Aplicaţii biotehnologice ale bacteriilor din genurile streptomyces Şi bacillus

De asemenea, studii recente au demonstrat posibilitatea utilizării bacteriilor din genul Streptomyces pentru clonarea unor gene cu origine diferită şi pentru producerea proteinelor corespunzătoare (Erpicum şi colab., 1990). In plus, metaboliţii secundari ai acestor bacterii oferă avantajul exprimării (sintezei) prelungite a unui produs şi după faza iniţială de creştere a culturii (Gardner şi Cadman, 1990).

In cazul enzimelor produse de bacteriile din genul Bacillus, aplicaţiile practice sunt bine cunoscute, ele fiind prezentate pe scurt în Tabelul 3.
Tabelul 3. Tipuri de enzime hidrolitice produse de bacili şi principalele aplicaţii ale acestora

Enzima	Tipul enzimei	Specia producătoare	Utilizări
Proteaze alcaline	Extracelulare	B. subtilis B. pumillus B. amylosacchariticus B. licheniformis	detergenţi industria alimentară industria pielăriei
Proteaze neutre	Extracelulare	B.subtilis B. amyloliquefaciens B. thermoproteolyticus B. amylosacchariticus B. stearothermophilus B. cereus	Industria berii Industria alimentară
α-amilaze	Extracelulare	B. subtilis B.licheniformis B.coagulans B. stearothermophilus B. cereus var.mycoides	Industria alimentară degradarea amidonului
Β-amilază	Extracelulare	B. polymyxa B.circulans B. megatherium B. cereus var.mycoides	industria alimentară degradarea amidonului
Celulaze	Extracelulare	B.subtilis B.polymyxa B. licheniformis B. cereus	Industria alimentară Industria textilă Industria celulozei şi hârtiei Zootehnie Tratarea deşeurilor agricole

Datorită acestor considerente o trecere în revistă a principalelor tipuri de enzime (cu posibilă valoare biotehnologică) este nu numai interesantă ci şi necesară.
3.1. Proteaze
Proteazele microbiene constituie un grup complex de enzime hidrolitice, care diferă prin specificitatea de substrat, mecanism de reacţie, dependenţa activităţii enzimatice şi stabilităţii în funcţie de pH şi temperatură. Acţiunea lor poate fi blocată, activată, sau inhibată într-o anumită proporţie de agenţi fizici, chimici sau biologici. Producţia şi caracteristicile enzimelor microbiene pot fi influenţate prin selecţia tulpinii producătoare şi alegerea condiţiilor de cultivare ale acesteia.

Enzimele din categoria proteazelor hidrolizează majoritatea proteinelor comune cum ar fi: caseina, hemoglobina, gelatina, albumina de ou, glutenul, proteina din soia şi alte proteine vegetale şi animale. Condiţiile de hidroliză precum şi randamentul operaţiei în sine depind însă de natura, caracteristicile şi gradul de puritate al preparatului proteolitic utilizat.

Numeroasele utilizări ale enzimelor proteolitice, în cele mai diferite domenii de activitate (industria alimentară, farmaceutică, agricultură, industria detergenţilor, medicină) au determinat demararea cercetărilor în vederea obţinerii acestora pe cale biotehnologică ţinând seama în acelaşi timp de avantajele pe care le oferă utilizarea microorganismelor ca sursă biologică, precum şi de proprietăţile enzimelor microbiene.

Proteazele reprezintă un grup de enzime hidrolitice, de obicei extracelulare, care scindează molecula proteică în fragmente polipeptidice formate din câţiva aminoacizi uniţi prin legături peptidice. Aceste polipeptide pot fi în continuare degradate de către peptidaze până la aminoacizii componenţi. Peptidazele, în funcţie de modul lor de acţiune sunt de două tipuri: endopeptidaze şi exopeptidaze. La rândul lor exopeptidazele pot fi: aminopeptidaze care îşi încep acţiunea de la nivelul extremităţii NH₂ libere a polipeptidului, activitatea lor depinzând de prezenţa unor ioni metalici; carboxipeptidaze care îşi încep atacul de la capǎtul COOH liber al peptidului (Scriban, 1988).

Clasificarea enzimelor proteolitice se face, conform recomandǎrilor International Unit of Biochemistry în şase familii, diferenţele dintre ele datorându-se secvenţelor de aminoacizi care alcătuiesc situsul activ (Tabelul 4) (Neurath, 1989).
Tabelul 4. Familii de enzime proteolitice (după Neurath, 1989)

Familia	Proteaze reprezentative	Resturi caractiristice de aminoacizi ale situsului activ
Serin proteaze I	Chimiotripsina, tripsina, elastaza, kalikreina,pancreatina	Asp^102Ser^195His^57
Serin proteaze II	Subtilizina	Asp^32Ser^221His^64
Cistein proteaze	Papaina, actinidin, catepsina B şi H de la şobolan	Cys^25His^159Asp^158
Aspartic proteaze	Penicilopepsin, renina, proteaze acide de la Rhizopus sp.	Asp^33Asp^213
Metaloproteaze I	Carboxipeptidaza A bovină	Zn, Glu^270 Try^248
Metaloproteaze II	Termolizina	Zn Glu^143His^231

Membrii fiecărei familii se crede că au rezultat dintr-o formă ancestrală comună, în urma unui proces evolutiv divergent. Din datele prezentate în tabelul 2 se remarcă faptul că serin proteazele includ două familii distincte: serin-proteazele de la mamifere şi cele de origine bacteriană. Deşi prezintă un mecanism enzimatic comun, cele două familii de serinproteaze diferă ca secvenţă de aminoacizi şi ca structură tridimensională.

In mod similar, metalopreoteazele includ şi ele tot două familii în funcţie de originea lor şi de structura chimică: de la mamifere şi de la bacterii. Există şi alte enzime proteolitice identificate la diferite grupe de organisme care nu pot fi încadrate încă în nici una dintre grupele de mai sus deoarece mecanismul lor de acţiune şi situsul activ nu este cunoscut cu exactitate. Acesta este cazul colagenazelor şi aminopeptidazelor.

Proteazele bacteriene produse de tulpini de Bacillus subtilis sunt amestecuri de proteaze alcaline (subsubclasa 3.4.21, proteaze serinice) şi proteaze neutre (subsubclasa 3.4.24, metaloproteaze).

Proteazele serinice au în centrul lor activ serina şi histidina. Acest grup a fost divizat de Morihara în alte 4 subgrupe:

• 
  proteaze similare tripsinei;
  
• 
  proteaze alcaline;
  
• 
  proteaze Myxobacter α-litice;
  
• 
  proteaze stafilococice.
  

Proteazele similare tripsinei cuprind, în afară de tripsină şi chimotripsină, enzime produse de specii de Streptomyces, care hidrolizează legăturile Arg²² – Gly²³ şi Lys²⁹ – Ala³⁰ din lanţul β-insulinic, această specificitate de substrat fiind trăsătura distinctivă.

Aceste enzime acţionează la pH 8,0, au temperatura optimă de cataliză 50C, sunt inhibate de diizopropilfluorfosfat (DIFP), p–cloromercurilbenzoic (PCMB), tosyl-L-lizin-clorometilcetonă (TLCK), tripsin-inhibitorul din soia. Activitatea lor nu este influenţată de etilendiaminotetraacetat (EDTA) şi acid iod-acetic (IAA), în plus prezintă şi activitate esterazică şi amidazică.

A doua grupă de proteaze serinice sunt proteazele alcaline; acestea pot fi produse de bacterii, drojdii şi fungi fiind prezente şi în ţesuturile animale. În această grupă se încadrează şi proteazele alcaline produse de unele tulpini de B.subtilis şi cele fungice din Aspergillus oryzae.

Aceste proteaze au acţiune specifică faţă de resturile de aminoacizi aromatici sau hidrofobi care participă cu gruparea carboxil la legătura care se scindează; valoarea optimă a pH este cuprins între pH 9 şi pH 11, dar enzimele rămân active în domeniul de pH 5–9; aceste proteaze sunt inhibate de DIFP, de PMSF fiind însă rezistente şa acţiunea EDTA sau ortofenantrolinei. Din acest grup fac parte proteazele cunoscute sub denumirea de subtilizine sau subtilopeptidaze. S-a constatat că aceste proteaze nu sunt exclusiv produse de B.subtilis ci în general de bacterii ale genului Bacillus astfel încât s-a propus numele generic de bacilopeptidaze. Respectivele enzime pot fi clasificate în două grupe:

• 
  Bacilopeptidaze A care cuprind subtilizina Carlsberg (proteaza alcalină produsă de tulpini de B.licheniformis) şi proteaza alcalină produsă de B.pumilis;
  
• 
  Bacilopeptidaze B care includ subtilizina NOVO (protează alcalină sintetizată de B.subtilis NRRL B3411) şi subtilizina BNP (Bacterial Protease Nagarse), protează alcalină din B. subtilis var. amylosacchariticus.
  

Metodele de examinare a amestecurilor de enzime produse de diferiţi bacili au arătat că bacteriile producătoare de bacilopeptidaze A nu sintetizează proteaze neutre sau amilază, în timp ce bacteriile producătoare de bacilopeptidaze B sintetizează în acelaşi timp şi proteaze neutre şi amilază în acelaşi timp.

Metaloproteazele sunt proteaze activate de ionii metalici legaţi de centrul activ al enzimei (Ca²⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺). Ele pot fi metaloproteaze neutre şi metaloproteaze alcaline. Proteazele neutre conţin de obicei Zn şi prezintă specificitate faţă de aminoacizii hidrofobi implicaţi cu gruparea amino în legătura peptidică. Ele au un pH optim de acţiune cuprins între pH 7 şi pH 8, sunt inhibate complet de EDTA (care complexează atomul de Zn din structură) fiind sensibile la concentraţii de EDTA sub 10^-3M, orto-fenantrolină, nefiind afectate de DIFP şi PCMB.

Metaloproteazele alcaline conţin, de asemenea, un ion metalic implicat în mecanismul de reacţie catalitică. Ele îşi manifestă activitatea optimă în domeniul de pH 7–9, fiind mai puţin inhibate de EDTA decât proteazele neutre, necesitând concentraţii mai ridicate de 10^-2 M pentru inactivare.

Proteazele neutre produse de Bacillus subtilis var. amylosacchariticus sunt diferite de proteazele neutre produse de Bacillus subtilis NRRL B3441 şi din acest motiv este necesară specificarea exactă a provenienţei proteazei neutre respective. Producerea lor este supusă represiei exercitate de prezenţa în mediul de incubare a unor aminoacizi în cantitate mai mare (Bawden şi colab.,1987). Aceste enzime sunt folosite în prezent la fabricarea detergenţilor la tratarea pieilor în industria pielăriei, frăgezirea cărnii, eliminarea depozitelor proteice din băuturile fermentate (Sasson, 1988). La aceste bacterii s-au realizat şi numeroase studii referitoare la determinismul genetic şi controlul producerii şi excreţiei acestor enzime în scopul obţinerii prin clonare a unor tulpini superproducătoare (Mc Connell şi colab., 1986).

S-a dovedit faptul că producerea de proteaze este supusă unor mecanisme reglatoare complexe, între care un rol cheie este jucat de sistemul DegS-DegU precum şi de factorii de reglare DegR and DegQ (Nagami and Tanaka, 1986; Tanaka et al., 1987; Ogura et al., 1994). Aceşti factori reglatori se pare că sunt implicaţi în superproducţia de proteaze cel puţin în cazul unor tulpini de B.subtilis. De asemenea, relativ recent, Ogura et al (1994) au caracterizat alte două gene: proB (ce codifică sinteza γ-glutamil kinazei) şi proA (codifică sinteza glutamil-γ-semialdehid dehidrogenaza) ale căror produşi par a fi implicaţi în sporirea capacităţii de biosinteză a exoproteazelor la o tulpină de B.subtilis. Astfel, cele două gene au fost clonate într-un vector e clonare (pLC1) şi apoi introduse, împreună cu un alt vector (pNC61) ce conţine gena reglatoare prtR (degR) într-o tulpină de B.subtilis. Transformanţii obţinuţi au prezentat o activitate proteolitică mai mare decât a tulpinii parentale.

Date fiind aplicaţiile practice ale acestor enzime extracelulare, preocupările cercetătorilor vizează sporirea nivelului de biosinteză ca şi mărirea stabilităţii enzimelor în diferite condiţii experimentale. Aceste deziderate se pot realiza pe mai multe căi, printre care cele ce utilizează metodele clasice de ameliorare a microoganismelor (prin tratament cu agenţi mutageni) şi cele moderne, de inginerie genetică (fuziunea de protoplaşti şi tehnologia ADN recombinant).

Conform datelor de literatură, mutagenii cei mai eficienţi sunt nitrosometiluree, nitrosoguanidina, dietilsulfatul, precum şi agenţi fizici de tipul radiaţiilor X sau a radiaţiilor . Astfel, prin mutageneză s-a reuşit ridicarea nivelului de biosinteză a tulpinilor de B.subtilis de aproximativ 8-10 ori.

În cel de-al doilea caz, majoritatea tulpinilor superproducătoare de proteaze care prezintă anumite caracteristici s-au obţinut prin inginerie genetică. Astfel, sunt foarte cunoscute rezultatele obţinute de cercetătorii japonezi care, pornind de la tulpini sălbatice de B.thermoproteolyticus şi B.stearothermophilus au reuşit obţinerea de tulpini producătoare de termolizină, o protează foarte diferită de celelalte proteaze neutre în ceea ce priveşte termostabilitatea şi mecanismul de acţiune. În prezent, cunoscându-se structura termolizinei precum şi genele răspunzătoare de caracteristicile sale deosebite, se încearcă obţinerea de tulpini de B.subtilis, B.stearothermophilus modificate genetic, capabile să producă proteaze termostabile sau stabile la valori diferite ale pH sau la acţiunea unor agenţi inhibitori.

In cazul bacteriilor din genul Streptomyces examinarea lichidelor de cultură a unor tulpini producătoare de antibiotice a dus la evidenţierea prezenţei unui amestec de enzime dintre care, un loc important din punct de vedere cantitativ îl ocupă proteazele (neutre şi alcaline) şi peptidazele (aminopeptidaze) (Pokorny şi Vitale, 1980).

Vitale şi colab.(1980) au reuşit izolarea din filtrat de cultură de S.rimosus a unei serin proteaze care a prezentat un pH optim de acţiune cuprins între 7 şi 9 şi al cărei substrat de acţiune este reprezentat de proteine sau de peptide mari, hidrolizând în general esterii terminali simpli.

Recent, Renko şi colab.(1989) au prezentat particularităţile unei proteaze de tip tripsinic ("trypsin-like proteinase") izolată tot din filtrat de cultură de S.rimosus evidenţiind faptul că aceasta este o protează alcalină, sensibilă la acţiunea inhibitorului proteazic PMSF (specific pentru serin-proteaze) ca şi la cea a α-antitripsinei. Aceste enzime au activitate arginil-aminopeptidazică atât asupra proteinelor cât şi asupra peptidelor mai mici. Enzime similare au fost izolate şi caracterizate şi de la alte specii de Streptomyces: S.fradiae, S.paromomycinus, S.moderatus, S.hygroscopicus etc. O situaţie oarecum specială o prezintă S.griseus care produce un amestec de proteaze neutre şi alcaline, produsul obţinut fiind denumit pronază, el fiind studiat mai intens în scopul elucidării mecanismului de acţiune şi a omologiei sale cu tripsinele vertebratelor (Read şi colab.,1984).

Aceste studii au importanţă atât teoretică prin contribuţiile aduse la înţelegerea unor aspecte evolutive, a taxonomiei serin-proteazelor dar şi practică, aceste enzime putând înlocui tripsina în anumite reacţii biochimice.

S-a dovedit de asemenea că unele specii de streptomicete, cum ar fi de pildă S.rimosus, pot produce şi o altă categorie de proteaze: metaloproteaze (Vitale şi colab.,1987). Aceste enzime sunt fie bazice fie neutre, fiind activate de ionii de calciu, mangan sau zinc, stabilizate de ionii de calciu şi inhibate de EDTA. Metaloproteazele alcaline acţionează doar asupra proteinelor, nu şi asupra peptidelor în timp ce metaloproteazele neutre degradează în egală măsură proteinele şi peptidele. In cazul acestora din urmă acţiunea enzimatică se manifestă la extremitatea COOH, ceea ce permite încadrarea lor printre dipeptidil-carboxipeptidaze. De asemenea, s-a reuşit izolarea de la mai multe specii de Streptomyces (S.rimosus, S.fradiae, S.peptidofaciens, S.griseus) a unor peptidaze care, pe baza proprietăţilor specifice (specificitatea de substrat, inhibarea de către EDTA, activare de către ionii de calciu, magneziu, prezenţa leucinei la capătul NH₂ terminal) au fost identificate ca fiind leucin-amino-peptidaze (Vitale şi colab.,1986).

Tinând cont că în ultima vreme streptomicetele au început să fie utilizate drept gazde pentru clonarea de material genetic heterolog, este interesant de ştiut dacă tulpinile utilizate de obicei drept acceptori elaborează sau nu proteaze. Producerea unor asemenea enzime la aceste tulpini constituie un serios impediment în obţinerea produsului dorit. Pornind de la această idee, Aretz şi colab.(1989) au studiat prezenţa enzimelor proteolitice la tulpina S.lividans TK24, tulpină recombinată obţinută pentru prelucrarea şi secretarea unei proteine de fuziune (între inhibitorul α-amilazei de la S.tendae şi proinsulina de la maimuţa Macacca fascicularis). După purificarea prin cromatografie pe schimbători de ion au fost separate mai multe tipuri de enzime proteolitice: alanin-aminopeptidaze, leucin-aminopeptidaze, proteaze de tip tripsinic şi proteaze de tip chimiotripsinic. Dintre acestea, proteazele de tip chimiotripsinic ("chemo-trypsin-like") sunt cele care degradează proteina de fuziune dar această acţiune poate fi inhibată prin adăugarea în mediul de culturăa unor săruri de zinc sau nichel.

Dacă în cazul bacililor au fost izolate şi clonate genele ce codifică sinteza a două subtilizine şi a unei proteaze neutre (Mc Connell şi colab.,1986), în cazul bacteriilor din genul Streptomyces studiile referitoare la determinismul genetic al producerii de proteaze sunt mult mai puţine. Astfel, Duez şi colab.(1987) au reuşit izolarea, clonarea şi secvenţierea genei pentru o peptidază extracelulară de la Streptomyces sp.R61 la S.lividans, iar Henderson şi colab.(1987) au caracterizat genele pentru proteazele A şi B de la S.griseus.

In cazul unor tulpini de streptomicete au fost evidenţiate unele enzime proteolitice care degradează preferenţial colagenul ("collagenase-like")(Mukhopadhyay şi Chandra, 1987). Deşi nu au fost izolate şi purificate (s-au utilizat filtrate de cultură) enzimele de tip colagenaze de la Streptomyces au evidenţiat o activitate specifică pe colagen din tendon bovin şi piele de viţel, la 28⁰ C şi pH 7,2-7,5, fiind inhibate de EDTA şi azidă de sodiu. Deşi neobişnuită, producerea unor asemenea enzime de către streptomicete nu este surprinzătoare dacă ne gândim la multitudinea de substrate nutritive pe care aceste bacterii le pot găsi în sol.

3.2. α-Amilazele
α-Amilazele (1,4-α-D-glucan-glucanhidrolaza, EC 3.2.1.1.) sunt larg răspândite în rândul microorganismelor, atât la fungi cât şi la bacterii, mai ales la specii ale genurilor Bacillus şi Streptomyces, acţiunea lor constând în hidroliza legăturilor α-1,4-glicozidice de la nivelul amidonului, eliberând maltoza. Cel mai mult studiate şi utilizate în practică sunt α-amilazele produse de speciile de Bacillus (B.amilolyquefaciens, B.licheniformis, B.stearothermophilus, B.subtilis etc). Aceste bacterii produc două tipuri de α-amilaze: de lichefiere a amidonului (degradarea amidonului până la maltodextrine) şi de zaharificare (convertesc maltoza la glucoză). α-Amilazele produse de tulpinile de B.licheniformis prezintă un interes special datorită rezistenţei lor la temperaturi ridicate (85-115⁰C). In general, enzimele respective sunt utilizate în practică în lichefierea amidonului în industria distilatelor ca şi în industria textilă (Zarnea şi colab.,1980).

O serie de studii genetice realizate prin experimente de mutageneză sau prin clonări de gene au evidenţiat faptul că gena pentru α-amilază de la B.subtilis se află sub un control genetic complex care este însă puţin cunoscut la nivel molecular (Mc Connell şi colab.,1986). Se pare însă că există mai multe gene reglatoare cu efecte pleiotropice (sacU, sacQ, prtR) care intervin în exprimarea genei pentru α-amilază, levansucrază, serin protează, proteaze neutre şi β-glucanază (Priest, 1987).

In cazul streptomicetelor au fost izolate şi caracterizate α-amilaze de la mai multe specii, acest tip de enzime părând a fi sintetizat practic de majoritatea bacteriilor aparţinând acestui grup. O atenţie specială a fost acordată α-amilazei produsă de S.hygroscopicus (Hoshiko şi colab.,1987), S.limosus (Virolle şi Bibb, 1988) şi S.venezuelae (Virolle şi colab.,1988) la aceste specii fiind studiat şi genele ce codifică sinteza şi reglarea sintezei acestor enzime. De asemenea, s-au efectuat experimente de clonare a genelor respective în diferite gazde (E.coli, S.lividans) în scopul obţinerii unor tulpini superproducătoare de interes industrial. Pe lângă aspectul practic al cercetărilor de acest tip, ele mai pot oferi o serie de informaţii referitoare la modul de exprimare şi reglare a funcţiilor genelor de la streptomicete (în particular a genelor pentru α-amilază). Mai mult, rezultatele obţinute au permis o comparare a enzimelor de tip α-amilază produse de streptomicete cu cele produse de alte organisme, în special cu cele produse de eucarioate (Mac Gregor, 1988).

S-a dovedit că S.hygrosopicus produce o α-amilază care degradează amidonul până la maltoză, acţiunea sa fiind de tip endoglucanolitic (taie legăturile α-1,4 glicozidice din interiorul lanţului polizaharidic). Compararea secvenţei de aminoacizi pe care această enzimă o conţine cu cele ale altor enzime de acest tip, fie de la procariote (de la bacili) fie de la eucariote (de la Aspergillus oryzae, A.nidulans, Hordeum vulgare, Drosophila melanosgaster etc) a evidenţiat faptul că există trei regiuni care sunt conservate la toate aceste enzime, indiferent de origine (Ihara şi colab.,1985). Cu toate acestea, α-amilaza de la S.hygroscopicus este unică deoarece conţine triptofan la nivelul celei de-a treia regiuni conservate (Mac Gregor, 1988).

Experimentele de clonare a genei amy de la S.hygroscopicus în alte gazde cum ar fi E.coli şi S.lividans au evidenţiat faptul că, deşi transferul genei s-a realizat eficient, exprimarea sa variază în funcţie de gazdă şi de numărul de copii ale genei respective (efectul de dozare a genei). Hoshika şi colab. (1987) utilizând cartarea cu o nuclează specifică ("mung bean nuclease") au determinat faptul că gena amy de la S.hygroscopicus prezintă trei situsuri de iniţiere a transcrierii (trei promotori): amyP1, amyP2 şi amyP3, care au asemănări mai mult sau mai puţin extinse cu promotorii altor gene de la Streptomyces (endoH, ermP1, aphP1).

Studii similare au fost făcute şi cu gena pentru α-amilază (aml) de la S.limosus şi S.venezuelae. In cazul tulpinilor de S.venezuelae analizate s-a observat că exprimarea genei aml este represată puternic de glucoză în timp ce asupra exprimării genei similare de la S.limosus glucoza nu are efect. Exprimarea acestei gene este însă influenţată (represată) puternic de manitol (Virolle şi colab.,1988). Interesant este că prin clonarea genei aml de la S.limosus în S.lividans exprimarea genei este puternic represată de glucoză în noua gazdă (Virolle şi Bibb 1988). Acesta înseamnă că rezistenţa la acţiunea glucozei evidenţiată la tulpinile de S.limosus analizate este mai degrabă o particularitate a bacteriei decât a genei pentru α-amilază. De asemenea, în urma comparării secvenţei de aminoacizi a acestei proteine cu proteine similare de la eucariote s-a observat o omologie ridicată cu α-amilaza produsă de Drosophila melanogaster (>40%), Mus musculus (36,8%), Aspergillus nidulans (36,1%) şi mai mică cu enzimele similare de la B.subtilis (22,6%) şi B.amylolyquefaciens (16,1%)(Long şi colab.,1987).