Imunofenotipare limfocitara-sindrom limfoproliferativ Informatii generale

Neoplaziile limfoide cu celula T si NK matura

IFCF poate contribui la diagnosticul si clasificarea neoplaziilor limfoide cu celula T si NK matura, insa adesea celulele T sau NK anormale fenotipic sunt mai dificil de identificat in comparatie cu celulele B mature anormale. Pe de alta parte clasificarea neoplaziilor cu celula T si NK este mai putin bine stabilita decat cea a neoplaziilor cu celula B si multe neoplazii raman in categoria limfomului cu celula T periferica, nespecificat (PTCL,U). Clasificarea conform schemei curente nu urmeaza un algoritm simplu si necesita adesea asimilarea de informatii diverse, incluzand studii morfologice, imunohistochimice, citometrie in flux, citogenetica, FISH si teste moleculare².

Neoplaziile cu celula T/NK matura (periferica) sunt divizate in leucemice, cutanate si extraganglionare si cele cu origine ganglionara. Majoritatea limfoamelor cu celula T periferica (PTCL – PTCL,U, limfomul T angioimunoblastic, limfomul cu celula mare anaplazica) sunt malignitati posttimice, care exprima TCR α/β, derivate aparent din sistemul imun adaptativ (antigen specific bazat pe receptor). Ele apar in general in organele limfoide periferice din celule T naive, efectoare (reglatoare CD4⁺ si citotoxice CD8⁺) sau de memorie. Limfoamele cu celula NK si un numar mic de PTCL ce pot fi derivate extratimic sunt legate de sistemul imun innascut (nerestrictionat MHC). PTCL din acest grup (limfomul cu celula T hepatosplenic, limfomul cu celula T subcutanat panniculitis-like, limfomul cu celula T tip enteropatie) tind sa apara in localizari mucoase si cutanate, adesea exprima TCR γ/δ, antigene asociate celulei NK si proteine asociate granulelor citotoxice¹¹.

Neoplasmele cu celula T si NK matura pot fi identificate prin IFCF pe baza detectiei expresiei antigenice aberante, spre deosebire de celulele B neexistand un marker surogat de clonalitate la fel de fidel ca expresia kappa si lambda. In plus expresia antigenica aberanta trebuie distinsa de variatiile fenotipice normale observate intre multiplele subseturi de celule nonneoplazice.

Ocazional expresia antigenica aberanta poate consta in lipsa completa a colorarii pentru unul sau mai multe antigene pan-celula T, CD5 si CD7 fiind antigenele cel mai frecvent pierdute. Celulele neoplazice CD7^- trebuie distinse de o populatie mica de celule T normale CD7^- din piele si sange care pot creste in dermatoze benigne si alte conditii reactive.

Mai frecvent neoplaziile T si NK demonstreaza o alterare mai subtila a colorarii pentru antigene decat lipsa completa a acestora, cele mai frecvente fiind colorarea celulelor T mai intensa sau mai slaba pentru CD3 sau CD5, colorarea mai slaba a celulelor NK pentru CD2, CD7, CD56 si CD57, o expresie intensa mai omogena a CD8 si CD16 de catre celulele NK.

De asemenea populatiile de celule T si NK anormale pot fi recunoscute dupa expresia de antigene care nu sunt in mod normal exprimate in aceste linii, spre exemplu antigenele mieloide CD15, CD13 si CD33 au fost descrise in unele neoplazii cu celula T matura, putand duce la confuzia cu leucemia acuta mieloida; celulele NK pot achizitiona CD5; expresia antigenului celulei B CD20 a fost descrisa intr-un procent mic de neoplazii cu celula T si poate fi de asemenea detectata intr-un subset mic de celule T normale.

Evaluarea prin IFCF a expresiei TCR V-β permite identificarea de populatii restrictionate de celule T, dar, spre deosebire de testele PCR pentru rearanjamentele genei TCR care pot fi efectuate atat pe specimene proaspete cat si inghetate si fixate, acest test este laborios si necesita analizarea de preferinta in 24 ore de la recoltare.

Celulele NK nu prezinta expresia TCR, pentru demonstrarea clonalitatii celulelor NK fiind dezvoltata analiza prin citometrie in flux a expresiei receptoruui NK (NKR), incluzand receptorii pentru Ig ai celulelor killer (KIR) si complexul CD94/NKG2, care pot fi de asemenea aplicate celulelor T citotoxice de memorie din leucemia cu limfocite mari granulare (LGL) cu celule T.

Informatiile imunofenotipice formeaza o parte importanta a clasificarii neoplasmelor limfoide cu celula T si NK matura, acestea putand fi efectuate fie prin citometrie in flux, fie prin imunohistochimie (IHC), selectarea tehnicii optime depinzand de aspectul care este cercetat. Studiile de IFCF sunt superioare IHC in distinctia intre celulele T si NK.  Anticorpii utilizati de IFCF detecteaza de obicei intregul complex TCR-CD3, prezent pe suprafata celulelor T si absent de pe suprafata celulelor NK, spre deosebire de IHC care detecteaza numai componenta epsilon a CD3, neputand distinge intre celulele T si NK. Celulele CD3^- trebuie evaluate in continuare pentru diferentierea intre celulele NK, celulele T anormale cu lipsa aberanta a CD3 si celulele T imature. Studiile moleculare care demonstreaza rearanjamentul clonal al genei TCR pot de asemenea confirma linia celulara T.

IFCF permite determinarea expresiei  ambelor forme, α/β si γ/δ, ale TCR, spre deosebire de IHC care detecteaza numai forma α/β a receptorului, aceasta distinctie fiind importanta deoarece limfoamele cu celela T γ/δ sunt mai agresive.

Expresia CD4 si CD8 poate fi stabilita atat prin IFCF cat si prin IHC, IFCF prezentand avantajul identificarii celulelor neoplazice pe baza expresiei aberante a altor antigene si apoi izolarea lor pentru caracterizarea in continuare a acestora.

Atat IHC cat si IFCF pot fi utilizate pentru identificarea diferentierii NK prin detectia CD56 si CD57, IFCF fiind considerata o tehnica mai sensibila. In plus IFCF poate detecta CD16 si ar trebui utilizati mai degraba anticorpii pentru detectia izoformei CD16A decat a izoformei 16B asociata granulocitelor.

Coloratii pentru proteinele asociate granulelor citotoxice TIA-1, care identifica majoritatea celulelor T citotoxice, si granzima B sau perforina, care indica un fenotip citotoxic activat, pot fi efectuate atat prin IFCF, cat si prin IHC. De asemenea coloratii pentru CD30 si proteina Alk-1 asociate cu limfomul cu celula mare anaplazica (ALCL) sunt mai frecvent efectuate prin IHC, dar sunt disponibile si prin IFCF.

CD103, exprimat de un subset de celule T intramucoase normale si in limfomul cu celula T asociat enteropatiei (EATCL), este detectabil prin IFCF².

Neoplaziile cu ceula T matura

Expresia CD4 si CD8 poate fi utilizata pentru formularea unei liste de posibilitati diagnostice si determinarea informatiilor necesare pentru subclasificarea acestora.

▪ Neoplaziile CD4⁺/CD8^- includ sindromul Sézary/limfomul cu celula T cutanat (CTCL); leucemia prolimfocitara cu celula T (T-PLL); leucemia/limfomul cu celula T al adultului (ATLL); ALCL; limfomul cu celula T angioimunoblastic (AITCL); PTCL, U; rar LGL.

In primul rand vor fi luate in considerare bolile care afecteaza primar sangele, incluzand sindromul Sézary/CTCL, ATLL si T-PLL².

• 
  Sindromul Sézary/CTCL prezinta de obicei CD4⁺, CD26^-, CD7^-, cu prezenta variabila a colorarii si intensitate variabila a CD25, acest fenotip nefiind specific bolii^2;5.
  
• 
  ATLL are un fenotip similar sindromului Sézary/CTCL CD4⁺, CD7^-, dar cu o colorare intensa mai uniforma pentru markerul de activare CD25 (receptorul IL-2). De asemenea acesti pacienti prezinta integrarea clonala a genomului HTLV-1^{2;5;11 .}
  
• 
  T-PLL este cel mai frecvent CD4⁺ (60%), dar poate fi si CD4⁺, CD8⁺ (25%) si mai rar numai CD8⁺ (15%). Spre deosebire de CTCL si ATLL, T-PLL este de obicei CD7⁺, CD25^-, lipseste pierderea aberanta sau scaderea expresiei altor antigene T si este de obicei negativ pentru antigene asociate NK si pentru proteinele asociate granulelor citotoxice. Diagnosticul trebuie sa ia in considerare excluderea cazurilor rare de LGL CD4⁺. Studiile citogenetice pot confirma diagnosticul, peste 80% din pacientii cu T-PLL avand fie inv(14)(q11;q32), fie t(14;14)(q11;q32), implicand gena TCL1 si locusul TCR α/δ^2,6.
  
• 
  ALCL afecteaza primar ganglionii limfatici si pielea, dar in mod particular poate prezenta afectarea sangelui periferic. Aceasta entitate includea initial toate limfoamele compuse din celule mari care exprima uniform CD30 (Ki-1), insa clasificarea OMS curenta include acele cazuri care exprima un fenotip T sau nul, excluzand limfoamele cu celula mare B CD30⁺. ALCL este de obicei CD4⁺, poate exprima CD56, este cel mai frecvent CD2⁺, dar adesea lipsesc multe alte antigene T, incluzand CD3, CD5 si CD7 si poate exprima antigene mieloide CD13, CD15, CD33, putand duce la confuzia cu leucemia acuta  mieloida. Un diagnostic definitiv poate fi stabilit la pacienti care exprima proteina Alk-1 sau prezinta rearanjamentul genei ALK1 de pe cromozomul 2 la examenul citigenetic clasic sau FISH^2,11. Rearanjamentele ALK sunt prezente la 50-70% din ALCL CD30⁺, t(2;5) aparand la aproximativ trei patrimi din acesti pacienti. Expresia Alk subdivide ALCL in 3 subtipuri clinice: a) ALCL sistemic Alk⁺, b) ALCL sistemic Alk^- si c) ALCL primar cutanat (de asemenea Alk^-). ALCL Alk^- poate fi considerat ca ALCL secundar cand urmeaza mycosis fungoides, papulozei limfomatoide sau bolii Hodgkin⁶.
  

AITCL este de obicei CD4⁺, CD2⁺, CD5⁺, prezinta adesea scaderea expresiei CD7 si uneori a CD3. Un subset de celule neoplazice pot fi CD10⁺, expresia CD10 de catre celulele T putand fi intalnita si in ALL cu precursor de celula T, rar in alte neoplasme cu celula T matura si intr-un subset de celule T normale. Aproape toti pacientii prezinta celule B EBV pozitive, iar aproximativ o treime prezinta de asemenea rearanjamente ale genei Ig^2,6.

Asa cum este de asteptat, fenotipul PTCL,U este heterogen, neoplasmele din aceasta categorie fiind de obicei CD4⁺ si prezentand pierderea aberanta a expresiei CD7 si CD5. Prin definitie, alte entitati specificate trebuie excluse inaintea stabilirii diagnosticului de PTCL,U^2;5. Expresia aberanta a CD20 a fost raportata in PTCL,U, fiind propus ca aceste celule ar putea reprezenta contrapartea neoplazica a subpopulatiei mici de celule T CD20⁺ prezente la persoanele sanatoase⁷.

▪ Cel mai frecvent neoplasm cu celula T CD4^-/CD8⁺ este T-LGL. In sangele periferic alte entitati care trebuie luate in considerare sunt PTCL,U CD8⁺, o mica proportie din PLL si rar CTCL/sindromul Sézary. In splina si alte situsuri extraganglionare diagnosticul diferential include si limfomul cu celula T subcutanat panniculitis-like (SPTCL), rar limfomul cu celula T hepatosplenic (HSTCL) si limfomul cu celula T γ/δ nonhepatosplenic.

• 
  T-LGL prezinta un fenotip CD8⁺, CD3⁺, frecvent cu scaderea intensitatii pentru CD5 si CD7 si expresia de antigene asociate NK, majoritatea pacientilor exprimand CD57, multi CD16 si cativa sunt CD56⁺. In plus, sunt exprimate de obicei proteinele asociate granulelor citotoxice TIA-1, granzima B si perforina. Desi majoritatea pacientilor exprima TCR α/β, au fost raportati si pacienti TCR γ/δ. LGL cu un fenotip NK poate prezenta de asemenea un fenotip CD8⁺, CD4^-, dar lipseste expresia complexului CD3-TCR, astfel neintrand in categoria neoplaziilor limfoide cu celula T matura^2,5,6.
  
• 
  SPTCL este un limfom cu celula T citotoxica rar, de obicei CD8⁺, prezinta expresia uneia sau mai multor proteine asociate granulelor citotoxice, este numai focal pozitiv pentru CD56, este de obicei EBV^- si cel mai frecvent TCR α/β^2,11.
  
• 
  HSTCL este de obicei CD4^-, CD8^-, rar fiind descrisi pacienti CD8⁺, care pot fi dificil de diferentiat de LGL. In comun cu T-LGL, HSTCL afecteaza de obicei splina si poate afecta sangele periferic, este frecvent CD16⁺ si exprima un fenotip citotoxic nonactivat cu prezenta TIA-1 si absenta granzimei B si perforinei, dar difera de majoritatea LGL prin expresia CD56 si lipsa CD57, demonstreaza absenta completa a CD5 mai degraba decat scaderea intensitatii acestuia, cel mai adesea exprima TCR γ/δ, exprima receptori de celula killer Ig-like (KIR), sugerand derivarea din celule T de memorie, si demonstreaza frecvent la examenul citogenetic isocromozomul 7q^2,11.
  
• 
  Cazuri rare de limfom cu celula T γ/δ nonhepatosplenic sunt CD8⁺, dar nu sunt confundate cu LGL deoarece lipseste afectarea splinei si a sangelui periferic².
  
• 
  O proportie mica din CTCL sunt CD8⁺ si trebuie distinse de limfomul cu celula T γ/δ cutanat nonhepatosplenic mai agresiv. CTCL este de obicei negativ pentru proteinele asociate granulelor citotoxice, dar acestea pot fi prezente in transformarea cu celula mare a CTCL. Morfologia si aspectele clinice raman criterii importante de diferentiere².
  

▪ Expresia duala CD4⁺/CD8⁺ este neobisnuita in limfoamele cu celula T matura si trebuie sa duca la considerarea ALL cu precursor de celula T.

Cel mai caracteristic neoplasm limfoid cu celula T matura CD4⁺/CD8⁺ este T-PLL. Acesta exprima CD3 de suprafata si un set complet de antigene T ca CD2, CD5 si CD7, lipsesc markerii de imaturitate CD34, CD10 si TdT si demonstreaza inv(14)(q11;q32) sau t(14;14)(q11;q32).

Rar pacienti cu ATLL, LGL si PTCL,U coexprima CD4 si CD8².

▪ Categoria CD4^-/CD8^- include EATCL, HSTCL, limfomul cu celula T γ/δ nonhepatosplenic, PTCL,U si rar limfomul cu celula NK/T tip nazal.

• 
  EATCL este de obicei negativ pentru CD4, CD8 si CD5, exprima CD3 si CD7, TCR α/β⁺, este pozitiv pentru proteinele asociate granulelor citotoxice TIA-1, granzima B si perforina, este CD103⁺, poate fi CD56⁺ sau CD56^- si poate exprima CD30, iar aceste cazuri trebuie diferentiate de ALCL. Recent EATCL a fost asociat cu achizitii in cromozomul 9q33-34 ce pot ajuta la confirmarea diagnosticului. Limfocitele intramucoase din boala celiaca pot demonstra un fenotip similar ca si rearanjamente clonale al genei TCR, diagnosticul de EATCL necesitand prezenta unui infiltrat distructiv^2,5,11.
  
• 
  Limfomul cu celula T γ/δ nonhepatosplenic demonstreaza un fenotip similar HSTCL, dar de obicei  cu un fenotip citotoxic activat: CD4^-, CD8^-, CD2⁺, CD3⁺, CD5^-, C56⁺, in principal CD57^-, TIA-1⁺, granzima B⁺, perforina⁺. Un numar semnificativ din limfoamele mucoase T γ/δ sunt asociate cu EBV, in timp ce cele cutanate sunt de obicei EBV^{- 2}.
  

Neoplaziile cu celula NK matura includ limfomul extraganglionar cu celula T/NK tip nazal (EN-NK/T-NT), leucemia agresiva cu celula NK si un subset de LGL. Neoplaziile cu celula NK pot fi localizate sau diseminate in momentul examinarii initiale si majoritatea se comporta agresiv, dar este importanta diferentierea LGL cu celula NK care prezinta un curs mai indolent. Spre deosebire de celelalte neoplazii cu celula NK aceasta exprima adesea CD57 alaturi de CD56 si este EBV^-.

• 
  Limfomul extraganglionar cu celula T/NK tip nazal tipic este CD4^-, CD8^-, CD3s^-, CD5^-, CD2⁺, C56⁺, iar spre deosebire de NK normale este de obicei CD7^-, CD16^-. Celulele tumorale exprima lantul ε al CD3 in citoplasma si astfel se coloreaza pozitiv pentru CD3 la IHC. Celulele exprima proteinele asociate granulelor citotoxice TIA-1, granzima B si perforina, iar EBV este prezent in forma epizomala clonala, respectiv EBER (EBV small encoded RNA) pozitiv, ceea ce implica rolul acestui virus in patogeneza. Cazurile de EN-NK/T-NT care se prezinta cu alte localizari decat cea nazala clasica (cel mai frecvent piele, tract gastrointestinal, testicul) , inclusiv ganglionara, dar sunt in rest tipice, sunt incadrate in aceeasi categorie^2;5;7. EN-NK/T-NT aparut la nivelul pielii trebuie diferentiat de mycosis fungoides pleomorfic/transformat, PTCL,U si neoplaziile hematodermice CD4⁺, C56⁺, iar cel aparut la nivel intestinal trebuie diferentiat de EATCL. Un subset bine recunoscut al EN-NK/T-NT are originea intr-o celula T citotoxica NK-like, acestea exprimand CD3 de suprafata si prezinta rearanjamente clonale ale genei TCR. Ramane problematica clasificarea cazurilor atipice in care lipseste expresia CD56 si proteinelor asociate granulelor citotoxice, precum si a formelor nonnazale in care lipseste dovada implicarii EBV, fiind sugerata incadrarea ca limfom cu celula NK neclasificabil. Clasificarea OMS a EN-NK/T-NT solicita atat pozitivitatea EBV, cat si a proteinelor asociate granulelor citotoxice⁷.
  
• 
  Leucemia cu celula NK agresiva si limfomul extraganglionar cu celula T/NK tip nazal au un fenotip similar, diferentierea fiind clinica, limfomul fiind localizat tisular, in timp ce leucemia se prezinta cu afectare medulara, citopenii si prezenta de celule neoplazice circulante, simptome B, hepatosplenomegalie, teste functionale hepatice crescute, insotite uneori de sindrom hemofagocitic².
  

Neoplaziile blastice limfoide includ leucemia acuta si limfomul limfoblastic. ALL si LL au caracteristici comune morfologice, imunofenotipice si citogenetice, distinctia dintre ele fiind considerata de multi arbitrara. Astfel in clasificarea OMS acestea sunt incadrate in categoria leucemie/limfom limfoblastic cu precursor de celula B si T. Desi unii pacienti cu LL  pot aparea la evaluarea clinica si morfologica cu boala localizata, studii sensibile de IFCF si moleculare evidentiaza frecvent afectarea submicroscopica a maduvei osoase sau sangelui periferic¹⁴. IFCF permite identificarea celulelor imature sau anormale, distinctia lor de celulele imature prezente in mod normal in maduiva osoasa si timus, diferentierea intre ALL si AML, identificarea liniei celulare B sau T, subtiparea acestora  si urmarirea raspunsului la tratament, incluzand identificarea responder-ilor precoce si detectia bolii minime reziduale^2;5.

Utilizarea unui plot CD45 versus lumina dispersata lateral este foarte utila in identificarea blastilor, acestia prezentand o intensitate scazuta a expresiei CD45 si lumina dispersata lateral scazuta. Aceasta permite distinctia de limfocite (CD45 intens), precursorii eritroizi (CD45 negativ), precursorii neutrofilici si eozinofilici (lumina dispersata lateral mai crescuta) si monocite (lumina dispersata lateral mai crescuta si CD45 mai intens). Populatia blastica este apoi izolata prin “gating” electronic pentru analiza detaliata a expresiei antigenice. Blastii neoplazici pot fi similari celulelor normale blocate in maturatie si sunt recunoscute la diagnosticul prin IFCF prin numarul crescut comparativ cu celulele normale care exprima acelasi fenotip dar si prin expresia frecventa de pattern-uri anormale de maturatie, denumite pattern-uri imunofenotipice asociate leucemiei, ce pot fi clasificate in 4 tipuri: 1) expresia aberanta de markeri care nu sunt in mod normal prezenti pe celulele liniei respective; 2) expresia asincrona sau fenotipul contine aspecte neasteptate pentru stadiul de maturatie respectiv, cum ar fi expresia CD20 pe suprafata precursorilor de celula B; 3) supraexpresia si 4) lipsa expresiei unor markeri^1;2;5.

Distinctia intre AML si ALL este importanta pentru selectia terapiei corespunzatoare. In ALL CD19 are sensibilitatea si specificitatea cele mai mari pentru detectia liniei B, iar cCD3 pentru detectia liniei T. cCD22 sau cCD79a sunt de asemenea markeri sensibili si specifici pentru linia B².

Tabel 17.9.5.4: Markeri pentru diagnosticul leucemiei acute limfoblastice⁸

Linia celulara	Antigene
ALL cu precursor de celula B	CD19, CD10, CD79a, TdT, cCD22, HLA-DR, cCD79a
ALL cu precursor de celula T	CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TdT, cCD3
Leucemia Burkitt	CD19, CD10, CD20, CD22, CD79a, sIgG, CD45 intens