (gormonlar, fermentlar, neyropeptidlar, immun tizimi mahsulotlari, antijenler va boshqalar) aniqlash imkonini berishi juda muhimdir. Antikorlarni olish mumkin bo'lgan barcha mahsulotlar ushbu usullar bilan aniqlanadi.
Immunitetni tahlil qilish antigen (AG) va antikor (AT) ning komponentlardan biri (ferment, radionuklid, lyuminestsent bo'yoq va boshqalar) uchun turli xil yorliqlash variantlari yordamida o'zaro ta'siriga asoslangan. Reaksiyani baholash avtomatik ravishda maxsus jihozlarda amalga oshiriladi, bu esa ushbu usullarni standartlashtirishga imkon beradi.
Amaldagi yorliq turiga va testni o'rnatish shartlariga qarab, immunoassay ferment immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), immunofluoressensiya va boshqalar deb ataladi. Reaksiyalar bir yoki bir necha bosqichda amalga oshirilsa, ular bevosita yoki bilvosita deb belgilanadi. Reaksiya olib boriladigan muhit muhim ahamiyatga ega. Agar reaktsiya sirtga o'rnatilgan reagentlar bilan amalga oshirilsa, u holda sinov Elishay (ferment bilan bog'liq immunosorbent tahlili) kabi qattiq fazali test sifatida belgilanadi.
Ushbu maqolada faqat ferment immunoassay ko'rib chiqiladi - biologiya va tibbiyotda keng qo'llaniladigan, amaliy va fundamental usul.


Bog'langan immunosorbent tahlili.
Elishay 60-yillarning o'rtalarida paydo bo'lgan va dastlab gistologik preparatdagi antigenni aniqlash, shuningdek, immunodiffuzion test va immunoelektroforezda cho'kma chiziqlarini vizualizatsiya qilish uchun usul sifatida ishlab chiqilgan va keyin antigenlarni miqdoriy aniqlash uchun ishlatila boshlangan va biologik suyuqliklardagi antikorlar. Usulni ishlab chiqishda E. Engvall va R. Pelman, shuningdek, ulardan mustaqil ravishda V. Van Veeman va R. Shurs ishtirok etdi.

Shakl 1. Elishayning asosiy printsipi.
1) Antigenlarni aniqlash uchun. 2) Antikorlarni aniqlash.
Usul antikorning antijen bilan o'ziga xos bog'lanishiga asoslanadi, komponentlardan biri ferment bilan konjugatsiyalanadi; mos keladigan xromogen substrat bilan reaktsiya natijasida rangli mahsulot hosil bo'ladi, uning miqdori bo'lishi mumkin. spektrofotometrik tarzda aniqlanadi (1-rasm).
Har xil tashuvchilarda antigen va antitellarni immobilizatsiya qilish, ularning bog'lanish faolligini saqlab qolish imkoniyatining ochilishi biologiya va tibbiyotning turli sohalarida Elishay dan foydalanishni kengaytirish imkonini berdi.
Monoklonal antikorlarning paydo bo'lishi Elishayning keyingi rivojlanishi bo'lib xizmat qildi, bu uning sezgirligini, o'ziga xosligini va natijalarning takrorlanishini oshirishga imkon berdi.
Nazariy jihatdan, Elishay zamonaviy immunokimyo va kimyoviy enzimologiya ma'lumotlariga, antigen-antikor reaktsiyasining fizik-kimyoviy qonuniyatlarini bilishga, shuningdek, analitik kimyoning asosiy tamoyillariga asoslanadi. Elishayning sezgirligi va uning davomiyligi bir necha asosiy omillar bilan belgilanadi: antigen-antikor reaktsiyasining kinetik va termodinamik xususiyatlari, reagentlar nisbati, ferment faolligi va uni aniqlash usullarining o'lchamlari. Umuman olganda, antigen-antikor reaktsiyasini oddiy sxema bilan tavsiflash mumkin:
[AT]+[AG]↔[ATAG]
Past molekulyar og'irlikdagi birikmalardan tortib viruslar va bakteriyalargacha bo'lgan o'rganish ob'ektlarining xilma-xilligi, shuningdek, Elishay dan foydalanish shartlarining xilma-xilligi bilan bog'liq bo'lgan g'ayrioddiy keng ko'lamli vazifalar ushbu usulning juda ko'p sonli variantlarini ishlab chiqishni aniqlaydi. .
Elishayning har qanday varianti 3 ta majburiy bosqichni o'z ichiga oladi:
1. immun kompleks hosil bo'lishiga olib keladigan, sinov birikmasini unga xos bo'lgan antikor tomonidan tan olinishi bosqichi;
2. konjugatning immun kompleks yoki erkin bog'lanish joylari bilan bog'lanishining shakllanish bosqichi;
3. ferment belgisini ro'yxatga olingan signalga aylantirish bosqichi.
Elishay tasnifi.
Elishay usullarini tasniflash bir nechta yondashuvlarga asoslanadi:
1. Elishayning birinchi bosqichida mavjud bo'lgan reaktivlar turiga ko'ra, raqobatbardosh va raqobatdosh bo'lmagan usullar farqlanadi.
A) Raqobatbardosh Elishay usulida, birinchi bosqichda tizim tahlil qilingan birikmani ham, uning analogini ham o'z ichiga oladi, ferment bilan belgilangan va u bilan muayyan bog'lanish joylari uchun raqobatlashadi.
B) Raqobatsiz usullar uchun tizimda birinchi bosqichda faqat tahlil qilinadigan birikma va unga xos bog`lanish markazlarining bo`lishi xarakterlidir.
2. Barcha Elishay usullari bir hil va heterojen bo'linadi.
Agar Elishayning barcha uch bosqichi eritmada o'tkazilsa va asosiy bosqichlar o'rtasida hosil bo'lgan immun komplekslarni reaksiyaga kirishmagan komponentlardan ajratishning qo'shimcha bosqichlari bo'lmasa, usul bir hil bo'lganlar guruhiga kiradi.
Odatda past molekulyar og'irlikdagi moddalarni aniqlash uchun ishlatiladigan bir hil Elishayning asosi antijen yoki antikor bilan birlashganda ferment faolligini inhibe qilishdir. Antigen-antikor reaksiyasi natijasida ferment faolligi tiklanadi.
Antikor ferment yorlig'ini o'z ichiga olgan antigen bilan bog'langanda, ferment faolligi yuqori molekulyar og'irlikdagi substratga nisbatan 95% ga inhibe qilinadi, bu substratning fermentning faol markazidan sterik ravishda ajralib chiqishi bilan bog'liq. Antigen konsentratsiyasi ortishi bilan ko'proq antikorlar bog'lanadi va yuqori molekulyar og'irlikdagi substratni gidrolizlashi mumkin bo'lgan ko'proq erkin antigen-ferment konjugatlari saqlanadi. Tahlil juda tez amalga oshiriladi, bitta aniqlash uchun 1 daqiqa kerak bo'ladi. Usulning sezgirligi ancha yuqori. Uning yordamida siz pikomollar darajasidagi moddani aniqlashingiz mumkin.
Geterogen usullar uchun ikki fazali tizimda qattiq faza - tashuvchi va immun komplekslarni turli fazalarda (hosil bo'lgan) reaksiyaga kirmagan komponentlardan (yuvish) ajratishning majburiy bosqichi ishtirokida tahlil qilish odatiy holdir. immun komplekslar qattiq fazada, reaksiyaga kirishmagan komplekslar esa eritmada). Birinchi bosqichda immun komplekslarning shakllanishi qattiq fazada davom etadigan geterogen usullar qattiq fazali usullar deb ataladi.
Usullar bir jinsli-geterojen deb tasniflanadi, agar 1-bosqich - eritmada o'ziga xos komplekslarning hosil bo'lishi sodir bo'lsa, so'ngra komponentlarni ajratish uchun immobilizatsiyalangan reaktivli qattiq faza qo'llaniladi.
3. Tekshiriluvchi moddani aniqlash printsipiga ko'ra:
A) Moddaning (antigen yoki antikor) kontsentratsiyasini u bilan o'zaro ta'sir qiluvchi bog'lanish markazlari soni bo'yicha bevosita aniqlash. Bunday holda, ferment yorlig'i hosil bo'lgan o'ziga xos AG-AT kompleksida bo'ladi. Analitning konsentratsiyasi ro'yxatga olingan signalga to'g'ridan-to'g'ri proportsional bo'ladi.
B) Moddaning kontsentratsiyasini bog'lanish joylarining umumiy soni va qolgan erkin bog'lanish joylari orasidagi farq bilan aniqlash. Bunday holda, tahlil qiluvchi moddaning konsentratsiyasi oshadi va qayd etilgan signal kamayadi, shuning uchun bu holda qayd etilgan signalning kattaligiga teskari bog'liqlik mavjud.
Elishayda ishlatiladigan komponentlarning xususiyatlari.
Fermentlar.
Ferment belgilari juda kuchli katalitik ta'sirga ega; bitta ferment molekulasi ko'p miqdordagi substrat molekulalari bilan reaksiyaga kirishishi mumkin. Shunday qilib, ahamiyatsiz miqdorda mavjud bo'lgan ferment mahsulotlarning hosil bo'lishi, u katalizlaydigan reaktsiya bilan aniqlanishi va miqdorini aniqlashi mumkin. Fermentlarni yorliq sifatida ishlatishning yana bir afzalligi molekulada ko'p sonli funktsional guruhlar (sulfgidril, karboksil, tirazin qoldiqlari va boshqalar) mavjudligi bilan bog'liq bo'lib, ular orqali ligand molekulalari kovalent biriktirilishi mumkin.
ELISA da qo'llaniladigan fermentativ markerlar quyidagi xususiyatlarga ega bo'lishi kerak:
– taxlil sharoitida, modifikatsiya vaqtida va antikorlar yoki boshqa oqsillar bilan konjugatsiyada fermentning yuqori faolligi va barqarorligi;
– sezgir substratlarning mavjudligi va fermentativ reaksiya mahsuloti yoki substratlarini aniqlash usulining soddaligi;
- taglik tizimlarini yanada mustahkamlashga moslashtirish imkoniyati;
- o'rganilayotgan biologik suyuqlikda ferment va uning ingibitorlarining yo'qligi.
Elishay kamida 15 xil fermentlardan foydalanishi mumkin. Yuqoridagi talablarga muvofiq eng katta dastur xren peroksidaza (HRP), gidroksidi fosfataza (AP) va b-D-galaktozidaza (1-jadval) topildi. Uchalasi ham barqaror va juda sezgir reaksiyalarni katalizlaydi. Bundan tashqari, ushbu fermentlar tomonidan katalizlangan reaktsiyalar natijasida hosil bo'lgan mahsulotlar, ishlatiladigan substratga qarab, nafaqat kolorimetrik usullar, balki floresan usullar bilan ham aniqlanishi mumkin. Boshqa fermentlar kamroq qo'llaniladi. Bu ularning HRP va AP bilan solishtirganda past o'ziga xos faolligi bilan izohlanadi.
Substratlar.
Substratni tanlash, birinchi navbatda, yorliq sifatida ishlatiladigan ferment tomonidan belgilanadi, chunki ferment-substrat reaktsiyasi juda o'ziga xosdir.
Immunitet reaktsiyalarining klassik va muqobil o'ziga xosligi.I mmunitet - bu organizmni bakteriyalar, viruslar, zamburug'lar, protozoa va boshqa zararli agentlar - patogenlar deb ataladigan bosqindan himoya qilish uchun mo'ljallangan reaktsiyalar tizimi. Agar tanamizni mamlakat deb tasavvur qilsak, immunitet tizimini uning qurolli kuchlari bilan solishtirish mumkin. Patogenlarning aralashuviga qanchalik muvofiqlashtirilgan va adekvat javob bersa, tananing mudofaasi shunchalik ishonchli bo'ladi (shuningdek qarang: adaptiv immunitet , tug'ma immunitet , gumoral immunitet ( antikor ishlab chiqarish ), hujayra immuniteti ).
Turli patogenlarga qarshi kurashish uchun uzoq davom etgan evolyutsiya natijasida immun hujayralarining murakkab tizimi shakllangan bo'lib, ularning har biri o'z kurash strategiyasiga ega. Immunitet tizimining hujayralari bir-birini to'ldiradi: ular patogenni yo'q qilishning turli usullaridan foydalanadilar, ular boshqa hujayralarning ta'sirini kuchaytirishi yoki zaiflashtirishi mumkin, shuningdek, agar ular o'zlari bardosh bera olmasalar, jang maydoniga tobora ko'proq jangchilarni jalb qilishlari mumkin. Vujudga hujum qilib, patogenlar immun hujayralari tomonidan "to'plangan" molekulyar "dalillar" qoldiradilar. Bunday dalillar antijenler deb ataladi .
Antijenler - bu tanani begona deb qabul qiladigan va shunga mos ravishda immunitet tizimini faollashtirish orqali ularning tashqi ko'rinishiga javob beradigan har qanday moddalar. Immun tizimi uchun eng muhim antijenler patogenning tashqi yuzasida joylashgan molekulalarning bo'laklaridir. Ushbu qismlardan siz tanaga qaysi tajovuzkor hujum qilganini aniqlashingiz va unga qarshi kurashni ta'minlashingiz mumkin.

SİTOKINLAR

Immunitet hujayralari dushmanga qarshi kurashda o'z harakatlarini muvofiqlashtirish uchun ularga kim va qachon jangga qo'shilish yoki jangni tugatish yoki aksincha, uni davom ettirish va yana ko'p narsalarni aytib beradigan signallar tizimi kerak. Ushbu maqsadlar uchun hujayralar kichik protein molekulalarini ishlab chiqaradi - sitokinlar , masalan, turli interleykinlar (IL-1, ... yoki IL-1, 2, 3 va boshqalar) [1]. Ko'pgina sitokinlarga aniq funktsiyani belgilash qiyin, ammo ma'lum darajada an'anaviylik bilan ularni besh guruhga bo'lish mumkin: kimyokinlar, o'sish omillari, yallig'lanishga qarshi, yallig'lanishga qarshi va immunoregulyatsion sitokinlar.

•