İNŞaat mühendiSLİĞİ anabiLİm dali

2. BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

  
KARATUĞ Ayşe

Danışman : Prof. Dr. Şehnaz BOLKENT

Anabilim Dalı : Biyoloji

Programı : Zooloji

Mezuniyet Yılı : 2014

Tez Savunma Jürisi : Prof. Dr. Şehnaz BOLKENT

Prof. Dr. Refiye YANARDAĞ

Prof. Dr. Kadriye AKGÜN DAR

Prof. Dr. Ayşen YARAT

Prof. Dr. Tülin AKTAÇ

Sıçan İnsülinoma β-Hücrelerinde (INS-1) 4-Metilkatekol’ün Etkileri
İnsülinoma, pankreasın endokrin kısmını oluşturan Langerhans adacıklarının beta hücrelerinden kaynaklanan ve insülin salgılayan bir tümördür. Sağlıklı bireylerde artan kan glukozunu düşürmek için beta hücrelerinden insülin salgılanır. Kan glukozu homeostaza ulaşınca inhibe edici bir mekanizma insülinin fazla salınımını durdurur. Oysa, bu mekanizma insülinoma da insülin salınımını düzenlemez ve insülinomalar insülin salınımına devam eder. 3, 4-dihidroksitoluen olarak da bilinen 4-metilkatekol bir katekolamin türevidir ve reaktif oksijen türlerini üreterek sitotoksik etkisini gösterdiği bilinmektedir. Çalışmanın amacı sıçan insülinoma β-hücrelerine (INS-1) uygulanan 4-metilkatekol’ün hücre ölümüne neden olan dozlarının belirlenerek, bu dozlarda hücrelerin hangi ölüm tipi ile öldüğünü ve meydana gelen hücre ölümünün moleküler mekanizmasını araştırmaktır.
Çalışmada insülinoma INS-1 hücre soyu kullanılmıştır. Hücre ölümünün olduğu dozlarda hücrenin erken apoptoz, geç apoptoz ve nekroz ölüm tiplerinden hangisi ile hangi oranda öldüğünü belirlemek için hücreler akridin oranj/etidyum bromür ile işaretlenerek floresan mikroskobunda görüntülenmiştir. Apoptoz kiti kullanılarak bu dozlardaki apoptoz oranı ve sitotoksisite kiti kullanılarak da nekroz oranı spektrofotometrik olarak hesaplanmıştır. Reaktif oksijen türlerini diklorofloressin diasetat ile, mitokondri membran potansiyel kaybı ise 3,3′-diheksiloksakarbosiyanin iyodit ile hücrelerin inkübasyonu sonucu spektrofotometrik olarak gösterilmiştir. Hücre içi ATP ve GTP azalması yüksek performanslı likit kromotografisi ile belirlenmiştir. Hücre içi ve sekresyonundaki insülin miktarı insülin ELISA kiti kullanılarak hesaplanmıştır. Ekzojen verilen 4-metilkatekol sonucu hücreleri ölüme götüren dozlarda JNK/ERK hücre sinyal yolağı incelenmiştir. Hem aktif hem de total JNK ve ERK miktarları ELISA yöntemi ile gösterilmiştir. Hücre içinde MAPK yolağında fonksiyonel olan p-RAF1, hem aktif hem total Elk1, c-Jun ve ATF2 transkripsiyon faktörleri, ısı şok proteinlerinden Hsp 70, Hsp 90, hem hücre içi hem de hücre sekresyonunda Betasellülin ve inhibin beta-A miktarları western blot yöntemi ile gösterilmiştir. Protein seviyeleri belirlenen moleküllerin ekpresyon dereceleri q-RT-PCR ile elde edilen Ct değerlerinden hesaplanmıştır.
INS-1 hücrelerinde 4-metilkatekol’ün 250-450 M arasındaki dozlarında hücre ölümünün olduğu gözlenmiştir. Belirlenen dozlarda apoptoz ile meydana gelen hücre ölümünün kontrol grubuna göre anlamlı bir artış gösterdiği hesaplanmıştır. 350, 400 ve 450 M 4-metilkatekol verilmesi ile apoptoza kıyasla daha yüksek oranda nekrotik hücre ölümü gözlenmiştir. Bu dozlarda laktat dehidrogenaz değerlerinde, reaktif oksijen türlerinde ve mitokondri membran potansiyel kaybında artış gözlenmiştir. ATP ve GTP azalması da bulgularımızı desteklemektedir.
JNK ve ERK hücre sinyal yolağına bakıldığı zaman ise, 4-metilkatekol verilmesi ile belirlenen dozlarda kontrol grubuna göre p-RAF1 aktivitesinde artma, ekspresyonunda azalma, total JNK miktarında azalma, aktif JNK miktarınında artma, ekpresyonunda azalma, total c-Jun miktarında artma bulunurken, aktif c-Jun miktarında ve ekspresyonunda değişiklik bulunmamıştır. Total ATF2 ve aktif ATF2 miktarlarında herhangi bir değişiklik gözlenmezken, ekpresyonunda azalma gözlenmiştir. Total ERK miktarı değişmezken, aktif ERK’da ve ekpresyonunda azalma görülmüştür. Total Elk1 ve aktif Elk1 miktarlarında değişiklik olmamıştır, ancak Elk1 ekspresyonunda azalma bulunmuştur. Isı şok proteinlerinden Hsp 70 ve Hsp 90 miktarlarında ve ekpresyonlarında gruplar arasında değişiklik bulunmamıştır. Betasellülin hem hücre içinde ve sekresyonda hem de ekpresyonda azalma göstermiştir. İnhibin beta A’nın ise hücre içi ve sekresyonda değişiklik görülmezken, ekspresyonda azalma dikkati çekmiştir.
Hücre içi insülin miktarında gruplar arasında fark gözlenmezken, Ins1 ekspresyonunda azalma görülmüştür. 4-metilkatekol’ün artan dozlarında düşük doz glukoz verilmesi ile insülin sekresyonu artarken, yüksek doz glukoz verilmesi sonucu gruplar arasında herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir. Ayrıca GLUT2 ekspresyonunda azalma bulunmuştur.
Sonuç olarak, 250-450 M dozlarda 4-metilkatekol’ün insülinoma INS-1 hücrelerine uygulanması ile hücre ölümü gerçekleşmektedir. 350, 400 ve 450 M 4-metilkatekol verilmesi ile hücreler apoptoza oranla daha fazla olarak nekrotik ölüme gitmektedir. Hücrelerin bu nekrotik hücre ölümünü, i) fosforile olan RAF1 ve transkripsiyon faktörü c-Jun ile JNK yolağının aktif hale gelmesi, ii) Hsp 70 ve Hsp 90’nın hücre içerisinde herhangi bir değişiklik göstermeyerek, JNK yolağınının aktif halde kalması sonucunda gerçekleştirdiğini düşünmekteyiz.