Imunofenotipare limfocitara-sindrom limfoproliferativ Informatii generale

ALL demonstreaza frecvent expresia a 1 sau 2 antigene mieloide, care contribuie la detectia celulelor anormale si nu trebuie sa duca la diagnosticul de leucemie bifenotipica. Mai putin de 5% din cazuri prezinta heterogenitate lineala, fie leucemie bifenotipica (expresia de antigene de la mai mult de o linie de catre o singura populatie de blasti) sau leucemie bilineala (doua populatii de blasti din linii diferite). Atunci cand o neoplazie blastica exprima markeri de la mai mult de o linie, celulele leucemice trebuie caracterizate complet morfologic, citochimic, imunofenotipic si citogenetic, iar informatiile trebuie cantarite si, de preferinta, stabilit un diagnostic de AML sau ALL. Aceeasi abordare este necesara la pacientii care exprima foarte putini markeri in incercarea de a minimiza numarul cazurilor din categoria AL nediferentiate².

Este in dezbatere existenta AL de linie NK, parand a exista un grup denumit leucemie NK/mieloida, ce poate avea afectare extramedulara si poate exprima urmatorul imunofenotip: CD56⁺, CD7⁺, posibil CD2⁺, CD13⁺, CD33⁺, MPO^- si CD3^- (de suprafata si citoplasmatic)².

Studiile de imunofenotipare au evidentiat diferente minore ale expresiei antigenice in LL cu precursor de celula B sau T si ALL. LL este rar la adult, dar este comun la copii. Aproximativ 90% din LL sunt de linie T, restul fiind de linie B, foarte rar putand avea originea intr-o celula NK. De obicei LL sunt TdT pozitive, un marker care distinge acest tip de neoplazie de alte tipuri de limfoame. Un numar mic de limfocite imature benigne TdT pozitive pot fi intalnite in sange si ganglionii limfatici. CD34 este de asemenea exprimat de multe LL, fiind util pentru diferentierea acestora de limfomul Burkitt (BL). De asemenea LL cu precursor de celula T sau B poate exprima CD10 sau CALLA (common acute lymphoblastic leukemia antigen), dar expresia CD10 in T-LL nu a fost asociata cu un prognostic favorabil ca in T-ALL. LL cu precursor de celula B, ca si B-ALL, poate fi impartit mai departe in 4 subtipuri, pre-B precoce, pre-B, pre-B tardiv (tranzitional) si B matur, in functie de expresia lantului greu μ citoplasmatic si de suprafata si a lanturilor usoare de Ig. LL pre-B precoce exprima CD10, CD19, CD34 si TdT. Stadiul de maturatie pre-B este cel mai frecvent intalnit si exprima CD20 si lantul greu μ citoplasmatic fara Ig suprafata detectabile. Cazuri rare de LL cu precursor de celula B pot exprima Ig de suprafata fara TdT detectabil si acestea trebuie diferentiate de BL.

Tabel 17.9.5.5: Aspecte imunofenotipice in limfoamele limfoblastice cu precursor de celula B si T¹⁴

Subtip

CD45

CD34

TdT

CD3

CD5

CD7

CD19

CD20

CD22

CD79a

CD10

Expresia Ig

Pre-B precoce

+

+

+

-

-

-

+

+/-

+

+

+

cIgμ^-, sIgμ^-, κ^-, λ^-

Pre-B

+

+/-

+

-

-

-

+

+/-

+

+

+

cIgμ^+, sIgμ^-, κ^-, λ^-

Pre-B tardiv (tranzitional)

+

+/-

+/-

-

-

-

+

+/-

+

+

+

cIgμ^+, sIgμ^+, κ^-, λ^-

B matur

+

+/-

+/-

-

-

-

+

+/-

+

+

+

cIgμ^+, sIgμ^+, κ^±, λ^±

T

+

+/-

+/-

+

+/-

+

-

-

-

-

+/-

 Malignitatile limfoblastice cu precursor de celula T pot fi de asemenea subdivizate corespunzator cu stadiile de maturatie timica normala a celulelor T: precoce (CD7⁺, cCD3⁺, CD5^+/-, CD2^+/-, CD1a^-, CD4^-, CD8^-), mijlociu (CD7⁺, CD5⁺, CD2⁺, cCD3⁺, sCD3^+/-, CD1a^+/-, CD4^+/-, CD8^+/-), si tardiv (CD7⁺, CD5⁺, CD2⁺, cCD3⁺, sCD3⁺, CD1a^-, CD4⁺ sau CD8⁺). Majoritatea cazurilor de LL cu precursor de celula T corespund stadiului timic tardiv, ca si timomul, de care trebuie diferentiate. Majoritatea LL mentin expresia antigenelor pan-T, in timp ce in limfoamele cu celula mare T lipsesc unul sau mai multe din aceste antigene^5;14. Expresia mai frecventa a TCR αβ decat γδ a fost raportata in T-LL fata de T-ALL. Unele LL pot prezenta expresia aberanta de antigene mieloide, iar T-LL pot exprima ocazional CD56. Toate recaderile T-LL trebuie restudiate imunologic deoarece un numar mic de cazuri pot prezenta o comutare fenotipica la leucemie acuta mieloida¹⁴.

ALL la adult sunt in 70% din cazuri cu precursor de celula B, 25% cu precursor de celula T si 5% cu celula B matura (celula Burkitt). Exista o incidenta usor mai mare a expresiei antigenelor mieloide in ALL la adulti decat la copii, comun fiind detectate CD13, CD15 si CD33. Cazurile rare cu coexpresia mai multor antigene mieloide si limfoide pot fi considerate leucemii acute bifenotipice.

Unele aspecte imunofenotipice prezinta valoare prognostica in ALL. Pacientii cu ALL cu celula B matura, caracterizata prin prin expresia lanturilor usoare de Ig de suprafata, κ sau λ, alaturi de alti markeri comuni ALL de linie B, incluzand CD10, CD19, CD20 si CD22, raspund prost la terapia standard, in aceste cazuri fiind stabilite programe de tratament cu doze intensificate ca terapie standard, ceea ce a dus la o imbunatatire semnificativa a supravietuirii la acesti pacienti. De asemenea ALL cu celula T era considerata anterior o forma cu prognostic nefavorabil, dar cu programele de tratament moderne, imunofenotipul T a devenit cu prognostic favorabil. Prin analiza datelor imunofenotipice colectate prospectiv, grupul de studiu german CALGB a idetificat un subset, caracterizat prin expresia a mai putin de 3 markeri de celula T, cu prognostic nefavorabil. Blastii leucemici ai acestor pacienti exprima rar markeri de celula T matura, ca CD1, CD2, CD3, CD4 si CD8, corespunzand unui imunofenotip de ALL cu celula T precoce, de asemenea raportat ca nefavorabil.

Expresia CD34, mai frecventa la adult in ALL de linie B, a fost de asemenea raportata ca avand efect advers, dar aceasta se suprapune atat cu un numar crescut de leucocite, cat si cu prezenta cromozomului Ph, caracterizate de asemenea printr-un efect nefavorabil⁹.

La copii, ALL cu celula pre-B precoce cuprinde aproximativ doua treimi din cazuri, se asociaza cu un prognostic favorabil, majoritatea fiind CALLA pozitive, expresia acestuia neparand a avea semnificatie prognostica independenta¹⁵.

ALL cu celula pre-B reprezinta ~20% din cazuri. Expresia cIg se asociaza cu prezenta anomaliei citogenetice t(1;19)(q23;q13), identificata la 20-30% din pacientii cu ALL cu celula pre-B si asociata cu un prognostic advers la acesti pacienti. Restul pacientilor prezinta rate de supravietuire similare ALL cu celula pre-B precoce¹⁵.

ALL cu celula B matura este rara, cuprinzand 1-2% din cazurile de ALL la copii, la fel ca BL fiind caracterizata prin morfologie L3 FAB, un fenotip cu CD10, CD19, CD20, CD22, CD79a pozitive si TdT negativ, prezenta t(8;14) sau a unei translocatii inrudite si supraexpresia oncogenei c-MYC. Acesti copii prezinta varste mai mari, o incidenta mai mare a afectarii SNC si raspuns prost la tratamentul standard^8;15.

ALL pre-B tranzitional, caracterizat prin expresia citoplasmatica si de suprafata a lanturilor grele fara expresia lanturilor usoare de Ig, apare la ~1% din copiii cu ALL, nu se asociaza cu morfologia L3 si cu translocatiile caracteristice ALL cu celula B matura si prezinta o evolutie favorabila¹⁵.

Unele fenotipuri in ALL se asociaza cu prezenta unor anomalii citogenetice si moleculare cu semnificatie prognostica. Astfel in B-ALL un fenotip CD9⁺, CD10⁺, CD19⁺, CD20^- sau numai partial, CD34^- este un marker sensibil pentru t(1;19)(q23;p13), dar este lipsit de specificitate¹. Pe de alta parte un fenotip CD10^-, CD15⁺, CD24^- se asociaza cu t(4;11)(q21;q23), rearanjamente ale MLL si un prognostic prost^2;5.

ALL cu celula T reprezinta ~15% din cazurile de ALL la copii, asociata anterior cu un prognostic nefavorabil, dar utilizarea regimurilor terapeutice intensive a rezultat intr-o supravietuire apropiata de cea a ALL non-T. Celulele leucemice pot fi dublu pozitive pentru CD4 si CD8. Majoritatea cazurilor de ALL-T sunt HLA-DR negative. Dintre acesti pacienti, cei cu imunofenotipul cel mai putin matur au o evolutie semnificativ mai proasta. Un subset caracterizat prin expresia CD7 si absenta CD4 si CD8 se asociaza cu rezistenta la chimioterapia conventionala, iar absenta expresiei CD2 identifica un grup de pacienti cu evolutie proasta.

Aproximativ 10-20% din copiii cu ALL exprima antigene mieloide, ca CD13 si CD33, care nu se asociaza cu semnificatie prognostica adversa conform ultimelor trial-uri, dar pot furniza un element convenabil pentru monitorizarea bolii minime reziduale^8;15.

Expresia CD34 a fost asociata cu efect favorabil independent in ALL de linie B la copii, dar nu si in cea de linie T¹⁵.

Boala minima reziduala (MRD)

In prezent majoritatea testelor de citometrie in flux pentru MRD tintesc sa detecteze populatii reprezentand 0.01% din evenimente, respectiv o celula din 10⁴, prin analiza a 500 mii pana la 1 milion celule, cu scopul detectarii a cel putin 50-100 evenimente de interes, putand concura astfel ca sensibilitate cu metodele PCR, citometria in flux prezentand avantajul discriminarii intre celulele viabile si cele moarte si masurarea directa a proportiei celulelor pozitive. Provocarea pentru detectia MRD prin IFCF este separarea celulelor leucemice reziduale de celulele nonmaligne, mai ales in stadiile de regenerare a maduvei osoase in care aceasta poate contine mai multe forme de maturatie precoce. In 1997, Jennings si Foon au aratat necesitatea utilizarii unei prime “porti” CD45 versus lumina dispersata lateral (SSC) pentru diferentierea subseturilor de celule si, cel mai important, a celulelor imature/blastice cu SSC si expresia CD45 scazute, atat la diagnostic cat si pentru detectia MRD, printre celulele in maturare din maduva osoasa. In 1999, Campana si Coustan Smith au estimat ca primele 4 combinatii pentru detectia MRD in AL la IFCF sunt: 1) CD19/CD34/CD10; 2) CD13/CD33/CD34; 3) CD13/CD33/CD117; 1) CD13/CD34/CD117, ceea ce presupune ca aceste aspecte imunofenotipice trebuie urmarite la diagnostic. Fenotipul se poate schimba adesea odata cu trecerea timpului si in urma tratamentului, astfel testul pentru MRD nu trebuie sa se bazeze pe potrivirea exacta a fenotipului bolii reziduale si cel al specimenului diagnostic original. Totusi subsetul de celule leucemice care persista mentin aspectul clonal si continua sa prezinte trasaturi omogene. Aceste celule reziduale apar la studiile prin IFCF ca un grup de celule ingust prezentand un fenotip “inghetat” printre celulele in maturare^1;2.

Pentru leucemia acuta exista in general o diferenta de 1 log intre maduva osoasa si sangele periferic, cu nivelul cel mai mare de MRD in maduva osoasa. Astfel, ca si in studiile bazate pe tehnici moleculare, analiza maduvei osoase poate fi restrictionata la cazurile in care MRD este in mod repetat nedetectabila in sangele periferic².

IFCF are un rol stabilit in detectia MRD in ALL, un rol in actualitate in CLL/SLL si un rol potential in alte malignitati hematopoietice si limfoide.

Cateva studii au demonstrat ca MRD detectata prin IFCF este un factor prognostic independent in ALL pediatrica. Astfel, prezenta MRD in maduva osoasa in absenta evidentei morfologice de boala, se asociaza cu risc mai mare de recadere, iar riscul creste cu nivelul de boala detectata. Schemele actuale de clasificare in ALL cu precursor de celula B incorporeaza, in afara criteriilor de risc NCI/Rome, elementele citogenetice, raspunsul precoce si incarcatura MRD la sfarsitul inductiei,  La adult datele sunt mai putine, dar detectia MRD pare sa fie un factor de risc independent pentru recadere. Aceste informatii pot asista la identificarea unor pacienti cu risc crescut care pot beneficia de terapie aditionala. mai multe studii efectuate au aratat o buna corelatie intre datele obtinute prin IFCF si PCR^1;2;15.

In ultimul timp, prin utilizarea schemelor de chimio-imunoterapie combinata, pot fi obtinute remisiuni MRD^- in CLL/SLL, iar studiile initiale au aratat o durata a raspunsului si o supravietuire mai lungi la pacientii fara MRD detectabila. Studiile pentru MRD in CLL pot fi efectuate utilizand sange periferic. Totusi exista celule B normale ale sistemului imun innascut cu un fenotip asemanator celui al CLL-B. Pe de alta parte se cunoaste putin despre soarta acestor celule normale in urma chimioterapiei pentru CLL. O procedura de citometrie in flux multiparametrica standardizata publicata recent de Rawstron et al a fost dezvoltata pentru detectia MRD la un nivel similar PCR-ului conventional (1×10^-4 sau 0.01%). PCR-ul cantitativ cu oligonucleotide alela-specifice este mai sensibil, dar necesita generarea de primer-i specifici pentru pacient si nu este general disponibil, iar la un nivel de 0.01% se coreleaza cu rezultatele IFCF. Astfel IFCF multiparametrica standardizata a fost propusa ca metoda preferata pentru detectia MRD in CLL/SLL. Aceasta recomanda 3 combinatii, respectiv asocierea CD5/CD19 cu CD20/CD38, CD81/CD22 si CD79b/CD43^1;2.

Recomandari imunofenotipare sindroame limfoproliferative 

• 
  evaluarea limfocitozelor de etiologie neprecizata, la pacienti care prezinta adenopatii, transpiratii nocturne, febra, scadere ponderala, oboseala, infectii, anemie, tendinta la sangerare;
  
• 
  distinctia intre limfocitozele policlonale (reactive, cel mai adesea virale) si limfocitozele monoclonale;
  
• 
  identificarea afectiunilor limfoproliferative cu celula B sau T;
  
• 
  subclasificarea fenotipica a bolilor limfoproliferative cronice;
  
• 
  distinctia intre leucemia limfoblastica acuta (LAL) si leucemia mieloida acuta (LAM);
  
• 
  subtiparea imunologica a LAL;
  
• 
  distinctia dintre limfomul malign si leucemia acuta;
  
• 
  monitorizarea tratamentului;
  
• 
  depistarea precoce a recidivelor^10,12.
  

Specimen recoltat - sange venos¹⁰.

Recipient de recoltare - vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant¹⁰.

Volum proba - 5 mL sange¹⁰.

Stabilitate proba - sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei¹⁰.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate¹⁰.

Metoda - citometrie in flux¹⁰.

Valori de referinta si comunicarea rezultatelor

Buletinul final va contine intervalele de referinta pentru subseturile limfocitare adecvate varstei pacientului  impreuna cu o interpretare a rezultatelor obtinute¹⁰.

Limite si interferente

• 
  Restrictia clasei lanturilor usoare de Ig a fost raportata rar in populatii de celule B reactive non-clonale, spre exemplu populatii ce prezinta restrictia lantului usor lambda au fost identificate in boala Castleman multicentrica. Astfel restrictia lantului usor de Ig nu este sinonima cu monoclonalitatea. De asemenea unele populatii care prezinta restrictia lantului usor si sunt monoclonale nu sunt neoplazice, identificate de exemplu in hiperplazia foliculara florida, incluzand-o pe cea observata la pacientii cu HIV. Astfel, rezultatele imunofenotiparii trebuie interpretate in conjunctie cu alte date clinice, morfologice si uneori genotipice².
  
• 
  La pacientii fara un  diagnostic anterior de neoplazie limfoida identificarea unei populatii mici de celule B anormale fenotipic (mai putin de 5% din toate celulele analizate) nu trebuie sa duca la stabilirea unui diagnostic nou decat in corelatie cu datele clinice, morfologice sau alte modificari^2;11.
  
• 
  In AL, procentul celulelor imature determinate prin IFCF poate diferi de numarul blastilor pe frotiurile din aspiratul medular, aceasta putand avea diferite explicatii, cum ar fi: dilutia mai mare cu sange periferic decat partea utilizata pentru frotiuri, includerea unor precursori imaturi normali (hamatogonii) la numaratoarea manuala, utilizarea unui numarator diferit pentru determinarea procentului de blasti, la numaratoarea manuala acestia fiind determinati ca procent din toate celulele nucleate, in timp ce la IFCF acestia sunt determinati ca procent din toate celulele analizate sau din celulele noneritroide (etapa de liza utilizata pentru indepartarea celulelor rosii anucleate indeparteaza de asemenea un numar variabil de precursori eritroizi nucleati). De asemenea blastii pot fi dificil de recunoscut la numaratoarea manuala sau pot fi distrusi la efectuarea frotiurilor. In plus celulele mieloide hipogranulare pot avea o lumina dispersata lateral scazuta si pot intra in regiunea blastilor in plot-ul CD45 versus dispersia laterala².
  

Bibliografie

1. Béné M, Kaeda J. „How and why minimal residual disease studies are necessary in leukemia: a review from WP10 and WP12 of the European Leukemia Net”. In Haematologica 2009; 94(8): 1135-50.

2. Craig F, Foon K. „Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms”. In Blood 2008; 111(8): 3941-67.

3. Dillman R. „Immunophenotyping of Chronic Lymphoid Leukemias”. In J Clin Oncol 2008; 26(8): 1193-94.

4. Dong H, Weisberger J, Liu Z, Tugulea S. „Immunophenotypic Analysis of CD103+ B-Lymphoproliferative Disorders. Hairy Cell Leukemia and Its Mimics”. In Am J Clin Pathol 2009; 131(4): 586-95.

5. Dunphy C. „Applications of Flow Cytometry and Immunohistochemistry to Diagnostic Hematopathology”. In Arch Pathol lab Med 2004; 128(9): 1004-1022.

6. Greer J, Williams M. “Non-Hodgkin Lymphoma in Adults”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 2164-70.

7. Hasserjian R, Harris N. „NK-Cell Lymphomas and Leukemias”. In Am J Clin Pathol 2007; 127: 860-8.

8. Head D. „Diagnosis and Classification of the Acute Leukemias and Myelodisplastic Syndrome”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1811-14.

9. Itakura H, Coutre S. „Acute Lymphoblastic Leukemia in Adults”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1823-24.

10. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2010. Ref Type: Catalog.

11. Macon W, McCurley T, Kurtin P, Dogan A. „Systemic Mastocytosis”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 2071-95.