Transformarea genetică de la genele marker la gene de interes economic

Yüklə 89,38 Kb.

tarix	26.10.2017
ölçüsü	89,38 Kb.
	#13727

Progrese recente in cercetarile de transformare genetica a plantelor
LENUŢA RAKOSY-TICAN
Universitatea “Babeş-Bolyai”, Facultatea de Biologie şi Geologie, Colectivul de Inginerie Genetică Vegetală, Cluj-Napoca

Introducere

Transformarea genetică a plantelor a cunoscut un progres spectaculos, de la obţinerea primelor gene himere, în anii şaptezeci ai secolului trecut, la regenerarea primelor plante transformate genetic purtând gene străine (Gasser şi Fraley, 1989). In ultimul deceniu, s-a ajuns la eliberarea în câmp şi cultivarea pe scară largă a plantelor transgenice, de la 1,7 ha în anul 1996 la 39,9 milioane ha în anul 1999 (http://www.agbioview.org). Metodele utilizate pentru transferul eficace al alogenelor în organisme vegetale receptoare au cunoscut, de asemenea, un progres nu mai puţin spectaculos, de la metode simple până la adevărate metode „războinice“, de împuşcare directă a ADN în ţesuturile ţintă. Odată cu dezvoltarea metodologiei de izolare şi clonare a genelor, respectiv a metodelor de transfer în celulele vegetale, un număr tot mai mare de plante au fost supuse transgenozei, incluzând grupele cu o mare importanţă economică: cerealele, leguminoasele, solanaceele, speciile pomicole sau forestiere. În literatura de specialitate, s-au publicat o serie de sinteze sau chiar cărţi referitoare la transformarea genetică a plantelor (Davey şi colab., 1989; Potrykus, 1991; Songstad şi colab., 1995; Potrykus şi Spangenberg, 1995). De aceea, în această lucrare ne-am propus o prezentare sintetică a metodelor utilizate actualmente pentru transformarea celulei vegetale, relevarea importanţei genelor marker şi raportoare, respectiv a progresului înregistrat în introgresia în genomul vegetal a unor gene cu importanţă economică, insistând asupra datelor recente, spectaculoase, raportate în literatura acestui efervescent domeniu al geneticii actuale.

Metode de transformare a celulei vegetale

Sunt relativ puţine lucrări care abordează, în mod critic, problema metodelor utilizate pentru transformarea genetică a plantelor (Potrykus, 1991), respectiv a mecanismelor biologice care permit transferul şi integrarea unui fragment de ADN străin într-o celulă vegetală ţintă. In numeroase laboratoare s-a reuşit transformarea genetică a diferitelor specii de plante, fie ele plante model cum ar fi tutunul (Nicotiana tabacum) sau petunia (Petunia hybrida), sau dimpotrivă plante considerate recalcitrante dar de un mare interes economic, cum ar fi soia sau unele cereale. Pentru o anumită specie de plante poate fi aplicată eficient o metodă de transformare genetică, sau mai multe.

Pentru o specie cum ar fi Arabidopsis thaliana, specie model pentru cercetările de genetică moleculară, al cărui genom a fost deja cartat în întregime, se pot aplica cu succes, în funcţie de scopul urmărit, mai multe metode de transformare genetică: transformarea seminţelor, a explantelor radiculare sau chiar a inflorescenţelor in planta, cu ajutorul vectorului Agrobacterium tumefaciens, transformarea directă a protoplastelor, metoda biolistică sau microinjectarea. Din păcate, însă, nu se pot aplica cu aceeaşi eficienţă diferite metode la specii considerate recalcitrante, iar celulele ţintă pentru transformare nu sunt întotdeauna cele care posedă totipotenţialitate şi deci pot regenera plante întregi. Mai mult, eficienţa transformării este dependentă nu numai de specie, dar chiar şi de genotip. De aceea, găsirea unei metode general aplicabile care să permită transformarea eficientă şi de rutină a tuturor genotipurilor şi speciilor de plante dorite de experimentatori, rămâne un obiectiv al cercetării din acest domeniu. Metodele de transformare pot fi clasificate în metode indirecte, bazate pe utilizarea unor vectori de ADN, şi metode directe (figurile 1 şi 2).

Fig. 1. Principalele metode utilizate pentru transformarea celulelor vegetale

METODE INDIRECTE – TRANSFORMAREA MEDIATA

Transformarea mediată de bacterii:

Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium rhizogenes

2. Transformarea mediată de virusuri

METODE DIRECTE

Transformarea protoplastelor
Metoda “biolistics” – împuşcarea directă a ADN în celule
Electroporarea
Electroforeza
Utilizarea fibrelor de carbură de siliciu

Metode indirecte de transformare a plantelor

Transformarea mediată de Agrobacterium

Bacteriile din sol, Agrobacterium tumefaciens şi Agrobacterium rhizogenes realizeză ceea ce adeseori s-a numit “inginerie genetică naturală”. Aceaste bacterii sunt capabile să transfere în ţesutul vegetal lezat, un fragment de ADN propriu, ADN-T, de pe plasmida Ti (“tumor inducing”) – în cazul speciei A. tumefaciens – sau Ri (“root inducing”) – în cazul speciei A. rhizogenes, care se integrează în genomul plantei. Ca urmare bacteria A. tumefaciens induce formarea de tumori la nivelul coletului (“crown gall disease”) iar A. rhizogenes formarea de rădăcini firoase (“hairy roots”). In decursul coevoluţiei plantă – microorganism aceste bacterii au devenit capabile să transforme plantele pentru a le exploata mai bine ca şi surse de energie. ADN –T se transmite prin seminţe după legile Mendeliene, ca genă dominantă. Există date care confirmă faptul că o astfel de transformare genetică are loc în natură fără intervenţia omului. Astfel, s-a demonstrat că plasmida Ri poate purta una sau două copii de ADN-T, iar o parte din una dintre aceste secvenţe a fost regăsită în genomul unor plante nemodificate genetic (Potrykus şi Spangenberg, 1995). Celulele vegetale care poartă ADN-T devin celule tumorale, deoarece acest fragment de ADN conţine gene cu efect oncogen. Deleţia acestor gene din ADN-T nu interferă, din fericire, cu transferul şi integrarea ADN-T în genomul celulei vegetale receptoare. Doar capetele ADN-T, aşa numitele latură dreaptă şi stângă constănd din o secvenţă alcătuită din 24 de nucleotide care se repetă, reprezintă situri de recunoaştere pentru sistemul de transfer. Prin înlocuirea oncogenelor din ADN-T cu gene de interes este posibil transferul acestora în celule vegetale ţintă, celule care nu mai dobândesc caracter tumoral şi deci pot regenera plante transformate genetic. Genele de interes – fie ele gene marker sau raportoare sau gene cu importanţă economică – pot fi introduse în plante fie prin lincaj cu regiunea ADN-T dezarmată prin recombinare, obţinându-se un aşa numit vector de integrare, fie prin clonarea lor între secvenţele repetate laterale într-un replicon independent, ceea ce se numeşte vector binar. Existenţa mai multor regiuni T în celula de Agrobacterium conduce la cotransferul acestora în celula vegetală ţintă cu eficienţă crescută. Pe de altă parte pentru integrarea ADN-T în celula vegetală se pot utiliza secvenţe omoloage ADN vegetal ţintă care induc, cu frecvenţă relativ scăzută, recombinarea omolagă între ADN-T şi ADN vegetal.

Agrobacterium tumefaciens poate transfera ADN-T diferitelor specii de plante chiar dacă unele dintre acestea nu formeză tumori (de la Riva şi colab., 1998). Deşi spectrul de gazde pentru această bacteriei este limitat la plantele dicotiledonate s-au obţinut tulpini supervirulente, capabile să infecteze eficient şi celulele plantelor monocotiledonate (Potrykus şi Spangenberg, 1995). S-a deschis, astfel, calea transformării cerealelor şi prin intermediul acestui vector bacterian. Eficienţa transformării celulei vegetale de către A. tumefaciens, variază destul de mult în funcţie de specie, genotip sau chiar de ţesutul ţintă. Este foarte important, totodată, ca ţesutul supus transformării să fie totipotent şi deci să regenereze plante transformate genetic. De cele mai multe ori, însă, dintr-un ţesut doar un număr limitat de celule sunt totipotente şi nu întodeauna acestea sunt şi cele transformate de agrobacterium. Pentru diferite specii de plante s-au identificat metode potrivite pentru transformarea eficientă mediată de A. tumefaciens. Ca ţesuturi ţintă pot fi utilizate: discuri sau fragmente foliare, fragmente de rădăcini, hipocotile, peţiol, cotiledoane sau seminţe întregi. Primele plante transformate prin intermediul lui A. tumefaciens au fost regenerate în 1983 (Fraley şi colab.,1983), succesele iniţiale limitându-se la solanacee, în particular la sistemul model tutunul (Nicotiana tabacum L.). In anii optzeci şi nouăzeci ai secolului douăzeci, tot mai multe specii de plante au putut fi transformate prin intermediul vectorului A. tumefaciens, multe dintre ele specii cu o mare importanţă economică, cum ar fi: soia, bumbacul, orezul, ovăzul, sorgul, trestia de zahăr, grâul şi multe altele (Potrykus şi Spangenberg, 1995; Songstad şi colab., 1995; de la Riva şi colab., 1998). Eficienţa transformării variază foarte mult de la o specie la alta în funcţie de: identificarea metodei optime de cultură a ţesutului ţintă, condiţiile de cultură a materiallului sursă, sau suşa bacteriană utilizată. Aceşti factori afectează şi numărul de copii de ADN-T care se integrează în genomul vegetal receptor. Predominant s-a constatat, la diferite specii de plante, integrarea unei singure copii de ADN-T. Mai recent, cercetările au vizat descifrarea mecanismelor implicate în colonizarea ţesuturilor vegetale de către bacterii, relevându-se noi detalii privind controlul genetic al virulenţei bacteriene (de la Riva şi colab., 1998).

Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oară pentru transformarea plantelor de tutun în anul 1977 (Ackermann, 1977). Această bacterie transferând ADN-T de pe plamida Ri determină formarea rădăcinilor firoase pe diferite organe ale plantelor, rădăcini care pot purta gene de interes, dacă acestea au fost integrate în ADN-T, respectiv pot regenera plante transformate genetic. O etapă intermediară, în procesul de transformare mediată de A. rhizogenes, este cultura rădăcinilor firoase care au capacitatea de a se alungi şi ramifica. Astfel, prin cultura rădăcinilor firoase se pot obţine metaboliţi secundari sau pot fi realizate studii fundamentale privind creşterea şi dezvoltarea rădăcinilor. Acest sistem experimental este foarte potrivit şi pentru analize biochimice, rădăcinile prezentând căi biochimice mai simple şi, deci, mai uşor de analizat. Rădăcinile firoase pot fi cultivate uşor, folosind un echipament simplu şi ieftin iar, comparativ cu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt stabile din punct de vedere genetic. Asemănător sistemului A. tumefaciens, bacteria A. rhizogenes poate co-tranfera ADN-T de pe plasmida Ri şi un vector “binar”, de obicei o plasmidă mai mică. Aceasta din urmă poate purta în ADN-T o genă marker, de exemplu o genă care conferă rezistenţă la un antibiotic, o genă raportoare - sau marker pentru vizualizare fenotipică şi o genă cu importanţă economică. Avantajul acestui sistem este acela că cele două tipuri de ADN-T, cel care determină dezvoltarea rădăcinilor firoase, şi ADN-T de pe vectorul binar, se integrează de obicei pe cromozomi diferiţi în plantele transformate şi deci, vor segrega independent în descendenţă. Un avantaj aparte al sistemului de transformare Ri este faptul că toate celulele vegetale care integrează ADN-T de pe plasmida Ri pot fi uşor identificate şi selectate prin prezenţa fenotipului de rădăcină firoasă.

Sistemul de transformare mediată de A. rhizogenes a fost aplicat unui mare număr de specii de plante (în jur de 200 încă în 1989 – Tepfer 1989), dar asemănător sistemului A. tumefaciens răspunsul optim variază în funcţie de specie, genotip sau suşa bacteriană. Organele vegetale potrivite pentru transformarea cu A. rhizogenes sunt: fragmente de tulpină de la plante tinere, fragmente de peţiol, fragmente foliare, segmente de hipocotile sau cotiledoane, sau fragmente ale unor organe de rezervă cum ar fi rădăcinile de morcov sau tuberculii de cartof. Uneori astfel de explante prezintă un răspuns polar, formând rădăcini firoase numai la una din extremele explantului, rădăcini capabile să ignore forţa gravitaţională. Mai mult, există date experimentale care sugerează efectul de piticire a plantelor indus de una dintre genele de virulenţă, rolA, de la A. rhizogenes, efect cu importanţă practică mai ales pentru unele plante horticole (Curtis şi colab., 1996).

Figura 2. Reprezentarea etapelor de transformare şi regenerare a plantelor transgenice pentru două metode eficiente: stânga – transformarea mediată de Agrobacterium; dreapta – metoda de împuşcare directă a ADN.

Transformarea mediată de virusuri

Utilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, în ciuda numeroaselor eforturi experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase. Deşi, în 1984 a fost posibil transferul unei gene de rezistenţa la antibiotic cu ajutorul unui virus ADN (Brisson şi colab., 1984), cercetările ulterioare au demonstrat că genomul viral nu poate accepta şi transfera fragmente mai lungi de ADN străin. Descoperirea faptului că virusurile ARN pot genera ADNc prin transcripţie inversă a generat sperenţa că, mult mai numeroasele virusuri ARN ar putea fi utilizate ca vectori de gene pentru celula vegetală. Din păcate, însă, s-au întâmpinat alte dificultăţi. ADNc viral nu se integrează în genomul vegetal iar meristemele, principala sursă de celule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai rar utilizaţi în experimentele de transformare genetică a plantelor.

Metode directe de transformare a plantelor
Utilizarea protoplastelor pentru transferul direct de ADN

Protoplastele, celulele vegetale lipsite de perete celular, reprezintă limita de expresie a totipotenţialităţii. De la primele plante de tutun regenerate din protoplaste izolate (Takebe şi colab., 1971) până astăzi numărul plantelor pentru care regenerarea din protoplaste a devenit posibilă a crescut permanent, ajungând actualmente la aproximativ 400 de specii de plante. Dacă până în anul 1985 tehnologia protoplastelor se putea aplica cu succes mai ales Solanaceaelor şi Brassicaceaelor, o dată cu descoperirea totipotenţialităţii protoplastelor izolate din suspensii celulare embriogene de cereale s-au deschis noi oportunităţi de modificare genetică a acestui important grup de plante.

Protoplastele sunt sistemele celulare ideale pentru transferul de ADN şi selecţia transformanţilor. Indepărtarea peretelui celular elimină principala barieră în calea pătrunderii ADN străin în celula vegetală. Izolarea enzimatică a protoplastelor acţionează ca un factor de stress care induce reacţii de răspuns la rănire – reacţii presupuse a declanşa starea de competenţă atât de importantă pentru transformarea eficientă. Mai mult, suspensia de protoplaste se aseamănă cu o suspensie bacteriană avănd avantaje similare prin posibilitatea de a cultiva populaţii mari de celule individuale în medii de cultură bine definite. Tesuturile derivate din protoplaste au în general origine clonală provenind din celule individuale. Eficienţa selecţiei transformanţilor este, prin urmare, maximă în cazul protoplastelor deoarece se evită formarea de himere, destul de frecvente la nivelul sistemelor multicelulare. Pentru transferul ADN, de obicei plasmidial, în protoplastele izolate se pot utiliza diferite metode, şi anume:

Tratamente chimice cu agenţi permeabilizanţi (mai ales polietilenglicol – PEG): PEG şi alţi agenţi chimici pot permeabiliza membrana plasmatică permiţând intrarea unor macromolecule, ADN, în citoplasmă. Mecanismul intim al acestui proces nu este pe deplin înţeles. Primele date raportate în literatură se referă la transferul ADN-T, provenind de la Agrobacterium tumefaciens, în protoplaste de petunia în prezenţa PEG (Draper şi colab., 1982). Primele plante transgenice au fost obţinute la tutun prin această metodă de către Paszkowski şi colab. (1984). Transformarea protoplastelor prin permeabilizare cu PEG a fost realizată cu succes pentru multe specii de plante, atât dicotiledonate cât şi monocotiledonate, cheia succesului reprentând-o existenţa unui protocol eficint de regenerare a plantelor din protoplaste.

Electroporarea – implică permeabilizarea reversibilă a membranei plasmatice în prezenţa unor pulsuri de curent continuu având amplitudine crescută şi durată foarte scurtă, porii formaţi în membrană permiţând intrarea ADN străin în citoplasmă (vezi Rakosy-Tican şi colab., 2000). Electroporarea a devenit o metodă de rutină pentru transformarea protoplastelor vegetale, dar şi pentru celulele de mamifere sau bacteriene. La plante electroporarea protoplastelor se foloseşte eficient atât pentru analiza expresiei transiente a transgenelor cât şi pentru transformarea permenetă, pentru numeroase specii de plante incluzând cerealele. Mai mult, prin electroporarea protoplastelor se elimină necesitatea utilizării unor gene marker, ceea ce reprezintă un avantaj deosebit în condiţiile oponenţei acerbe a opiniei publice fată de eliberarea în câmp a unor plante purtând gene marker. Avantajele electroporării constau în eficienţa crescută a incorporării ADN străin, reproductibilitatea şi simplitatea acestei metode. Singura limitare a aplicării electroporării o reprezintă capacitatea de regenerare a protoplastelor, dar şi acest dezavantaj a fost depăşit prin extinderea aplicării electroporării celulelor sau chiar ţesuturilor întregi.

Sonicarea – permeabilizarea membranei protoplastelor în prezenţa ultrasunetelor s-a dovedit, de asemenea o metodă eficientă pentru transferul ADN în protoplaste vegetale. Ulterior metoda a fost aplicată şi celulelor sau ţesuturilor întregi, dar este utilizată pe scară mai redusă comparativ cu electroporarea (Zhang şi colab., 1991).

Microinjectarea – constă în introducerea cu ajutorul unei micropipete a ADN direct în protoplaste, acestea fiind fixate cu o altă micropipetă. Microinjectarea celulei vegetale întregi sau a ţesuturilor este, de asemenea posibilă, dar se realizează mai greu din punct de vedere tehnic. Un sistem eficient a fost utilizat mai recent (Kost şi colab., 1995) şi constă în imobilizarea protoplastelor recipiente de tutun într-un strat foarte subţire de mediu solidificat cu agaroză sau alginat. Protoplastele au fost imobilizate deasupra unei grile care a permis localizarea şi monitorizarea prin fotografiere a protoplastelor microinjectate, respectiv a celulelor sau calusurilor derivate din acestea.

Fuziunea cu lipozomi – fuziunea lipozomilor încărcaţi cu ADN cu membrana plasmatică a protoplastelor şi eliberarea ADN străin în citoplasmă a fost demonstrată în 1990 (Cacboche, 1990). Metoda nu prezintă avantaje deosebite comparativ cu alte metode de transfer direct, de aceea este mai puţin utilizată. S-a încercat, de asemenea, utilizarea lipozomilor pentru a transporta ADN în celule sau ţesuturi întregi, în ideea trecerii lipozomilor prin plasmodesme. S-a demonstrat însă că peretele celular este o barieră de netrecut pentru lipozomi iar plasmodesmele se închid ca răspuns la rănire. O idee interesantă a fost aceea a injectării lipozomilor în vacuola unor celule vacuolate. In acest caz s-a constatat fuziunea lipozomilor cu tonoplastul şi eleiberarea ADN în citoplasmă. Deşi elegantă această metodă are aplicaţii restrânse deoarece celulele vacuolate nu sunt totipotente (Potrykus, 1991).

Metoda “biolistics” – împuşcarea directă a ADN în celule

Metoda biolistică (“biolostics”) sau “particle gun”, de împuşcare directă a ADN în ţesuturi ţintă (Klein şi colab., 1987), este cea mai spectaculoasă metodă de transformare genetică a plantelor care a declanşat un val de entuziasm în rândul specialiştilor din acest domeniu. In dezvoltarea acestei tehnici s-a investit foarte mult efort şi bani dar şi rezultatele obţinute au fost pe măsura aşteptărilor. Metoda constă în accelerarea unor particule foarte mici (1μm diametru) din tungsten sau aur coloidal, pe care a fost precipitat ADN, în ţesuturi vegetale ţintă. Această tehnică are numeroase avantaje care o recomandă pentru aplicabilitate generală: este o metodă uşor de aplicat, printr-o împuşcătură pot fi ţintite mai multe celule, celulele supravieţuiesc după împuşcare, genele purtate de particule îşi păstrează activitatea biologică, particulele pot fi împuşcate în stratele superficiale sau în profunzimea unui organ vegetal, celulele ţintă pot fi foarte diferite: polen, celule în suspensie, embrioni imaturi, celule din ţesuturi diferenţiate sau chiar meristeme. Datorită avantajelor sale biolisticul a devenit metoda favorită în numeroase laboratoare, permiţând transformarea cu succes a unor plante pentru care alte metode nu au dat rezultate cum ar fi: soia, porumbul, ovăzul, orezul, sorgul, trestia de zahăr, grâul, plante forestiere etc. O aplicaţie aparte a fost utilizarea împuşcării de microproiectile pentru rănirea apexurilor la floarea soarelui, eficientizând astfel transformarea mediată de Agrobacterium tumefaciens (Bidney şi colab., 1992). Mai mult, s-a reuşit împuşcarea directă în ţesuturi vegetale a celulelor bacteriene întregi.

Electroforeza

Migrarea ADN printr-un ţesut vegetal ţintă a fost o altă idee interesantă pentru transferul de gene şi a fost aplicată pentru prima oară embrionilor intacţi de orz (Ahokas, 1989). In aceste experimente s-a demonstrat expresia tranzientă a alogenelor. Ulterior s-a imaginat un sistem simplu pentru realizarea electroforezei folosind embrioni zigotici (Songstad şi colab., 1995)(Fig. 3).

Figura 3. Reprezentarea metodei de electroforeză a ADN în ţesuturi vegetale ţintă (după Songstad şi colab., 1995).
Condiţiile optime pentru electroforeza embrionilor sunt considerate: un curent de 0,5 mA la 25V/embrion, timp de 15 min. In aceste condiţii în jur de 50% din embrioni rămân viabili. S-a reuşit, de asemenea, transformarea permanentă, folosind genele marker de rezistenţă la kanamicină şi GUS (β-glucuronidază), a embrionilor unei specii de orhidee (Griesbach şi Hammond, 1993). Aplicarea acestei tehnici prezintă interes deosebit pentru acele specii care nu au dat rezultate prin aplicarea unor metode ca biolisticul sau electroporarea.

Utilizarea fibrelor de carbură de siliciu („silicon carbide technology“)

Fibrele de carbură de siliciu se utilizează în industrie. Transformarea genetică prin această tehnologie este relativ simplă, constând în vortexarea (agitarea) ţesuturilor împreună cu ADN şi fibre de carbură de siliciu. Astfel, fibrele penetrează pereţii celulari permiţând ADN să pătrundă în citoplasmă. Metoda a fost aplicată iniţial transformării embrionilor de insecte, iar ulterior s-a dovedit eficientă şi în transformarea celulelor vegetale (Kaeppler şi colab., 1990). Cercetările de microscopie electronică au relevat penetrarea peretelui celular de către astfel de fibre, sugerând că ADN aderă de suprafaţa fibrelor şi este introdus odată cu acestea în celulă. Având proprietăţi fizice asemănătoare azbestului fibrele de carbură de siliciu sunt probabil carcinogene. Transformarea genetică tranzientă a fost raportată folosind această tehnologie pentru suspensii celulare de porumb, ovăz, tutun şi Agrostis alba. Transformarea stabilă a fost, de asemenea posibilă folosind suspensii celulare de porumb şi tutun. Datele obţinute au indicat transformarea preponderentă a aglomeratelor celulare neembriogene la porumb, de aceea se impun cercetări ulterioare pentru optimizarea acestei metode. Metoda prezintă avantajul de a fi foarte simplă şi ieftină, dar datorită riscurilor potenţiale pentru sănătatea umană se caută materiale alternative, eventual biodegradabile (Songstad şi colab., 1995).

Alte metode de transfer direct al ADN în celulele vegetale: există o serie de alte metode cu aplicabilitate restrânsă de transformare a celulei vegetale cum ar fi: îmbibarea ADN în ţesuturi utilizând seminţe uscate sau embrioni, transformarea polenului sau a tubului polinic, macroinjectarea ADN în ţesuturi sau utilizarea microlaserului pentru a perfora peretele celular şi plasmalema. Astfel de metode se află, actualmente, în diferite faze de experimentare. De un interes deosebit, se vor bucura metodele alternative care nu necesită faze de cultură in vitro. O astfel de metodă, cu potenţial deosebit este transformarea grăuncioarelor de polen, dar deocamdată rezultatele în acest domeniu sunt relativ modeste (Potrykus, 1991).
Genele marker şi genele raportoare – importanţa lor pentru cercetările de genetică vegetală
Alogenele sunt introduse experimental în plante cu scopul de a obţine proprietăţi noi sau a altera caracterele acestora. In cazul plantelor, din păcate, eficienţa transformării stabile este scăzută, doar o parte din celulele expuse ADN integrează genele străine, iar dintre aceste numai celulele totipotente regenerează clone transformate. De aceea, este nevoie de sisteme de selecţie foarte eficiente. In acest scop se folosesc gene marker sau chiar compuşi fitotoxici. Genele marker sunt acele gene care permit selecţia celulelor care le poartă, iar genele raportoare sunt gene care codifică proteine uşor de evidenţiat în celule sau extracte celulare (Fig. 4). Unele gene pot fi considerate atât gene marker cât şi raportoare. In general ca gene marker se utilizează gene care conferă rezistenţă la antibiotice sau erbicide (Tabelul 1), dar mai recent s-au dezvoltat şi metode de selecţie pozitivă utilizând gene bacteriene ce permit metabolizarea unui anumit substrat (manoză sau xiloză – Joersbo şi Okkels, 1996) (figura 4).

PROMOTER (35S)

GENA MARKER

TERMINATOR

(nos)

REZISTENTA LA ANTIBIOTICE

REZISTENTA LA ERBICIDE

GUS (GLUCURONIDAZA)

NPT II (NEOMICINFOSFOTRANSFERAZA II)

LUCIFERAZA

GFP= GREEN FLUORESCENT PROTEIN

SISTEM DE SELECTIE POZITIVA

(Genele: man A – pentru fosfomanozizomaraza; xylA – pentru xilozizomeraza)

Figura 4. Reprezentarea schematică a unei construcţii genetice de bază şi a principalelor gene marker sau raportoare utilizate în cercetările de inginerie genetică vegetală; sunt marcate (săgeată) acele gene care pot fi uşor vizualizate (gene raportoare).
Dintre genele marker cel mai mult a fost utilizată gena nptII, sau neo, genă izolată din transpozonul Tn5 de la Escherichia coli K12. Această genă codifică neomicinfosfotransferaza – enzima implicată în detoxificarea unor antibiotice aminoglucozidice cum ar fi:neomicina, kanamicina, paramomicina sau geneticina. Numeroase specii de plante au fost transformate cu gena nptII, cum ar fi tutunul, cartoful, Arabidopsis, porumbul, orezul, soia, bumbacul – ca să le amintim pe cele mai importante. Pentru această genă ca agenţi de selecţie se utilizează cel mai mult kanamicina (50 – 100 mg/l) sau geneticina. Unele specii de plante, mai ales monocotiledonate s-au dovedit insensibile la kanamicină, în acest caz geneticina dând rezultate mai bune. De asemenea, s-a observat că la unele specii kanamicina poate interfera cu procesele de organogeneză, afectând eficienţa regenerării plantelor transformate.

Tabelul 1. Principalele gene marker, de selecţie, folosite în transformarea plantelor (după Schrott, 1995).

Agent de selecţie	Gena marker	Marker de selecţie
kanamicină, neomicină geneticină (GA18)	nptII (APH3´II)	neomicinfosfotransferaza II
gentamicină	aacC3, aacC4	gentamicin-3-N-acetiltransferaza
higromicină	hph, hpt (APH4)	higromicin-fosfotransferaza
metotrexat	dhfr	dihidrofolatreductaza
spectinomicină	ADNr16S aadA	ARNr 16S aminoglicozidă-3’-adeniltransferaza
streptomicină	SPT ADNr 16S aadA	streptomicinfosfotransferaza ARNr 16S aminoglicozidă-3’-adeniltransferaza
bleomicină, fleomicină	ble	-
blasticidină	bsr	blasticidin S deaminaza
sulfonamidă	sul	dihidropteratsintaza
fosfinotricină	bar	fosfinotricinacetiltransferaza
clorsulfuron	als, csr-1	acetolactatsintetază
bromoxinil	bxn	bromoxinilnitrilaza
glifozat	EPSPS	5-enolpiruvil-3-fosfatsintetaza
2,4-D	tfdA	2,4-diclorfenoxiacetat monooxigenaza
atrazină	psbA	proteina Q_B
2,2-DCPA		dehalogenaza
4-metil-triptofan	tdc	triptofandecarboxilaza
nitrat	NR	nitratreductaza
S-amonoetil-L-cisteină	DHPS	dihidropicolinatsintetaza
lizină/treonină	AK	aspartatchinaza
aminoetil-cisteină	ocs	octopinsintetaza

O altă genă marker mult utilizată este gena hpt sau hph, genă izolată tot de la bacteria E. coli codificând enzima HPT (higromicinfosfotransferaza). Această enzimă detoxifică antibioticul higromicină B, antibiotic faţă de care majoritatea ţesuturilor vegetale sunt foarte sensibile. De aceea, această genă marker a fost utilizată pentru transformarea multor specii de plante, cum ar fi: tutunul, Arabidopsis, porumbul, orezul sau gramineele perene. Higromicina este îndeosebi foarte potrivită ca agent de selecţie pentru cereale, folosindu-se în concentraţii de 25-200 mg/l. Secvenţa codantă a genei a fost, de asemenea, modificată pentru o expresie mai bună în celula vegtală.

Dintre genele care conferă rezistenţă la erbicide cel mai mult a fost utilizată gena bar, izolată de la bacteria Streptomyces hygroscopicus şi gena pat de la S. viridochromogenes, ambele codificând enzima fosfinotricinacetiltransferaza. Fosfinotricina este compusul activ cel mai mult utilizat ca erbicid de selecţie a plantelor transformate genetic, genele amintite fiind transferate cu succes la plante ca: tutunul, rapiţa, porumbul, orezul, grâul şi altele.

O altă genă marker este gena dhfr pentru enzima dihidrofolatreductază (DHFR), izolată tot de la E. coli de pe plasmida R67. Enzima DHFR conferă rezistenţa la un analog al acidului folic, metotrexat, celulele vegetale fiind extrem de sensibile la concentraţii mici ale acestui compus (Schrott, 1995). Gena dhfr a fost transferată la specii cum ar fi: tutunul, petunia şi grâul.

Genele raportoare, spre deosebire de markerii de slecţie nu conferă celulelor rezistenţă faţă de un anumit compus. Ele codifică proteine care pot fi detectate direct sau catalizează reacţii specifice ai căror produşi pot fi detectaţi prin metode relativ simple. Genele raportoare permit studiul factorilor de transcripţie cis sau trans, în condiţiile transformării tranziente sau permanente, precum şi monitorizarea şi optimizarea tehnologiei de transformare. Cele mai importante gene raportoare sunt:

gena gus (uidA) – codifică β-glucuronidaza (GUS) şi a fost izolată de la E. coli K12 (Jefferson şi colab., 1986); este gena raportoare cel mai mult utilizată la plante. Există pentru această hidrolază compuşi substat pentru evidenţierea prin metode spectrofotometrice, fluorimetrice sau histochimice – la nivelul ţesuturilor rezultând un compus de culoare albastră uşor de evidenţiat. La pH-ul utilizat pentru determinarea GUS nu există activitate β-glucuronidazică detectabilă în nici un ţesut vegetal. Toate metodele de determinare se aplică însă, numai celulelor fixate, nonviabile.
gena raportoare luc pentru enzima luciferază foloseşte un sistem substrat-enzimă care produce bioluminescenţă. Gena luc a fost izolată de la o specie de licurici din America de Nord, Photinus pyralis, fiind exprimată în plante (Ow şi colab. 1986). Produsul genei, luciferaza poate fi extrasă din ţesuturi iar activitatea ei poate fi determinată în prezenţa luciferinei. Dar, există şi o metodă de determinare non-letală şi neinvazivă direct în ţesuturile şi organele plantelor transformate, pentru măsurarea bioluminescenţei fiind necesar un luminometru.
gena gfp pentru proteina cu fluorescenţă verde (GFP) – reprezintă cea mei nouă genă raportoare şi totodată cea mai spectaculoasă şi avantajoasă. Gena a fost izolată de la o meduză, Aequarea victoria, fiind transferată la câteva specii de plante (Chalfie şi colab., 1994). GFP prezintă o serie de avantaje şi anume: nu necesită un substrat, proteina se evidenţiază în ţesuturi intacte in vitro şi in vivo, prin excitarea în UV, proteina poate fi fuzionată cu alte proteine permiţând monitorizarea traficului proteic şi a metabolismului (vezi Rakosy-Tican şi colab., 1999; 2000).
gena cat izolată de la E. coli, codifică enzima cloramfenicolacetiltransferaza (CAT), fiind, de asemenea, mult utilizată ca genă raportoare la plante. Determinarea sa este mai pretenţioasă bazându-se pe monitorizarea acetilării cloramfenicolului prin marcarea cu ¹⁴C fie a acetil-CoA, fie a cloramfenicolului, produşii fiind separaţi prin cromatografie în strat subţire (TLC) şi măsuraţi prin densitometrie sau prin scintilaţie. Uneori poate exista activitate CAT şi în unele ţesuturi vegetale, mai ales la Brassicaceae, ceea ce afectează eficienţa acestui sistem.
antocianii sunt pigmenţi roşii sau purpurii care se acumulează în vacuole în unele ţesuturi ale plantelor. Sinteza de antociani este controlată de gene structurale şi reglatoare, unele dintre ultimele gene fiind izolate şi clonate. Astfel de gene pot fi utilizate ca gene raportoare în ţesuturile şi organele unor genotipuri care conţin gene structurale dar nu sintetizează antociani. Utilizarea antocianilor ca markeri prezintă o serie de avantaje: nu necesită un substrat, se exprimă doar în celulele viabile şi metabolic active, sunt uşor de vizualizat. Cel mai mult s-au utilizat genele pentru factorii de transcripţie R şi C1 de la porumb (Schrott, 1995).
genele care conferă rezistenţă la streptomicină şi/sau spectinomicină – au fost, de asemenea, utilizate ca gene raportoare prin efectul de etiolare pe care îl au, prin inactivarea cloroplastelor.

Progrese recente în transferul unor gene cu importanţă economică

De la cercetările fundamentale bazate pe utilizarea markerilor de selecţie sau a genelor raportoare s-a trecut treptat la utilizarea unor gene cu importanţă economică (figura 5).

Fig. 5. Cateva exemple de plante transgenice purtand gene cu importanţă economică

Tomatele FLAVR SAVR – gena antisens pentru poligalacuronaza
Garoafe cu viaţă prelungită in vază – modificarea metabolismului etilenei
Garoafe mov – “Moondust”, “Moonshadow”
Petunii portocali (purtand gena dfr de la porumb)
Plante rezistente la erbicide
Plante rezistente la insecte (gena pentru endotoxina Bt)
Plante rezistente la virusuri – gene pentru “coat protein”
Modificări ale metaboliţilor primari

Proteine
Uleiuri
Amidon
Vitamina A (“golden rice”), vitamina E

Plante bioreactoare (vaccinuri, anticorpi, proteine din lapte uman, proteina din fibra pânzei de paianjen)
Fitoremediere – plante rezistente sau care acumulează agenţi poluanţi

Astfel, în prima generaţie de planbte transformate genetic testate în cultura în câmp, sunt incluse plantele rezistente la erbicide, la insecte şi virusuri. Pentru rezistenţa la erbicide s-au utilizat genele de rezistenţa deja descrise ca gene marker. Rezistenţa la insecte s-a obţinut, în această primă etapă, prin transferul unei gene pentru o endotoxină izolată de la bacteria Bacillus thuringiensis, aşa numita toxină Bt. Rezistenţa la virusuri a fost obţinută prin transferul unor gene pentru proteine capsidale virale, care induc rezistenţa la un spectru mai larg de virusuri. Tot în prima generaţie de plante transgenice pot fi considerate şi tomatele FLAVR SAVR, tomate care au fost transformate cu o genă antisens pentru enzima poligalacturonază, implicată în înmuierea fructelor. S-au obţinut, astfel, tomate care se înmuiau mai greu având totodată calităţi organoleptice îmbunătăţite. Aceste tomate au fost primele plante transformate genetic introduse în consumul uman. Generaţiile următoare de plante transgenice cuprind plante având modificate căile metabolice – plante mai bogate în provitamina A sau E sau îmbogăţite în fier – orezul auriu („golden rice“), plante având uleiuri de calitate superioară pentru consumul uman sau uleiuri noi pentru uz industrial, plante care produc noi hidrocarburi, amidon de calitate mai bună, proteine îmbunătăţite sau proteine noi – de exemplu o proteină cu efect inhibitor asupra bacteriilor care produc carii dentare (cum este Streptococcus mutans), chiar vaccinuri sau proteine de uz terapeutic, noi strategii pentru a obţine plante rezistente la boli virale, fungice sau bacteriene sau rezistente faţă de nematode, plante rezistente la uscăciune şi extreme termice, plante ornamentale având culoarea, mirosul sau habitusul modificat şi altele (Herbes şi Sonnewald, 1999; http://www.agbioview.org)..

Progresul cercetărilor în acest domeniu este atât de alert încât o prezentare exaustivă este, actualmente, aproape imposibil de realizat. Deşi, realizările sunt extraordinare iar perspectivele de aplicare pe scară largă ar rezolva multe probleme de producţie şi calitate a produselor agricole pentru viitorul apropiat şi îndepărtat, se înregistrează astăzi, din păcate, o criză în domeniul aplicării biotehnologiilor vegetale cauzată de percepţia publică şi actvitatea unor organizaţii ecologiste. Problemele etice pe care le ridică aplicarea noilor biotehnologii trebuie analizate şi rezolvate cu multă chibzuinţă şi deschidere fără a frâna progresul din acest promiţător domeniu al geneticii (vezi Rakosy-Tican, 1998).

Bibliografie

1. Ackermann C. Pflanzen aus Agrobacterium rhizogenes Tumoren aus Nicotiana tabacum. Plant Sci. Lett., 8, 23-30 (1977).

2. Ahokas H. Transfection of germinating barley seed electrophoretically with exogenous DNA. Theor. Appl. Genet., 77, 469-472 (1989).

3. Bidney D., Scelonge C., Martich J., Burrus M., Sims L., Huffman G. Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molec. Biol., 18, 301-313 (1992).

4. Brisson N., Paszkowski J., Penswick J.R., Gronenborn B., Potrykus I., Hohn T. Expression of a bacterial gene in plants by using a viral vector. Nature, 310, 511-514 (1984).

5. De la Riva G.A., González-Cabrera J., Vásquez-Padrón R., Ayra-Pardo C. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation. Electronic Journal of Biotechnology, 1, 1-16 (1998).

6. Caboche M. Liposome-mediated transfer of nucleic acids into plant cells. Physiol. Plant, 79, 173-176 (1990).

7. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 263, 802-805 (1994).

8. Curtis I.S., He C., Power J.B., Mariotti D., de Laat Ad., Davey M.R. The effects of Agrobacterium rhizogenes rol AB genes in lettuce. Plant Sci., 115, 123-135 (1996).

9. Davey M.R., Rech E.L., Mulligan B.J. Direct DNA transfer to plant cells. Plant Mol. Biol., 13, 273-285 (1989).

10. Draper J., Davey M.R., Freeman J.P., Cocking E.C., Cox B.J. Ti plasmid homologous sequences present in tissues from Agrobacterium plasmid-transformed Petunia protoplasts. Plant Cell Physiol., 23, 451-458 (1982).

11. Fraley R.T., Rogers S.C., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., Fink C., Hoffman N., Sanders P. Expession of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 4803-4807 (1983).

12. Gasser C.S., Fraley R.T. Genetically engineering plants for crop improvement. Science, 244, 1293-1299 (1989).

13. Griesbach R.J., Hammond J. Incorporation of GUS gene into orhids via embryo electrophoresis. Acta Hort., 336, 165-169 (1993).

14. Herbes K., Sonnewald U. Production of new/modified proteins in transgenic plants. Current Opinion in Biotechnology, 10,163-168 (1999).

15. http://www.agbioview.org

16. JeffersonR.A., Burgess S.M., Hirsh D. β-glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 8447-8451 (1986).

17. Joersbo M., Okkels T. A novel principle for selection of transgenic plant cells: positive selection. Plant Cell Rep., 16, 219-221 (1996).

18. Kaeppler H.F., Gu W., Somers D.A., Rines H.W., Cockburn A.F. Silicon carbide fiber-mediated DNA delivery into plant cells. Plant Cell Rep., 8, 415-418 (1990).

19. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanford J.C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature, 327, 70-73 (1987).

20. Kost B., Galli A., Potrykus I., Neuhaus G. High efficiency transient and stable transformation by optimized DNA microinjection into Nicotiana tabacum protoplasts. J. Exp. Bot., 46, 1157-1167 (1995).

21. Ow D.W., Wood K.V., Deluca M., Dewet J.R., Helinski D.R., Howell S.H. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. Science, 234, 856-859 (1986).

22. Paszkowski J., Shilito R.D., Saul M., Mandak V., Hohn T., Hohn B., Potrykus I. Direct gene transfer to plants. EMBO J., 3, 2717-2722 (1984).

23. Potrykus I. Gene transfer to plants: assessment of published approaches and results. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42, 205-225 (1991).

24. Potrykus I., Spangenberg G. (eds.). Gene Transfer to Plants. Springer Lab Manual, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York (1995).

25. Rakosy-Tican L. Plant genetic manipulation strategies from the point of view of the risks for man and environment. In: Comisia Naţională UNESCO - Primul Simpozion Naţional (cu participare internaţională): Implicaţii ştiinţifice şi bioetice în analiza şi manipularea genomului - texte selectate, Bucureşti, Universitatea Bucureşti Centrul de analize Genomice şi Citogenetice Moleculare - CENTRAGEN, 119-124 (1998).

26. Rakosy-Tican L., Bancoş S., Ispas G. Utilizarea genei proteinei cu fluorescenţă verde (GFP) ca marker în experimente de transformare genetică şi hibridare somatică a plantelor. In: Cachiţă-Cosma D., Ardelean A., Crăciun C. (eds.), Culturi “in vitro” la cormofite, Risoprint Cluj-Napoca, 201-206 (1999).

27. Rakosy-Tican L., Neamţu S., Turcu I., Lucaciu C.M. Electroporarea şi electrostimularea, tehnici cu implicaţii în biotehnologia vegetală. In: Actualităţi şi perspective în biotehnologia vegetală - Lucrările celui de al IX-lea Simpozion Naţional de Culturi de Tesuturi şi Celule Vegetale - D. Cachiţă-Cosma, A. Bavaru, A. Brezeanu (eds.), "Ovidius" University Press, Constanţa, 64-79 (2000).

28. Rakosy-Tican L., Aurori A., Aurori C.M. Green fluorescent protein (gfp) – a new marker gene for plant genetic engineering. In: Eds. Crăciun C., Ardelean A. Current Problems in Cellular and Molecular Biology. V, Editura RISOPRINT Cluj-Napoca, 532-537 (2000).

29. Schrott M. Selectable markers and reporter genes. In: Potrykus I., Spangenberg G. (eds.) Gene Transfer to Plants. Springer Lab Manual, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 325-336 (1995).

30. Songstad D.D., Somers D.A., Griesbach R.J. Advances in alternative DNA delivery techniques. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 40, 1-15 (1995).

31. Tepfer D. Ri T-DNA from Agrobacterium rhizogenes: a source of genes having applications in rhizosphere biology and plant development, ecology and evolution. In: Kosuge T., Nester E. (eds.), Plant-microbe interactions. McGraw Hill, New York, 294-342 (1989).

32. Zhang L-J., Cheng L-M., Xu N., ZhaoN-M., Li C-G., Yuan J., Jia S-R. Efficient transformation of tobacco by ultrasonication.Bio/Technology, 9, 350-351 (1991).