FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- KAYNAKLAR Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.20. DROSOPHILA MELANOGASTER’ DA CİNSİYETE BAĞLI ÇEKİNİK ÖLÜMCÜL TEST
- 3. RAPORLAMA
- KAYNAKLAR Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B .21. IN VITRO MEMELİ HÜCRESİ DÖNÜŞÜM TESTLERİ YÖNTEM
- KAYNAKLAR Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.22. KEMİRGENLERDE BASKIN ÖLÜMCÜL TEST YÖNTEM
- KAYNAKLAR Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.23. MEMELİ SPERMATOGONAL KROMOZOM BOZUKLUĞU TESTİ YÖNTEM
VERİLER Veriler tablo halinde sunulmalıdır. Her bir metafaz için SCE’lerin sayısı ve yine her bir metafaz için kromozom başına SCE’lerin sayısı tüm muamele edilen ve kontrol kültürleri için ayrı ayrı listelenmelidir. Veriler uygun istatistiksel yöntemler kullanılarak değerlendirilmelidir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (D).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.20. DROSOPHILA MELANOGASTER’DACİNSİYETE BAĞLI ÇEKİNİK ÖLÜMCÜL TEST
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (A).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Yok
Drosophila melanogaster kullanılarak yapılan cinsiyete bağlı çekinik öldürücü (Sex-Linked Recessive Lethal, SLRL) test, böceğin eşey bölgesindeki mutasyonlardan hem noktasal mutasyonları hem de küçük silinmeleri tayin eder. Bu test X-kromozomu üzerindeki 800 bölgede tarama yapabilen ileri bir mutasyon yöntemidir; Bu sayı X-kromozal bölgelerin %80’ine tekabul eder ve X-kromozomu yaklaşık olarak tüm haploid genomun ellide birini gösterir. Drosophila melanogaster’in X-kromozomundaki mutasyonlar, mutant (genleri değişmiş) geni taşıyan erkeklerde fenotipik olarak ifade edilir. Hemizigot şartlarda mutasyonun ölümcül olduğu, heterozigot bir dişiden normalde üretilen iki sınıf yavrudan bir sınıfın erkek yavrulardan oluşmamasından anlaşılır. SLRL testi bu olguların, özellikle de işaretlenmiş ve düzenlenmiş kromozomlar açısından, avantaj taşır.
Yok.
Hazırlıklar Irklar İyi tanımlanmış yabanıltip soyların erkekleri ve Muller-5 soy dişileri kullanılabilir. Ayrıca çoklu değiştirilmiş X-kromozomuyla birlikte uygun olarak işaretlenmiş dişi ırklar da kullanılabilir. Test maddesi Test maddeleri suda çözünür olmalıdır. Suda çözünmeyen maddeler uygun taşıyıcılarda çözünebilir (örneğin etanol ve Tween-60 veya 80 karışımı) veya süspansiyon olarak kalabilir, daha sonra uygulamadan önce su veya tuzlu su içinde seyreltilirler. Dimetilsulfoksit in (DMSO) taşıyıcı olarak kullanımından kaçınılmalıdır. Hayvanların sayısı Test önceden belirlenen duyarlılık ve güce göre tasarlanmalıdır. Uygun kontrolde gözlenen kendiliğinden olan mutant tekrarlanma frekansı analiz edilmesi gereken muamele edilmiş kromozomların sayısını güçlü bir şekilde etkileyecektir. Yönetim planı Maruz kalma, enjeksiyon veya gaz ve buharlarla veya oral maruz kalma ile gerçekleşir. Test maddesinin verilmesi şeker çözeltisi içinde yapılabilir. Gerekli olduğunda, maddeler % 0,7’lik NaCl çözeltisinde çözünebilirler ve göğüs veya karın içine enjekte edilirler. Negatif ve pozitif kontrollerin kullanılması Negatif (taşıyıcı) ve pozitif kontroller içermelidir. Ancak, uygun laboratuvar geçmiş kontrol verileri mevcutsa, eş zamanlı kontrollere gerek yoktur. Maruz kalma seviyeleri Üç maruz kalma seviyesi kullanılmalıdır. Ön değerlendirme için, test maddesinin bir maruz kalma seviyesi kullanılabilir, bu maruz kalma seviyesi ya en yüksek tolere edilebilir konsantrasyon ya da bazı toksisite belirtilerini ortaya çıkaran bir değerdir. En yüksek uygulaması mümkün olan konsantrasyona, toksik olmayan maddelerin maruz kalması için kullanılmalıdır. İşlem Yabani tip erkekler (üç veya beş günlük) test maddesiyle muamele görür ve Muller-5 ırkı veya başka uygun bir şekilde işaretlenmiş bakir dişilerle (çoklu değiştirilmiş X-kromozomlarıyla) ayrı ayrı çiftleştirilirler. Dişiler tüm üreme hücresi döngüsünü kapsamak için, yeni bakir olanlarla her iki-üç günde bir değiştirilirler. Bu dişilerin yavruları muamele zamanında olgun sperme orta ya da geç aşamada spermatitlere, erken spermatitlere, spermatozitlere ve spermatagonlara ilişkin öldürücü etkiler için sayılırlar. Yukarıdaki çaprazların heterozigot F1 dişilerinin kardeşleriyle ayrı ayrı (örneğin şişe başına bir dişi) çiftleşmesine izin verilir. F2 jenerasyonunda, her kültür mutasyona uğramamış yabani tip erkeklerin yokluğu için sayılırlar. Bir kültür ebeveyne ait X-kromozomlarında öldürücü özellik taşıyan F1 dişilerinden ortaya çıkıyor görünüyorsa (örneğin muamele edilmiş kromozomlu erkekler gözlenmez) bu dişinin aynı genotipteki kız çocukları öldürücülüğün bir sonraki nesilde tekrarlayıp tekrarlamayacağının anlaşılması için test edilmelidir.
Veriler test edilen X-kromozomlarının sayısını, kısır erkek sayısını ve her maruz kalma konsantrasyondaki öldürücü kromozom sayısıyla ve her bir çiftleşme süresindeki her bir muamele edilen erkek için öldürücü kromozom sayısını gösterecek şekilde, tablo haline getirilmelidir. Erkek başına düşen farklı büyüklükteki kümelerin sayıları rapor edilmelidir. Bu sonuçlar ayrı bir deneyle doğrulanmalıdır. Cinsiyete bağlı çekinik öldürücü testlerin değerlendirilmesinde uygun istatistiksel yöntemler kullanılmalıdır.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (D).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.21. IN VITRO MEMELİ HÜCRESİ DÖNÜŞÜM TESTLERİ
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (A).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Yok
Memeli hücre kültür sistemleri, in vivo kötü huylu dönüşümlere yol açan kimyasal maddelerin sebep olduğu fenotipik değişiklikleri in vitro belirlemek için kullanılabilir. Yaygın olarak kullanılan hücrelere C3H10T1/2, 3T3, SHE, Fischer sıçanı dahildir ve testler hücre morfolojisindeki değişikliklere dayanır veya yarı-katı kompleks şeker jelindeki bağlanma yeri değişikliklerine odaklanır. Kanserojen kimyasallara maruz kalmayı takiben hücrelerdeki diğer morfolojik ve fizyolojik değişiklikleri tayin eden daha az kullanılan sistemler de mevcuttur. İn vitro test sonlanma noktalarının hiçbirinin kanserle mekanistik bir bağlantısı kurulmamıştır. Bazı test sistemleri tümör oluşumu hızlandırıcılarını belirleyecek yetkinliktedir. Sitotoksisite test maddesinin koloni oluşturma becerisi veya kültürlerin büyüme hızları üzerindeki etkisi ölçülerek belirlenebilir. Toksikoloji açısından anlamlı olan test kimyasalına maruz kalma sonucu hücrede ortaya çıkan zehirliliğin ölçülmesi dönüşümlerin hesaplanmasında kullanılamaz çünkü tüm denemelerdeki frekanslardan bazıları uzun süreli inkübasyon ve/veya yeniden kaplamaları gerektirebilir.
Yok.
Hazırlıklar Hücreler Çeşitli hücre dizileri veya primer hücreler kullanılan dönüşüm testine bağlı olarak elde edilir. Araştırmacı testte uygulama yapılan hücrelerin, bilinen kanserojenlere maruz kalmasından sonra uygun fenotipik değişikliği gösterdiğine emin olunmalı ve test araştırmacısının laboratuarı da geçerlilik (validity) ve güvenilirlik konusunda kanıtlanmış ve belgelendirilmiş olmalıdır. Ortam
Test maddesi Test maddeleri kültür ortamında hazırlanabilir veya hücrelere uygulanmadan önce uygun taşıyıcı içinde çözünebilir veya askıda kalabilir. Kültür sistemindeki taşıyıcının son konsantrasyonu hücrenin yaşayabilirliği veya büyüme hızını veya dönüşüm sıklığını etkilememelidir. Metabolik Aktivasyon Hücreler uygun dış kaynaklı metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda test kimyasallarına maruz bırakılmalıdır. Alternatif olarak, özgün metabolik aktivasyonların kullanıldığı hücre türleri için, aktivitenin doğası test edilen kimyasalın sınıfına uygun olmalıdır. Test koşulları Negatif ve pozitif kontrollerin kullanımı Hem doğrudan bileşik gibi davranan hem de metabolik aktivasyon gerektiren bileşik kullanılan pozitif kontroller her bir deneyde de yer almalıdır; taşıyıcı kontrol grubu da ayrıca kullanılmalıdır Aşağıdakiler pozitif kontrol olarak kullanılabilecek olan madde örnekleridir: -doğrudan bileşik gibi davranan -etilmetansülfonat, -ß-propiyolakton, -metabolik aktivasyon gerektiren bileşikler: -2-asetilaminofloren, -4-dimetilaminoazobenzen, -7,12-dimetilbenzantrasen. Uygun olduğunda, test edilen bileşikle aynı kimyasal sınıfta olan kimyasala ait ilave bir pozitif kontrol yapılmalıdır. Maruz kalma konsantrasyonları Test maddesinin çeşitli konsantrasyonları kullanılmalıdır. Bu konsantrasyonlar, konsantrasyona bağlı toksik etki meydana getirmeli, en yüksek konsantrasyonla düşük seviyede sağkalım, en düşük konsantrasyon seviyesinde de neredeyse negatif kontroldaki ile aynı sayıda sağkalım sağlamalıdır. Nispeten suda çözünmeyen maddeler uygun işlemlerle çözünürlük sınırına kadar test edilmelidirler. Suda serbestçe çözünen toksik olmayan maddeler için, duruma göre bakılarak test maddesinin bir üst konsantrasyonu belirlenmelidir. İşlem Hücreler, kullanılan test sistemine bağlı olarak uygun bir süre maruz bırakılmalıdırlar, maruz kalma uzamışsa bu durum ortam değişikliğiyle birlikte dozun (ve eğer gerekliyse, yeni metabolik aktivasyon karışımının) yeniden verilmesini gerektirebilir. Yeterli özgün metabolik aktivasyona sahip olmayan hücreler metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda test kimyasallarına maruz bırakılmalıdır. Maruz kalma süresinin sonunda hücreler test maddesinden arındırılırlar ve izlenmekte olan dönüştürülmüş fenotipin görülebileceği bir ortamda kültürlenirler ve dönüşüm sıklığı belirlenir. Tüm sonuçlar bağımsız bir deney sonucuyla doğrulanmalıdır
Veriler tablo halinde sunulmalıdır ancak kullanılan yönteme bağlı olarak, örneğin plaka sayımı, pozitif plakalar veya dönüştürülen hücre sayısı gibi çeşitli formlar alabilirler. Uygun yerlerde hayatta kalma kontrol düzeylerinin yüzdesi olarak ve dönüşüm sıklığı da hayatta kalan sayısı başına dönüştürülen sayısı olarak ifade edilmelidir. Veriler uygun istatistiksel yöntemler kullanılarak değerlendirilmelidir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (D).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.22. KEMİRGENLERDE BASKIN ÖLÜMCÜL TEST
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Yok
Baskın öldürücü etkiler embriyonik veya fetal (cenin ile ilgili) ölümlere neden olurlar. Bir kimyasal maddeye maruz kalma sonucu baskın ölümlerin başlaması, testteki hayvan türünün oluşum aşamasındaki dokularını etkilediğini gösterir. Baskın ölümlerin kromozom hasarlarına (kromozomlardaki yapısal veya sayısal anomaliler) bağlı olarak meydan geldiği genel kabul görmüştür. Dişiler de muamele edilmişse embriyonik ölüm de, toksik etkilerin sonucu olabilir. Genellikle erkek hayvanlar test bileşiğine maruz bırakılırlar ve muamele edilmemiş bakir dişilerle çiftleştirilirler. Çeşitli üreme hücresi aşamaları sıralı çiftleşme aralıkları kullanılarak ayrı ayrı test edilebilir. Muamele grubundaki dişi başına ölü implantların artışı arda kalan kontrol grubundaki dişi başına ölü implantların artışı implatasyon sonrası kaybı yansıtır. implantasyon öncesi kayıp corpora lutea (sarı özdek) sayımlarına dayanarak veya muamele ve kontrol gruplarındaki dişi başına düşen toplam implantlar karşılaştırılarak tahmin edilebilir. Toplam baskın öldürücü etki, implantasyon öncesi ve sonrası kaybın toplamıdır. Toplam baskın öldürücü etkinin hesaplanması test grubundaki dişi başına düşen canlı implantların kontrol grubundakilerle karşılaştırılmasına dayanır. implant sayısında belli aralıkla azalma olması hücre öldürülmesinin (örneğin, spermatazoitlerin ve/veya spermatogonların) bir sonucu olabilir.
Yok.
Hazırlıklar Mümkün olduğunda, test maddeleri izotonik (ozmotik basınçları eşit olan) tuz çözeltisi içinde çözünmeli veya süspansiyon olarak kalmalıdır. Suda çözünmeyen kimyasallar uygun taşıyıcılar içinde çözünür veya süspansiyon olarak kalırlar. Kullanılan taşıyıcı, test kimyasalıyla etkileşmemeli ve toksik etki meydana getirmemelidir. Test kimyasalı taze hazırlanmalı ve kullanılmalıdır. Test koşulları Yönetim planı Test bileşiği genellikle yalnızca bir kere uygulanmalıdır. Toksikolojik bilgilere dayanılarak tekrarlı bir muamele planı uygulanabilir. Sıkça kullanılan yönetim planları ağıza yerleştirilen tüp ile yapılan veya periton kesesi içine yapılan enjeksiyondur. Diğer uygulama yolları da uygun olabilir. Deney hayvanları Test türü olarak sıçan veya fareler tavsiye edilir. Sağlıklı, cinsel açıdan olgunlaşmış hayvanlar rastgele muamele grubu olarak ayrılırlar. Sayı ve cinsiyet Değerlendirilmekte olan biyolojik karakterin varyasyonu da dikkate alınarak yeterli sayıda ve test maddesiyle muamele edilmiş erkek kullanılmalıdır. Seçilen sayı, belirleme öncesindeki tayin etme hassasiyetine ve önem derecesine bağlıdır. Örneğin tipik bir testte her bir doz grubundaki erkek sayısı çiftleşme aralığı başına 30 ve 50 dişiyi hamile bırakacak yeterlilikte olmalıdır. Negatif ve pozitif kontrollerin kullanımı Genelde eş zamanlı pozitif ve negatif (taşıyıcı) kontroller her deneyde olmalıdır. Aynı laboratuvarda yakın zamanda yürütülen deneylerden kabul edilebilir pozitif kontrol sonuçları elde edildiğinde bu sonuçlar eş zamanlı bir pozitif sonuç yerine kullanılabilir. Pozitif kontrol maddeleri testin hassasiyetini göstermek için uygun düşük dozlarda kullanılmalıdır. (örneğin MMS, Periton kesesi içinde bulunacak şekilde (intraperitonal olarak), 10 mg/kilogram) Doz seviyeleri Normalde üç doz kullanılmalıdır. Yüksek doz toksisite belirtileri meydana getirir veya muamele edilen hayvanlarda doğurganlık azalır. Belli durumlarda, tek bir yüksek doz düzeyi yeterli olabilir. Sınır testi Toksik olmayan maddeler, 5 g/kilogram dozda tek bir uygulamayla veya 1 g/kilogram/gün dozda tekrarlı uygulamalarla test edilmelidir. Yöntem Çeşitli muamele seçenekleri mevcuttur. Test maddesinin tekli uygulanması yaygın olarak kullanılır. Diğer muamele planları da kullanılabilir. Her bir erkek, muameleden sonra uygun aralıklarla bir veya iki muamele edilmemiş bakir dişiyle ayrı ayrı çiftleştirilir. Dişiler en az bir oestrous (insan dışındaki memelilerde periyodik olarak gözlenen yüksek seks aktivitesi) döngüsü boyunca, vajinada sperm varlığıyla veya vajinal tampon varlığıyla anlaşılan çiftleşme gerçekleşinceye kadar erkeklerle birlikte bırakılmalıdır. Muameleyi takip eden çiftleşme sayısı uygulama planı yapılarak sağlanır ve tüm üreme hücresi aşamalarının muamele sonrasında örnekleneceği kesinleştirilmelidir. Dişiler hamileliklerinin ikinci yarısında gözden çıkartılırlar ve rahme ait içeriklerle ölü ve canlı implantları belirlemek için incelenir. corpora lutea (sarı özdek) sayısını belirlemek için yumurtalıklar incelenebilir.
Veriler, erkek sayısını, hamile dişi sayısını, hamile olmayan dişi sayısını gösterecek şekilde tablo haline getirilmelidir. Her bir erkek ve dişinin kimliğini kapsayan her bir çiftleşmenin sonucu ayrı ayrı rapor edilmelidir. Her bir dişi için çiftleşme haftası, erkek tarafından alınan doz, canlı ve ölü implantların frekansı kaydedilmelidir. Toplam baskın öldürücü etkinin hesaplanması test grubundaki dişi başına düşen canlı implantların kontrol grubundaki dişi başına düşen canlı implantlarla karşılaştırılmasına dayanır. Muamele grubundaki ölü implantların canlı implantlarla oranı, kontrol grubundaki oranla karşılaştırılarak analiz edilir ve implantasyon sonrası kayıp tayin edilir. Veriler erken ve geç ölümler olarak kaydedilirse, tablolar bunu netleştirmelidir. İmplantasyon öncesi kayıp tahmin edilebiliyorsa, rapor edilmelidir. İmplantasyon öncesi kayıp corpora lutea sayısı ve implantların sayısı arasındaki uyumsuzluk veya uterus başına düşen ortalama implant sayısının kontrol çiftleşmelerine kıyasla azalması olarak hesaplanabilir. Veriler uygun istatiksel yöntem kullanılarak değerlendirilmelidir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (D).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.23. MEMELİ SPERMATOGONAL KROMOZOM BOZUKLUĞU TESTİ
Bu yöntem OECD TG 483, Memeli Spermatogonal Kromozom Bozukluğu (Aberration) Testi’ne (1997) eşdeğerdir.
İn-vivo memeli spermatogonal kromozom bozunma testinin amacı, memeli spermatogonal hücrelerinde yapısal kromozom bozukluklarına neden olan maddeleri belirlemektir (1)(2)(3)(4)(5). Yapısal bozukluklar kromozom veya kromatid olarak iki tip olabilir Kimyasal mutajenlerin (bozukluğa veya mutasyona neden olanlar) çoğuyla kromatid tipi bozunmaları eyleme geçirir, ancak kromozom tipi bozukluklarda da ayrıca meydana gelir. Bu yöntem sayısal kromozom bozuklukları için tasarlanmamıştır ve bu amaç için rutin olarak kullanılmaz. Kromozom mutasyonları ve ilgili olaylar insandaki pek çok genetik (kalıtımsal) hastalığın nedeni olabilir. Bu testin spermatogonal eşey hücrelerindeki kromozom olaylarını ölçmesi ve bu yüzden eşey hücrelerindeki kalıtsal mutasyonların başlangıcını tahmin etmesi beklenir. Bu testte rutin olarak sıçanlar kullanılır. Bu in vivo (canlı organizmadaki) hücre genetiği ile ilgili test, spermatogonal mitozlardaki kromozom bozukluklarını tespit eder. Diğer hedef hücreler bu yöntemin konusu değildir. Spermatogonal hücrelerdeki kromatid-tipi bozuklukları belirlemek için, ilk mitotik hücre bölünmesini takiben, bu lezyonlar bir sonraki hücre bölünmesinde kaybolmadan yapılan muamele incelenmelidir. Muamele edilen hücreler spermatozit olduğunda diyakinezi-metafaz I’deki kromozom tipi bozukluklar için, muamele edilmiş spermatogonal kök hücrelerden ilave bilgi mayotik kromozom analizleriyle sağlanabilir. Bu in vivo testi somatik hücre (eşey hücreleri dışında kalan yapısal hücreler) mutajenlerinin eşey hücrelerinde de aktif olup olmadığını araştırır. İlaveten spermatogonal testi, mutajenite zararlarının değerlendirilmesiyle ilgilidir ve in vivo metabolizma, farmakokinetik ve DNA-onarım işlemi gibi etkenlerin göz önünde bulundurulmasını sağlar. Testislerde çok sayıda spermatogon nesilleri bulunur ve bunlar kimyasal muamelesine duyarlıdır. Bu yüzden, tespit edilen bozukluklar, çok sayıda baskın farklılaşmış spermatogonal hücrelerle birlikte, muamele edilmiş spermatogonal hücre populasyonlarının (toplam sayılarının) toplam cevabını yansıtır. Testisteki pozisyonlarına bağlı olarak, farklı spermatogon nesilleri fiziksel ve fizyolojik Sertoli hücre engeli ve kan-testis engeli nedeniyle genel dolaşıma girmeyebilirler. Test maddesinin veya reaktif metabolitinin hedef dokuya ulaşamadığına dair kanıt mevcutsa, bu testi kullanmak uygun değildir. Ayrıca Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Kromatid-tipi bozukluk: Yapısal kromozom hasarı tekli kromatid kırılması veya kromatidler arası kırılma ve birleşme olarak ifade edilir. Kromozom-tipi bozukluk: Yapısal kromozom hasarı, özdeş yerlerdeki her iki kromatidin kırılması veya kırılması ve birleşmesi olarak ifade edilir. Boşluk (gap): bir kromatidin genişliğinden daha küçük genişlikte, minimum yanlış dizilimli kromatid akromatik (renksiz) bir doku bozukluğudur. Sayısal bozukluk: kullanılan hücrelerin normal kromozom sayısındaki değişiklikler. Poliploidi: haploid kromozom sayısının (n) diploid sayı haricindeki bir sayıyla çarpımı (örneğin, 3n, 4n, ve diğerleri). Yapısal bozukluk: Kromozom yapısında, hücre bölünmesinin metafaz aşamasının mikroskobik incelemeyle saptanabilen değişikliktir; silinmeler, ara ve iç değişiklikler olarak gözlenir.
Hayvanlar test maddesine uygun bir yolla maruz kalırlar ve muamele edildikten sonra uygun zamanlarda gözden çıkarılırlar. Gözden çıkarılma öncesinde, hayvanlar metafaz-durdurucu maddelerle (örneğin, kolşisin (colchicine) veya kolsemid (colcemid®)) muamele edilir. Daha sonra üreme hücrelerinden kromozom karışımları yapılır ve boyanır, kromozom bozuklukları için metafaz hücreleri analiz edilir.
Her ne kadar uygun herhangi bir memeli türünün erkekleri kullanılabilirse de fareler ve hamsterlar yaygın olarak kullanılır. Sağlıklı, genç yetişkin hayvanların yaygın olarak kullanılan laboratuvar suşları kullanılmalıdır. Deneyin başında, hayvanlardaki ağırlık değişkenliği aralığı her iki cinsiyet için de, uygun ortalama değerin % 20’sini geçmemelidir.
Genel koşullar, Genel Giriş Kısım B’de belirtildiği şekilde uygulanır, nemlilik % 50–60 arasında olmalıdır.
Sağlıklı genç yetişkin hayvanlar, rastgele kontrol ve muamele gruplarına ayrılırlar. Kafesler yerleştirilmelerinden kaynaklanacak olası etkileri en az indirecek şekilde yerleştirilirler. Hayvanlar ayrı ayrı kimliklendirilirler. Hayvanlar çalışma başlamadan en az beş gün önce laboratuvar koşullarına alıştırılırlar.
Uygunsa, hayvanlara dozu uygulamadan önce, katı test maddeleri uygun çözücüler veya taşıyıcılar içinde çözünmeli veya dağıtılmalı ve seyreltilmelidir. Sıvı test maddeleri dozu uygulamadan önce test sistemine doğrudan eklenebilirler ve/veya seyreltilebilirler. Kararlılığıyla ilgili veriler saklanmasının kabul edilebilirliğini göstermedikçe test maddesinin taze hazırlanmış olanları uygulanmalıdır.
Çözücü/taşıyıcı kullanılan doz seviyelerinde toksik etki meydana getirmemelidir ve test maddesinin kimyasal reaksiyona gireceğinden şüphe duyulmamalıdır. Çok iyi bilinen çözücüler/taşıyıcılar dışındakiler kullanılırsa, içerikleri uyumlu olduklarını gösteren verilerle desteklenmelidir. Uygun olan her yerde sulu çözelti/taşıyıcının kullanılmasının düşünülmesi tavsiye edilir.
Eş zamanlı pozitif ve negatif (çözücü veya taşıyıcı) kontroller, her bir deneyde yer almalıdır. Test maddesiyle muamele haricinde, kontrol grubundaki hayvanlar muamele grubundaki hayvanlarla eşit şartlarda tutulmalıdırlar. Pozitif kontroller arka planda tespit edilebilir artışlar göstermesi beklenen maruz kalma seviyelerinde spermatogonal hücrelerde in vivo yapısal kromozom bozuklukları meydana getirmelidir. Pozitif kontrol dozları etkilerin açıkça görülebileceği şekilde seçilebilir fakat işaretli lamların okuyucu tarafından hemen anlaşılabilmesini sağlamaz. Test maddesinin uygulandığından daha farklı şekilde uygulanan pozitif kontrol kabul edilebilirdir ve sadece tek seferde örnekleme yapılır. Ek olarak, uygun olduğunda, kimyasal sınıfla ilişkili pozitif kontrol kimyasallarının üzerinde durulabilir. Pozitif kontrol maddelerin örnekleri, tablodakileri içerir:
Tek başına çözücüyle veya sadece taşıyıcıyla muamele edilmiş olan, aksi takdirde test gruplarıyla aynı şekilde muamele edilen negatif kontroller hayvanlar arasındaki değişkenlikler kabul edilebilir değilse ve geçmişten gelen kontrol verilerinde bozukluk bulunan kromozomların frekansı mevcut değilse, her örnekleme zamanında yer almalıdır. İlaveten, seçilen çözücü/taşıyıcı tarafından harekete geçirilen hiç bir zararlı veya mitojenik etki olmadığını gösteren tarihsel veya yayınlanmış kontrol verileri yoksa muamele edilmemiş kontroller kullanılmalıdır.
Her bir muamele ve kontrol grubu analiz edilebilecek en az beş erkek hayvandan oluşmalıdır.
Test maddeleri tercihen bir veya iki seferde uygulanır (örneğin, tek uygulama olarak veya iki uygulama olarak). Fazla hacimli bir maddenin uygulanmasını kolaylaştırmak için test maddesi ayrıca bölünmüş doz, olarak uygulanabilir, örneğin aynı gündeki iki uygulama birkaç saati geçmeyecek şekilde ayrılabilir, olarak uygulanabilir. Diğer doz şekilleri bilimsel olarak doğruluğu gösterilmelidir. En yüksek doz grubunda uygulamadan sonra iki örnekleme zamanı kullanılır. Hücre döngüsü kinetiği test maddesinden etkilenebileceğinden bir erken ve bir de geç örnek alım zamanları kullanılır, bunlarda uygulamadan yaklaşık 24 ve 48 saat sonradır. En yüksek doz dışındaki dozlar için örnekleme zamanı olarak etkilerin belirlenmesi için daha uygun bir örnek alma zamanı bilinmedikçe uygulamadan sonraki 24 saat veya 1.5 hücre döngüsünden sonra alınmalıdır(6). İlaveten, diğer örnek alma zamanları da kullanılabilir. Örneğin kromozom izolasyonunu harekete geçiren veya S-bağımsız etkileri gösteren kimyasallar söz konusu olduğunda daha erken örnek alma zamanları uygun olabilir (1). Tekrarlı uygulama planının uygunluğunun vaka vaka tanımlanması gerekir. Tekrarlı bir uygulamayı takiben hayvanlar son uygulamadan 24 saat (1,5 hücre döngüsü uzunluğu) sonra gözden çıkartılırlar. Uygun yerlerde ilave örnek alma zamanları da kullanılabilir. Gözden çıkarılmadan önce, hayvanlara uygun dozda metafaz durdurucu madde (örneğin; Colcemid veya colchicine) deri içine olacak şekilde enjekte edilir. Daha sonra uygun aralıklarla hayvanlardan örnek alınır. Fareler için bu aralık yaklaşık 3-5 saat; Çin hamsterları için bu aralık yaklaşık 4-5 saattir.
Elde hiç uygun veri bulunmadığı için aralık bulma çalışması yürütülürse, ana çalışmada kullanılanla aynı laboratuvar, aynı ırk, cinsiyet ve muamele kürü kullanılarak yürütülmelidir (7). Eğer toksisite varsa, ilk örnek alma zamanı için üç doz kullanılır. Bu doz seviyeleri maksimumla çok az toksisitenin olduğu veya hiç toksisitenin olmadığı aralığın içinde olmalıdır. Daha sonraki örnek alma zamanında en yüksek dozun kullanılması gerekir. En yüksek doz, toksisite belirtilerinin oluşmaya başladığı doz olarak tanımlanır ve daha yüksek doz seviyelerinin, aynı doz uygulama kürüne dayanarak, ölüme neden olması beklenir. Düşük seviyeli toksik olmayan dozlarda özel biyolojik aktivite gösteren (hormonlar ve mitojenler gibi) maddeler doz belirleme kriterlerinde istisna olabilir ve duruma göre değerlendirilmelidir. En yüksek doz ayrıca spermatogonal hücrelerde (örneğin; spermatogonal mitozların birinci ve ikinci mayotik metafaza oranında düşme, bu düşüş % 50’yi geçmemelidir) bazı toksisite belirtileri meydana getiren doz olarak da tanımlanabilir.
En az 2000 mg/kg vücut ağırlığı doz seviyeli bir sınır testi tek doz veya aynı günde iki muamele olarak uygulandığında gözlenebilen herhangi bir toksik etki meydana getirmiyorsa ve yapısal olarak benzer maddelerle ilgili genetik yapı üzerinde bir toksisite beklenmiyorsa, bu durumda üç doz kullanılarak yapılacak kapsamlı bir çalışmaya gerek olmayabilir. Beklenen insan maruz kalımı, sınır testinde daha fazla doz kullanılması gerektiğine işaret edebilir.
Test maddesi genellikle gavaj yöntemi kullanılarak sondayla veya uygun bir boru sonda kullanılarak veya deri içine enjeksiyonla uygulanır. Diğer maruz kalma yolları gerekçelendirildiklerinde kabul edilir olabilir. Sonda veya enjeksiyonla tek seferde uygulanabilecek olan maksimum sıvı hacmi test hayvanının büyüklüğüne bağlıdır. Hacim 2 ml/100g vücut ağırlığını geçmemelidir. Bu değerden daha yüksek hacimler gerekçelendirilmelidir. Normalde daha yüksek konsantrasyonlarda daha kötü etkiler meydana getiren tahriş edici ve aşındırıcı maddeler haricindeki maddeler için konsantrasyonun tüm doz seviyelerinde sabit olacak şekilde ayarlanmasıyla, test hacmindeki değişkenler en aza indirilir.
Gözden çıkarılmadan hemen sonra, bir veya her iki testisten de elde edilen hücre süspansiyonları hipotonik çözeltiye maruz bırakılırlar ve sabitlenirler. Daha sonra hücreler lamlara yayılır ve boyanırlar.
Her bir test hayvanı için en az 100 iyi yayılmış metafaz analiz edilmelidir (örneğin; grup başına en az 500 metafaz). Bu sayı daha yüksek sayıda bozukluk gözlenirse düşürülebilir. Pozitif ve negatif kontrolleri de içeren tüm lamlar mikroskop altında incelenmeden önce ayrı ayrı işaretlenmelidir. Sabitleme işlemi genellikle kromozom kaybıyla birlikte metafazların bir kısmının kırılması ile sonuçlanır, sayılan hücreler 2n ± 2’ye eşit sayıda sentromer içermelidir.
|