Avian influenza hastaliği acil eylem plani

EK-15: AI VİRUS ANTİKORLARININ TESPİTİNDE KULLANILAN SEROLOJİK TESTLER

Hangi virüs H alt tipinin sorumlu olduğu bilinen eradikasyon programlarında ya da homolog virüsün antijen olarak kullanılması yolu ile, enfeksiyon delili için HI testleri kullanılarak serolojik izleme yapılabilir.

H alt tipinin bilinmediği durumlarda influenza A’ya karşı oluşmuş antikorları tespit için gurup spesifik antikorları tespit edebilen testler kullanılmaktadır. Bu amaçla agar jel immünodifüzyon testi ya da ELISA testi kullanılabilir (ELISA ile ilgili bir problem, konakçı immünoglobulinlerinin tespit edilmesine dayalı olmasından dolayı testin konakçı belirlenmesidir). Tip A influenza nükleoproteinine yönelik monoklonal antikorların kullanıldığı ve Tip A influenza virüsü nükleoproteinini gösteren duyarlı ve spesifik bir ELISA mevcuttur.

Su kuşları agar jel immunodiffüzyon testlerine nadiren pozitif reaksiyon verirler ve alt tip bilinmediği sürece bu tür kanatlılarda yalnızca H5 ve H7 alt tipleri ile ilgili antikorların varlığının araştırılması uygun bir işlem olmaktadır.
Örnekler

Sürü büyüklüğü 20’den daha az ise bütün kanatlılardan kan örnekleri alınır. Daha büyük sürülerden ise 20 kan örneği alınır (böylece sürü büyüklüğüne bağlı olmaksızın sürünün %25 ya da daha fazlasının pozitif olması durumunda %99 olasılıkla en az bir pozitif serumun yakalanması mümkün olur). Kan pıhtılaşmaya bırakılmalı ve test için serumu alınmalıdır.

Antikorların Aranması

Bireysel serum örnekleri influenza virüsü inhibe etme yetenekleri yönünden HI testi ile test edilmelidir. Laboratuvarlar arasında HA ve HI test prosedürleri arasında farklılıklar mevcuttur. Aşağıda tavsiye edilen örnekler, her iki test tipi için nihai hacmin 0.075 ml olduğu V-tabanlı plastik mikropleytlerin kullanımı için geçerlidir.

Hemaglütinasyon (HA) Test Ayıraçları

• 
  İzotonik PBS (0.1 M, pH 7.0-7.2)
  
• 
  En az üç adet SPF tavuktan alınan (eğer bu yoksa düzenli olarak muayene edilen ve AI antikorları taşımayan kanatlılardan alınan kan ) ve eşit hacimde Alsever solusyonuna konur. Kan hücreleri kullanımdan önce PBS’de üç kez yıkanırlar ve %1 süspansiyon şeklinde (paketlenmiş hücre v/v) kullanılırlar.
  
• 
  Hemaglutinasyon antijeni (standart antijen olarak düşük virülensli H5 ve H7 virüsleri kullanılır).
  
• 
  Pozitif ve negatif kontrol anti serumları.
  

Prosedür ;

Plastik mikro pleytin (V tabanlı gözler kullanılmalıdır) her gözüne 0.025 ml PBS konur.

İlk göze 0.025 ml virüs süspansiyonu konur (enfektif allantoik sıvı).

Mikrotitrasyon sulandırıcısı kullanılarak pleyt boyunca virüsün iki katlı dilüsyonları yapılır (1:2 den 1:4096’ya)

Her göze ilave olarak 0.025 ml PBS konur.

Her göze 0.025 ml % 1’lik eritrosit süspansiyonundan, konur.

Mikro pleytin kenarlarına hafifçe vurularak iyice karışması sağlanır ve oda sıcaklığında 40 dakika eritrositlerin çökmesi için beklenir (örneğin 20 ⁰C), ya da eğer ortam sıcaklığı çok yüksek ise 4 ⁰C’de 60 dakika bekletilir. Bu yolla kontrol gözündeki eritrosit bariz bir düğme halinde çökmelidir.

Pleyt hafifçe eğimli tutularak eritrositlerin gözyaşı şeklindeki akımının varlığı ya da yokluğu ile HA tespit edilir. HA bulunmayan gözlerin virüs içermeyen kontrol gözleriyle aynı oranda akım göstermesi beklenir.

HA titresi eritrositlerin aglütinasyonunu sağlayan en yüksek dilüsyondur. Bu dilüsyon 1 HA ünitesi olarak (HAU) kabul edilebilir. HA titresini daha doğru bir şekilde tayin etme metodu HA virüs testlerinin birbirine yakın başlangıç dilüsyonlarında yapılmasıdır örneğin 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 gibi. Bu uygulama HI testlerinde kullanılacak antijenin doğru şekilde hazırlanması için önerilmektedir.
Hemaglütinasyon Inhibisyon (HI) Test Ayıraçları

• 
  İzotonik PBS (0.1 M, pH 7.0-7.2)
  
• 
  Her 0.025 ml’de 4 veya 8 HAU içerecek şekilde PBS ile sulandırılmış virüs içeren allantoik sıvı.
  
• 
  Yıkanmış tavuk eritrositleri (%1’lik solüsyon)
  
• 
  Negatif ve Pozitif tavuk kontrol serumu.
  

Prosedür ;

Plastik V tabanlı mikro pleytinin her gözüne 0.025 ml PBS konur.

Pleytin ilk gözüne 0.025 ml serum serum konur.

Serumun pleyt boyunca 0.025 ml hacminin iki katlı dilüsyonları yapılır.

Her göze 0.025 ml içinde 4 HAU virüs / antijen konur ve en az 30 dakika süre ile oda sıcaklığında bekletilir (örneğin 20 ⁰C) ya da 4 ⁰C’de 60 dakika bekletilir.

Her göze 0.025 ml, %1 (v/v) tavuk eritrositleri konur ve hafifçe karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında 40 dakika süresince alyuvarların çökmesi beklenir (örneğin 20 ⁰C) ya da eğer ortam sıcaklığı çok yüksek ise 4 ⁰C’de 60 dakika bekletilir. Kan kontrol gözündeki eritrositlerin bariz bir düğme üzerine/halinde çökmeleri beklenir.

4 HAU antijenin tam olarak inhibisyonunu en yüksek serum dilüsyonu HI titresini verir. Aglütinasyonun tayini pleytlerin sallanması ile sağlanır. Yalnızca içinde kontrol gözleri ile aynı oranda akım gösteren eritrosit bulunan gözlerin inhibisyon gösterdikleri kabul edilmelidir (yalnızca 0.025 ml eritrosit ve 0.05 ml PBS).

Test sonuçlarının geçerliliği negatif kontrol serumuna ve pozitif kontrol serumuna kıyasla değerlendirilir. Negatif kontrol serumunda ¼’ten yukarı titre olmamalıdır ( >2² ya da >log₂ 2) pozitif kontrol serumunda ise titre bildirilen titrenin dilüsyonunda olmalıdır.

4 HAU antijenine karşı 1/16 ya da daha yukarı serum dilüsyonunda (2 ⁴ veya log₂ 4) eğer bir inhibisyon varsa HI titreleri pozitif olarak kabul edilebilir. Bazı laboratuvarlar HI testlerinde 8 HAU kullanmayı tercih etmektedirler. Bu durum kabul edilebilir olmakla birlikte pozitif titrenin 1/8 (2³ veya log₂ 3) ve daha fazla olduğu sonuçların yorumlanmasını etkileyebilmektedir.

Bu testte tavuk serumları nadiren nonspesifik pozitif reaksiyonlar vermektedirler ve serumların herhangi bir ön işlemden geçirilmesine gerek yoktur. Tavuk dışındaki türlerin serumları bazen tavuk eritrositlerini aglütine edebilmektedir, bu nedenle bu özellik önceden tespit edilerek serumun tavuk eritrositleri ile adsorbsiyonu yolu ile sorun giderilmelidir. Bu işlem için her bir 0.5 ml anti seruma 0.025 ml paketlenmiş tavuk eritrositi eklenir, hafifçe sallanır ve en az 30 dakika bekletilir; daha sonra alyuvarlar 800 g’de 2-5 dakika santrifüj edilerek pelet haline getirilir adsorbe edilen serumlar boşaltılır. Buna alternatif olarak araştırılmakta olan kanatlı türlerinin eritrositleri kullanılabilir.

Agar Jel Immünodifüzyon Testi (AGID)

İnfluenza A virüsünün varlığını göstermek için tercih edilen metot bütün influenza A virüslerinin ortak özelliği olan nükleokapsit veya matriks antijenlerinin gösterilmesidir. Bu özellik AGID testlerinde herhangi bir influenza A virüsüne karşı aranacak antikorların varlığının ya da yokluğunun tespitini mümkün kılmaktadır. AGID testlerinde bu işlem genellikle ya konsantre virüs preparatları kullanılarak ya da enfekte koriyo allantoik membranlardan elde edilen virüs ekstraktları kullanılarak gerçekleştirilir.

Testler genelde %1 agarose (w/v) (mega pürifiye agar) ve % 8 sodyum klorür (w/v)’ün % 0.1 M fosfat buffer (pH 7.2 ) içindeki çözeltisi ile hazırlanırlar. Petri kutularına veya mikroskop lamlarına 2-3 mm kalınlığında dökülürler Şablon ve delici kullanılarak birbirinden 2-5 mm uzaklıkta 5 mm çapında gözler açılır. Her bir şüpheli serum bilinen pozitif seruma ve antijene bitişik olmalıdır. Bu durum bilinen pozitif serum, şüpheli serum ve antijen arasında sürekli bir çizgi şeklinde presipitasyon hattı yaratacaktır. Her bir göze yaklaşık 0.050 ml reagent konulmalıdır. Presipitin hatları yaklaşık 24-48 saat sonra saptanabilir hale gelirler. Ancak bu, antikor ve antijenin konsantrasyonlarına bağlı olabilir. Oluşan presipitin hatları en iyi şekilde arkadan ışık verilerek koyu bir zemine karşı gözlenebilirler.

Bilinen pozitif kontrol kuyucukları arasında oluşan presipitin hatları test kuyucuğundaki serum ve antijen arasındaki hatla birleşiyorsa test sonucu spesifik, pozitif bir cevap olarak değerlendirilir. Presipitasyon hatları birbirleriyle çapraz olarak kesiştikleri durumda pozitif kontrol kuyucuğundaki antikorlarla test serumunun benzerlik (identik) olmadığı anlaşılır.