Juillet 2001 n° 185

Les Productions Microbiennes

115 Les nouveaux biosurfactants sont surtout des sucres modifiés. Industrial BioProcessing 23 (MAY01) contient un survol des approches actuellement envisagées pour en produire. Dans les biosurfactants étudiés industriellement, le pôle hydrophile est le plus souvent constitué par un sucre ou un acide aminé, et le pôle hydrophobe, est presque toujours constitué par un lipide. Lipases et protéases fonctionnant à l'envers (donc en milieu hydrophobe) sont utilisées. Parfois c'est une production microbienne.

Le Centro de Investigacion y Desarrollo de Barcelona utilise la papaïne pour produire des surfactants par greffe de diverses alkylamines ou alcools sur l'arginine.

L'Institute for Food Research à Norwich utilise une synthèse enzymatique basée sur les sucres pour des émulsifs à usage alimentaire. Ils utilisent une lipase agissant sur le sorbitan (dérivant du sorbitol par déshydratation) qui le greffe sur les acides gras. Tout dépend d'un solvant organique adéquat pour faire fonctionner l'enzyme en réverse. Il faut dissoudre les réactifs sans altérer l'enzyme. Ces chercheurs utilisent un mélange azéotrope de n  hexane et de tert butanol. Ils utilisent également des glucosidases pour former des glycosides éthoxylés, à partir de glycols éthoxylés.

A l'University of Iowa on cyclise le glucose ou le saccharose en sulfite puis sulfate qui est, ensuite couplé à des acides gras ou des acylamines.

Des chercheurs de l'Université de Keio à Yokohama réalise la production d'octyl ß-D-xylobioside avec une enzyme d'Aureobasidium pullulans.

Les rhamnolipides de Pseudomonas sont utilisés à l'University of Arizona à Tucson. Ils sont, au passage, fongicides.###

117 Le gène RAG4 de Kluyveromyces lactis code un capteur de glucose. La protéine est homologue de deux protéines de Saccharomyces cerevisiae, Snf3p et Rgt2p, qui sont des capteurs de glucose à basse et forte concentrations. Les deux fonctions sont probablement regroupées dans la même protéine chez Kluyveromyces lactis car il n'existe pas d'autres homologues SNF3/RGT2 chez cette levure. Chez les mutants rag4, la répression de plusieurs enzymes inductibles par le glucose est supprimée. S Betina et al.; Genetics 158 (JUN01) 541-548.

118 CheY est est un prototype de protéine régulant la chimiotaxie bactérienne, agissant dans le cadre d'un récepteur à deux composants (capteur+transmetteur). La phosphorylation d'un aspartate conservé du site actif entraîne un changement conformationnel modulant les interactions avec la kinase CheA, la protéine FliM du moteur flagellaire, et la phosphatase CheZ. On a une signalisation en retour car la fixation de CheA, CheZ et FliM affecte considérablement l'autophosphorylation de CheY par des donneurs de groupements phosphate. L'autodéphosphorylation et l'affinité pour le substrat ne sont, par contre, pas affectées. Les résidus Thr87, Tyr106 et Lys109interviennent dans le mécanisme d'activation mais ne sont pas essentiels au couplage conformationnel. M Schuster et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 (22MAY01) 6003-6008.

120 La dynamique des flux métaboliques du galactose chez Saccharomyces cerevisiae lors d'additions ponctuelles (une injection de galactose à 5,58 mM) en culture aérobie en galactose limitant montre que c'est le produit du gène GAL7 qui régule le flux à travers de la voie de Leloir.

La teneur en ATP en présence de galactose est inférieure à celle observée en présence de glucose dans les mêmes conditions (sucre limitant). Le pulse est consommé en 40 minutes. Dès la 7° minutes le flux vers le cycle de Krebs diminue, acétate et ethanol commençant à être excrétés. A 30 minutes la croissance reprend à la moitié de la cadence normale. Quand le galactose a été consommé, la division cellulaire cesse puis reprend au bout d'un délai mais n'atteint que la moitié de la croissance à l'équilibre. Le flux vers le cycle de Krebs dépasse alors la normale. En fait, durant toute cette période la concentration en galactose-1-phosphate est supérieur à la normale, l'affinité de Gal7 étant trop faible, ce qui entraîne la réponse toxique limitant le métabolisme. S Ostergaard et al.; Biotechnology & Bioengineering 73 (20JUN01) 412-425.

122 On trouvera dans un article australien RJ van Wegen et al.; Biotechnology & Bioengineering 74 (05JUL01) 70-81, une analyse de la cinétique de production de poly(3-hydroxybutyrate) ou PHB par des E.coli recombinantes, ainsi que du métabolisme correspondant. Le flux de PHB est très sensible au rapport acétyl-CoA/CoA à la concentration totale acétyl-CoA+CoA et au pH. Il est beaucoup moins sensible au ratio NADPH/NADP et insensible à la concentration NADPH+NADP. Aucune enzyme en particulier n'est limitante. La carence en oxygène permet un démarrage rapide de la production et initie une série de changements métaboliques comme l'arrêt du flux dans le cycle de Krebs et un accroissement du ratio acétyl-CoA/CoA.

Le flux des publications sur la production du PHB ne se tarît pas malgré l'abandon par Monsanto (qui a transféré le bébé à Metabolix) et d'ICI qui est probablement dû au fait que c'est la faiblesse de la production qui la rend, actuellement, non rentable (y compris dans les plantes) et que le nœud du problème réside dans le pilotage du métabolisme général pour l'adapter qui avait été trop négligé dans les premières versions des outils de production.

L'US Patent 6,248,862 (19JUN01) déposé le 17 Août 2000, de Monsanto, décrit la production de polyhydroxyalcanoates relativement thermostables et pouvant être ramifiés car hydroxylés à leur extrémité, en cultivant un organisme producteur en présence de diols ou polyols.

123 La plupart des microalgues sont des photoautotrophes obligés. Leur exploitation comme des producteurs de différents produits biologiques utiles a été vantée par plusieurs firmes qui avançaient la possibilité de cultures en plein air dans des étangs, sans apport d'énergie, etc… On sait, par ailleurs, transformer plusieurs d'entre elles.

Malheureusement le "plein air" se contamine facilement (et les microalgues très halo- et thermorésistantes sont une parade à ce danger), et les densités cellulaires ne sont pas extraordinaires, ce qui complique la culture et surtout la collecte, même si des souches ou des espèces comme Phaeodactylum tricornutum (diatomée) cultivables à fortes densités existent.

Ceci explique que la firme Martek vient de rendre cette diatomée cultivable en présence de glucose, et bien à l'abri dans un fermenteur en implantant un transporteur de glucose humain (glut1 ou hup1). LA Zaslavskaia et al.; Science 292 (15JUN01) 2073-2075.

124 Nestec a breveté la production de dextranes à partir de saccharose pour la cosmétique et l'alimentation par un Leuconostoc mesenteroides ssp. Cremoris. US Patent 6 242,226 (05JUN01) déposé le 12 Novembre 1999 et faisant suite au brevet européen 97/201628 (31MAY97). On y retrouvera une longue liste des procédés brevetés pour la production des polysaccharides. Les fructosyltransférases sont utilisées pour préparer des quantités commerciales de glucose à partir de saccharose. Des polyfructanes produits durant l'excision du glucose par des fructosyltransférases et des glucosyltransférases peuvent donner des polyglucanes lors de la libération de fructose.

125 Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste des animaux, donne des biofilms dans certains tissus, mais également en liberté. Ces biofilms font intervenir les composants de la voie des chaperone/usher (chaperone périplasmique et la protéine usher (huissier) mentionnées dans le bulletin de Mai). Les gènes correspondants ont été identifiés par un groupe de Marseille et de Harvard en les inactivant par Tn5. Ces gènes ont été dénommés cupA1-A5. Il existe des homologues (CupB et CupC) dans le génome mais ils ne semble pas utilisés dans l'adhésion. Il est vraisemblables que ces gènes sont utilisés selon le milieu ou le biofilm se développe. I Vallet et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 (05JUN01) 6911-6916.

126 Ajinomoto a breveté des souches de Klebsiella, Erwinia ou Pantœa dont les enzymes intervenant dans les embranchements greffés sur la voie de la synthèse de l'acide glutamique sont inactivées pour canaliser le metabolisme dans cette direction sous l'US Patent 6 197 559 (06MAR01).

Les Protéines et les Enzymes

127 La structure cristalline d'une des kinésines, KIF1A, une enzyme permettant un déplacement unidirectionnel le long des microtubules vient d'être établie. M Kikkawa et al.; Nature 411 (24MAY01) 439-445 . L'enzyme fonctionne grâce à l'hydrolyse de l'ATP, et réalise des changements de conformation cycliques, comme le fait la myosine sur l'actine. Les auteurs ont cristallisé la molécule sous deux états, avec l'ADP et avec un analogue de l'ATP. Cette kinésine a la particularité de fonctionner à l'état de monomère, contrairement à beaucoup d'autres qui sont à plusieurs sous-unités, ce qui ne facilite pas l'étude structurale. Ceci se traduit d'ailleurs par des différences dans quatre des boucles de la protéine (L2, L3, L10 et L12).

Chez la myosine et la kinésine, le site fixant le nucléotide est flanqué par deux structures, les switch I et II, comme chez les protéines G (fixant le GTP). On connaissait la structure cristalline de la myosine et des protéines G dans les deux états, chargé et non chargé et on avait identifié les conséquences de l'hydrolyse de l'ATP qui entraîne l'inactivation des protéines G et le déplacement de la myosine. Ce qu'il y a d'intéressant dans cette dernière étude, c'est qu'une hélice a, située face au microtubule dans la "tête" de la kinésine, s'allonge de deux tours au dépens d'une boucle adjacente, et tourne de 20° quand le nucléotide lié est l'ADP. La torsion de la molécule est alors communiquée au "cou" qui est l'élément essentiel du moteur. Les auteurs suggèrent que, quand l'ATP est présent, le tour de 20° permet l'agrafage de la kinésine sur les microtubules, comme les capsules sur certaines bouteilles. Voir également le commentaire de M Schliwa et al.; p. 424-425.

128 Les protéases à sérine forment un abondante famille dont l'évolution a été analysée par MM Krem et al.; The EMBO Journal (15JUN01) 3036-3045.

On distingue, grâce à des marqueurs moléculaires comme les acides aminés et les codons utilisés pour la sérine, trois branches dans cette évolution: les chymotrypsin-like, subtilisin-like et hydrolases à plis a/ß. Toutes regroupent une triade Ser–His–Asp dans le site actif, et la configuration peut évoluer, mais doit rassembler ces trois acides aminés, avec une sérine ou une cystéine stabilisant la triade (Ser214, Ser125 et Cys341respectivement dans chacune des branches). On peut interpréter ces résultats en envisageant des duplications de domaines suivies par un clivage du gène.

Ceci devrait permettre une amélioration de la prévision des relations structure/fonction et être utilisé pour d'autres familles d'enzymes.

129 La substitution d'acides aminés chargés positivement par des acides neutres dans la fente accueillant le substrat d'une protéase de type subtilisine améliore son efficacité dans les détergents. US Patent 6 197 589 (06MAR01), octroyé à Henkel.

130 Industrial BioSystems s'intéresse aux traitements enzymatique dans l'industrie du papier. L'une des utilités des xylanases est d'éviter la reprécipitation des xylanes sur les fibres de cellulose où ils piègent les restes de lignine.La société vient de breveté sous l'US Patent 6 200 797 (13MAR01) une xylanase bactérienne (xylanase B230) utilisable comme aide au blanchîment de la pulpe mécanique, kraft et dans l'industrie de la viscose. Elle a un pHopt très large (5 à 9) et fonctionne jusqu'à 70°. Elle ne remplace pas les produits chlorés, mais en réduit l'usage de 50%. Une des qualités de cette xylanase serait de ne pas avoir d'activité cellulasique résiduelle.

131 L'US Patent 6,197,070 (06MAR01) de Procter & Gamble couvre l'utilisation d'une combinaison d'a-amylases pour l'élimination de mauvaises odeurs, quand elles sont incorporées dans des mélanges détergents pour le linge. L'US Patent 6 204 234 (20MAR01) octroyé à la firme couvre l'utilisation d'oxygénases à soufre ou fer pour le nettoyage des taches protéiques sur les surfaces et le linge.

132 La spécificité de longueurs de chaînes des acides gras hydrolysables par les lipases peut être modifiée. Celle de Rhizomucor miehei a été modifiée par substitution au hasard de la Phe94 dans la fente qui accueille la chaîne acyle. Quatorze des 19 mutants possibles ont été identifiés et exprimés dans Pichia pastoris qui sécrète l'enzyme, ce qui facilite l'étude. La mutation Phe94Gly est six fois moins active sur l'ester de resorufine mais est 3-4 fois plus active sur des esters d'acides butyrique, nettement plus courts. La structure de la molécule étant connue, les chercheurs de l'Institute of Food Research à Norwich ont interprété cette nouvelle donnée en termes structuraux. DJ Gaskin et al.; Biotechnology & Bioengineering 74 (20JUN01) 433-441.

133 La fracturation des roches-mères des gisement pétroliers est entreprise quand il faut libérer le plus possible de pétrole en fin d'exploitation. On injecte des gommes et du sable qui empêche les fissures de se refermer. Les gommes et polysaccharides divers utilisés servent à obtenir un mélange fluide qui peut être plus facilement injecté et maintient le sable en suspension. Mais les gommes ont tendance à boucher les cavités étroites, et il faut pouvoir s'en débarrasser quand elles ne sont plus utiles. On peut donc ajouter des enzymes pour les dissoudre. L'US Patent 6 197 730 (06MAR01) couvre l'utilisation d'a-galactosidases et de ß- mananases agissant respectivement sur les liaisons a-1,6 et les liaisons ß-1,4 du guar. Ces enzymes sont issues de microrganismes thermophiles dont une longue liste est citée, mais avec une insistance sur Thermotoga, Thermococcus et Pyrococcus, qui sont plus accessibles. La thermophilie est recherchée, car les enzymes ne doivent pas s'attaquer à la gomme pendant le stockage à la surface, mais devenir actives en profondeur dans le sol, au delà de 80°.

134 L'amélioration de la stabilité thermique d'une phytase a été l'occasion pour des chercheurs de Roche Vitamins d'un exercice de construction de chimères. L Jermutus et al.; Journal of Biotechnology 85 (23JAN01) 15-24. Ils ont comparé les phytases d'Aspergillus terreus et d'Aspergillus niger relativement plus thermostable. Ils ont comparé les techniques de mutations dirigées et la création de chimères à l'échelle de structures secondaires comme les hélices, etc…en les transférant de l'enzyme d'A.niger dans celle d'A.terreus. Ainsi l'hélice comprenant les acides aminés 66 82, a amené la thermostabilité au niveau de celle d'A.niger. Au contraire des modifications rationnelles de la surface de l'enzyme en renforçant ponctuellement des liaisons ioniques ou des hydrogènes comme c'est le cas chez A.niger n'ont pas donné les résultats attendus.

Des chercheurs allemands et espagnols ont caractérisé une phytase acide de germes de fève. R Greiner et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 49 (MAY01) 2234-2240. Les phytases microbiennes sont connues, mais on ne connait que peu de phytases de plantes (du maïs par exemple), et les industriels souhaiteraient en avoir plus à leur disposition car ils pensent que, provenant de plantes, elles seraient mieux acceptées par les consommateurs.

135 Novo Nordisk a breveté sous l'US Patent 6 242 237 (05JUN01) déposé le 21 Août 1998 et faisant suite à deux brevets danois sur des galactanases de Myceliopthora thermophila et Humicola insolens (deux Sordariales) ayant un pHopt supérieur à 5,9. C'est le point faible de nombreuses galactanases qui ont été isolées et qui sont toutes à pHopt acides. De plus seul le cDNA de la ß-1,4-galactanase d'Aspergillus aculeatus a été cloné et séquencé par la firme (brevet mondial WO 92/13945 d'Août 1992). Les auteurs ont identifié deux motifs qui leur permettraient d'identifier d'autres gènes de galactanases des Sordariales.

Novo Nordisk a breveté [US Patent 6 218 170 (17APR01)] des mutants de laccases aux caractéristiques (notamment un pHopt, un potentiel oxydatif, etc…) modifiées. Elles sont basés sur la laccase de Myceliophthora thermophila.

Enfin la firme a breveté des xylanases d'un grand nombre de champignons (Byssochlamus, Chaetomium, Humicola, Malbranchea, Mucor, Myceliophthora, Paecilomyces, Talaromyces, Thermoascus ou Thielavia) pour une utilisation dans l'alimentation animale. US Patent 6 245 546 (12JUN01).

136 Le Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology de Taejon et Archer Daniels Midland ont breveté sous l'US Patent 6 204 040 (20MAR01) une sorbitol déshydrogénase de Gluconobacter suboxydans pour la production de L sorbose et d'acide 2 céto L gluconique, un intermédiaire dans la production de vitamine C. Parallèlement Fujisawa Pharmaceutical a breveté sous l'US Patent 6 197,562 (06MAR01) une L sorbose déshydrogénase et une nouvelle L sorbosone déshydrogénase issues de Gluconobacter oxydans dans le même but.

137 L'US Patent 6 218 350 (17APR01) de Lever Brothers décrit une chloroperoxydase à vanadium de Curvularia inaequalis. On trouvera des précisions sur ce type d'enzymes et dans un cadre plus large, dans le chapitre "Enzymes et Protéines" du Bulletin d'Avril.

139 Nexia a commencé de commercialiser expérimentalement de la soie d'araignée produite dans du lait de chèvre. Il reste à la filer correctement. (F Vollrath et al.; Nature 410 (29MAR01) 541 548).

Les polymères synthétiques d'origine pétrolière comme nylon et polyesters sont filés sous forme liquide à haute température, les cristaux s'alignant au refroidissement. Les polymères acryliques sont filés dans des solvants organiques qui s'évaporent après extrusion. Dans le cas des fibres cellulosiques comme la rayonne, la cellulose est coagulée chimiquement après extrusion. Les détails ne sont que rarement révélés car ils conditionnent les qualités des fibres. C'est également vrai de la soie d'araignée. Des chercheurs d'Oxford montrent que la soie est un cristal liquide qui conservent plus ou moins certaines associations des cristaux. Or ceci a lieui dans les filières de l'araignée et cei est renforcé lors de l'extrusion qui oriente les protéines (voir le Bulletin de Mai).

140 Une technique d'amélioration de l'activité des abzymes (anticorps catalytiques) par incorporation de séquences de sites actifs connus dans des anticorps conférant la spécificité de substrat est développée dans l'US Patent 6 242 236 (05JUN01) de Meso Scale Technology de Gaithersburg. ###

141 Les déchets engendrés par l'industrie du cuir dans le monde doivent se monter à plus de 500 000 tonnes par an issues du tannage au chrome. Bien que le chrome soit présent sous sa forme trivalent, moins toxique que la forme hexavalente, il n'en constitue pas moins un problème. Un traitement enzymatique a l'avantage d'améliorer la qualité des gélatines issues de ces déchets et de pouvoir éliminer le traitement au chrome. C'est un traitement à la transglutaminase des produits de l'hydrolyse du collagène qui est proposé par l'US Patent 6 200 789 (13MAR01) qui permet de compacter ces déchets et d'extraire la gélatine. Le traitement pourrait être étendu à d'autres produits animaux comme la kératine des plumes de volailles, la laine, etc…La technique est relativement rudimentaire et devrait certainement être améliorée.

L'Agroalimentaire

143 Une synthèse enzymatique de vanilline est décrite par des chercheurs hollandais: RH van Den Heuvel et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 49 (JUN01) 2954-2958.

La vanillyl alcool oxydase (VAO) est une flavoprotéine agissant sur un large spectre de composés phénoliques et convertissant créosol et vanillylamine en vanilline avec un rendement acceptable. La VAO convertit le creosol d'abord en vanillyl alcool puis en vanilline. Mais chacune des deux étapes subit des inhibitions. La première est liée à la formation de complexes abortifs entre la flavine de l'enzyme et le creosol. La conversion du vanillyl alcool est inhibée par une fixation compétitive du creosol. La conversion de la vanillylamine fonctionne bien aux pH alcalins. La vanillylamine est convertie en l'intermédiaire vanillylimine qui est hydrolysée non-enzymatiquement en vanilline. L'intérêt de ces études est que la capsaïcine des poivrons est hydrolysable enzymatiquement en vanillylamine.

144 On trouvera dans O Ramstrom et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 49 (MAY01) 2105-2114, une revue sur l'utilisation de la technique des polymères à empreintes moléculaires pour la détection, l'extraction et la préconcentration de molécules d'origine agricole ou alimentaire. Cette technique, basée sur des polymères porteurs de récepteurs biomimétiques, se développe en ce moment et qui donne des résultats relativement rapides et reproductibles d'une manière simple. Il reste, peut être, des limitations dues au coût, mais celui-ci pourrait baisser.

145 La prévention de la rétrogradation de l'amidon (rassissement) dans les produits de boulangerie peut être assuré en partie par l'utilisation d'enzymes. Roehm propose, dans l'US Patent 6 254 903 (03JUL01), d'utiliser une a-amylase de Thermoactinomyces vulgaris.

Des a-amylase d'origines diverses (champignons,, bactéries mais aussi blé, orge malté) sont utilisées massivement comme additifs de la pâte à pain pour améliorer ce dernier. Mais leurs effets dépendent beaucoup de leur origine et des autres additifs comme sel et sucre, acide ascorbique (antioxydant) et propionate de sodium (antibiotique), sans compter les métabolites normaux de la fermentation comme les acides organiques et les oligosaccharides. Des chercheurs de Valencia ont abordé le problème expérimentalement. En général les amylases des céréales sont nettement moins sensibles aux ingrédients que les autres. Les auteurs soulignent qu'il faut être relativement circonspects dans ces additions. CM Rosell et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 49 (JUN01) 2973-2977.

146 Le "gluten" dans la pâte à pain est un complexe fort mal connu. On sait, certes, que les gluténines joue un rôle dans sa formation, mais leur structure ne permet pas de faire des hypothèses sur leur rôle dans la qualité du pain. On pense cependant que les ponts disulfures doivent intervenir. Des chercheurs du Kansas montrent que des ponts tyrosines interviennent également. KA Tilley et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 49 (MAY01) 2627-2632.

147 Les chercheurs de l'INRA à Jouy ont analysé 6 prophages de Lactococcus lactis IL1403 dont trois sont "complets" avec une taille de 36-42 kb et appartiennent au groupe P335 et trois plus petits (13-15 kb) qui sont probablement des satellites dépendant d'un phage auxiliaire pour leur multiplication. Les auteurs décrivent l'organisation génomique de ces phages tempérés et la comparent à celle des phages virulents. On sait qu'il existe deux types d'organisation chez les phages. L'un des types est celui de phages tempérés comme ceux du groupe P335, avec une variabilité importante du génome (à peine 10 33% d'homologie entre eux) et celui des phages virulents ou l'homologie porte sur plus de 90% de la longueur du génome. Les auteurs suggèrent que les phages virulents sont soumis à des contraintes beaucoup plus fortes que les phages tempérés. De plus les auteurs estiment que les transferts de séquences entre phages tempérés dans une même cellule sont plus fréquents.

On retrouve une situation analogue chez Escherichia coli, Bacillus subtilis, Mycobacterium et Streptococcus thermophilus. A Chopin et al.; Nucleic Acids Research 29 (01FEB01) 644-651.

Les chercheurs de Nestlé ont effectué une analyse génomique comparée des bactériophages BK5-T de Lactococcus lactis et Sf21 de Streptococcus thermophilus, deux virus tempérés (induisant la lysogénie, cad incorporés dans le génome) de 40kb. Ils ont une même organisation génomique et beaucoup de similitude dans leurs séquences. On retrouve ces Siphoviridés dans les génomes de plusieurs genres de Gram+ à faibles teneurs en GC. On constate un gradient de similitudes, séquences nucléique, protéique, organisation du génome qui est parallèle à l'arbre évolutif de leur bactérie-hôte. Tout ceci indique une coévolution de l'hôte et du virus. On observe cependant des traces de transferts horizontaux récents entre phages mais au sein d'une même espèce bactérienne. F Desière et al.; Virology 283 (10MAY01) 240-252.

148 La microflore intestinale humaine contient vraisemblablement 500 à 1000 espèces différentes, dont au moins 50% ne peuvent être cultivées ex vivo. La densité de cette population est de 10¹² organismes par gramme. Ce potentiel génétique est acquis peu après la naissance et se développe comme un véritable "organisme", ce qui l'a fait nommer, dans l'air du temps, "microbiome" par Joshua Lederberg. On trouvera dans LV Hooper et al.; Science 292 (11MAY01) 1115-1118 un article sur l'équilibre évolutif au cours de la vie de la flore mutualiste (regroupant symbiotes avec bénéfice réciproque, et commensaux se nourrissant à la même table) vis-à vis des réactions immunitaires de l'intestin. Cette revue se base, en partie sur un article analysé dans le Bulletin d'Août 2000, AJ Macpherson, et al., Science 288 (23JUN00) 2222-2226. Elle fait également ressortir les mécanismes aboutissant à un renforcement de la barrière intestinale par les bactéries commensales comme Bacteroides thetaiotaomicron. ###

Les Probiotiques

149. Pour ceux qui prennent leur pastis sous un parasol, sachez que la glycyrrhizine a une effet général sur l'immunomodulation (exploité par la médecine chinoise) par renforcement de la production de l'interleukine-12 (IL-12), une cytokine des monocytes/macrophages stimulant la réponse des cellules T helper type 1 (Th1). Elle joue ce rôle via la stimulation par les lipopolysaccharides. JH Dai et al.; Immunology 103 (JUN01) 235-243.

150 Des chercheurs de l'Université d'Exeter, de Plant Research International et d'Unilever ont enrichi l'épicarpe (la peau)en flavonols qui sont des antioxydants. De faibles teneurs en flavonoïdes sont présentes dans l'épicarpe des tomates normales (~5-10 mg/kg de poids frais). Ce sont surtout de la naringénine chalcone et de la rutine qui un flavonol (glycoside de quercétine).

Les tomates ont été construites pour surexprimer le gène chi-a de la chalcone isomérase du Petunia. La teneur en flavonols de l'épicarpe a été multipliée par 78 (surtout de la rutine). Cette teneur atteint celle des oignons qui sont réputés riches en flavonols. On conserve 65% de ces flavonols au cours de la fabrication de la purée de tomate. SR Muir et al.; Nature Biotechnology 19 (MAY01) 470 474. Il n'y a aucune raison que l'on ne puisse pas aiguiller la production vers d'autres flavonoïdes présumés utiles à la santé, compte-tenu de nos connaissances dans la synthèse de ces composés.

151 L'ingéniérie de la voie de synthèse des flavonoïdes chez les plantes est l'objet d'une revue de G Forkmann et al.; Current Opinion in Biotechnology 12 (APR01) 155 160. ###

152 Seuls les flavonols avec un hydroxyl libre en C-3 ont une forte activité inhibitrice sur l'oxydation du ß-carotène. L'activité antiradical dépend d'une structure flavonol ou d'un hydroxyl libre en C-4'. Mais l'activité de ce dernier groupement est fortement affectée par d'autres caractéristiques structurales , comme la présence d'hydroxyls libres en C-3 et/ou C–3' ainsi que par la présence d'une double liaison C2-C3. S Burdy et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 49 (JUN01) 2774-2779.

153 Il est commun de lire que la vitamine C (acide ascorbique) protège contre les cancers en nettoyant les oxygènes dits réactifs (ROS), produits de trois réductions à un électron en cascade. Aucun effet préventif n'a, cependant, jamais été démontré. En effet, en présence d'ions de métaux de transition, la vitamine C se transforme en pro-oxydant. L'effet a été suivie sur les lipides dont la transformation hydroperoxydes puis en substances génotoxiques peut être ainsi assurée. La vitamine C pourrait jouer le rôle des ions de métaux de transition en leur absence. SH Lee et al.; Science 292 (15JUN01) 2083-2086.###

155 Des chercheurs italiens montrent que certaines préparations de cyanobactéries commercialisées contiennent des toxines (anatoxines A neurotoxiques). Ces anatoxines sont des agonistes nicotiniques. Ils y ont décelé anatoxine-A et homoanatoxine-A, avec leurs produits de dégradation. Il conviendrait donc d'être vigilant sur ce point. R Draisci et al.; Food Additives & Contaminants 18 (JUN01) 525-531

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156 La plupart des supplémentations en ail sous forme de tablette à des fins nutraceutiques font mention de leur potentiel en allicine. Mais pour protéger, dans l'estomac, l'alliinase qui libère l'allicine on doit pelliculer le produit. Le résultat est que, sauf exception, l'activité alliinase dans l'intestin est très faible à la suite d'une inactivation de l'enzyme par les excipients et à la suite d'une dissolution trop lente du pelliculage!!! LD Lawson et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 49 (MAY01) 2592-2599.

La sécurité alimentaire

157 La Communauté européenne a mis en place, en 1992, un réseau de laboratoires de référence dont elle vient de vérifier la capacité à détecter l'aflatoxine M1 au seuil préconisé (0,05 µg/L.). Les résultats sont rassurants. S Dragacci et al.; Food Additives & Contaminants 18 (MAY01) 405-415.

Une étude multi-laboratoires impliquant 28 unités de 12 pays différents s'est attaqué à la détection de la zearalénone chez le maïs et du désoxynivalénol (un thrichotécène type B) chez le maïs et le blé, chacun avec sa technique. Ce sont des mycotoxines produites par les Fusarium. Les variations les plus fortes dans les résultats des dosages tiennent surtout au calibrage des techniques et l'utilisation de techniques de séparation. RD Josephs et al.; Food Additives & Contaminants 18 (MAY01) 417-430.

159 La présence de l'ochratoxine A dans des pâtés de foie de porc peut être détectée par HPLC. AM Jimenez et al.; Food Additives & Contaminants 18 (JUN01) 559-563. On en trouve.

160 Helicobacter pylori cause des ulcérations liées à une inflammation chronique du tube digestif due à un recrutement, par des chimiokines, de neutrophiles aux sites d'infection. Ses lipopolysaccharides induisent surtout la production de chimiokines de type CXC (disposition de cystéines dans la partie N-terminale de la protéine) et beaucoup moins de type CC comme RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed and presumably Secreted aussi appelée CCL-5). M Innocenti et al.; Infection and Immunity 69 (JUN01) 3800-3808.170

161 Une des difficultés dans l'étude de la pathogenèse de la listériose est qu'on n'avait pas de modèles souris fonctionnant par ingestion, et que toutes les études antérieures ont été réalisées après injection vasculaire de la bactérie Listeria monocytogenes.

Des chercheurs de l'Institut Pasteur ont monté un modèle de souris et de hamster pour la listériose qui leur a permis d'établir comment Listeria pénètre dans les cellules intestinales en se liant par son internaline à l'E-cadhérine des cellules épithéliales. M Lecuit et al.; Science 292 (01JUN01) 1722-1725. ###

Il semble qu'un seul acide aminé de la E-cadhérine, dont une proline en position 16 pour l'homme, confère la spécificité . La souris et le rat possèdent un glutamate à la place. On ne pouvait donc pas étudier chez ces rongeurs les souches pathogènes pour l'homme. Comme le hamster possède une proline en position 16, il est sensible aux souches humaines par voie orale. Les chercheurs ont, évidemment, créé des souris exprimant la E-cadhérine humaine qui deviennent sensibles par cette voie. Les auteurs ont raffiné le modèle pour que cette protéine ne soit exprimée que dans les cellules de l'intestin. Reste à expliquer comment l'internaline peut accéder à l'E-cahérine masquée entre les cellules de l'épithélium. Voir également le commentaire de BB Finlay; p. 1665-1667.

163 Une idée originale est de recouvrir de façon covalente les surfaces donnant lieu à une contamination par des bactéries aéroportées par du bromure de poly(4-vinyl-N-alkylpyridinium) qui tue les bactéries au contact. Ceci a été réalisé avec des verres organiques. JC Tiller et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 (22MAY01) 5981-5985. Il n'est pas évident que celà soit acceptable vu qu'il n'y a pas que les bactéries qui toucheraient ces films.

L'Environnement

164 Le numéro de Juin de Current Opinion in Biotechnology est traditionnellement consacré aux biotechnologies de l'environnement.

L'article de R Amann et al.; Current Opinion in Biotechnology 12 (JUN01) 231 236 décrit les apports de la technique FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) à la connaissance des communautés microbiennes des sols.

K Watanabe; p.237 241 (165) fait le tour des microorganismes utilisables dans ce domaine et souligne l'apport des techniques d'analyse moléculaire. La revue de M Shimao; p.242 247 après avoir fait le tour des plastiques biodégradables actuellement commercialisés traite de la dégradation des plastiques synthétiques ce qui n'est guère étudié en ce moment, et pourtant on en produit 140 millions de tonnes par an (voir plus loin).

Si les transformations microbiennes en anaérobiose sont moins prisées que celles en aérobiose, c'est qu'elles sont généralement plus lentes. Dans certains cas on n'a guère le choix. C'est vrai pour la déchloration, notamment du tétrachloréthène. Ce type de transformation, sous ses deux aspects, est traité dans la revue de DB Janssen et al.; p. 254- 258 qui collecte des données nouvelles sur la structure et la génétique des déhalogénases (voir le bulletin d'Août).

La bioremédiation des hydrocarbures doit être aérobie pour être complète. Les bactéries qui en sont capables ont été étudiées depuis le début du siècle dernier. Or les hydrocarbures saturés sont amassés en l'absence d'oxygène soluble dans les sols et l'oxygénation répétée des sites pollués augmente sensiblement le coût de l'opération. F Widdel et al.; p 259 276 rappellent la découverte de processus anaérobies au début des années 80s et discutent des données nouvelles sur ces voies après avoir rapidement décrit la production biologique et géochimique de ces hydrocarbures.

Il en est de même dans la revue sur les acquisitions récentes dans le domaine de la méthanisation par Y Sekiguchi et al.; p.277 282. Elle couvre plusieurs développements sur ces techniques anaérobies avec leurs diverses applications, notamment dans l'adaptation à des charges diverses et pour des températures d'entrée très variables, depuis quelques degrés pour les eaux usées urbaines jusqu'aux effluents des industries alimentaires, usuellement à haute température. La conception des réacteurs a une part importante dans le succès de certains d'entre eux et les réacteurs de type upflow anaerobic sludge blanket (UASB) ont l'air de bien se vendre. Mon impression est qu'on tourne quand même un peu en rond et que l'approfondissement de quelques modèles (aujourd'hui trop nombreux) permettrait, peut être de rationnaliser les procédés, notamment face à la diversité des situations pour un même produit, et aux mélanges que l'on veut traiter, ce qui ne veut pas dire que certains procédés empiriques ne sont pas recommandables.

165 La revue de K Watanabe; Current Opinion in Biotechnology 12 (JUN01) 237-241###, traite, de plusieurs thèmes des bioremédiations.

L'intérêt des méthanotrophes est non seulement d'oxyder le méthane, mais également de dépolluer le trichloréthylène (il faut induire les enzymes nécessaires par des injections de méthane, ce qui indique un co-métabolisme). L'auteur fait remarquer que l'oxydation du méthane par les méthanotrophes isolés du sol, et mesurée en laboratoire, est souvent plusieurs ordres de grandeur supérieure à celle observée avec les mêmes organismes dans le sol. On commence depuis quelques années à "pêcher" le plus de méthanotrophes possibles, soit avec des séquences d'identification neutres (ARN 16S) soit avec des sondes correspondant aux méthane monooxygénases..

La biodégradation des hydrocarbures marins est assurée surtout (dans des sols sableux au moins) par des a-Protéobactéries. Quand on enrichit avec des engrais de type agricole on constate la prolifération de g-Protéobactéries, notamment des Pseudomonas et desCycloclasticus. Dans l'eau de mer on observe une prolifération d'Alcanivorax , une a-Protéobactérie.

Dans le cas des nappes phréatiques les hydrocarbures persistent du fait de l'anaérobiose. Des associations syntrophiques classiques d'archées, Syntrophus oxydant les acides organiques en acétate et hydrogène et de Methanosaeta (engendrant du méthane à partir d'acétate et hydrogène) sont observées dans ce cas. Le fond de réservoirs sous-terrains collecte des e-Protéobactéries. Dans le cas d'une communauté dénitrifiante dégradant alkylbenzènes et n-alkanes, ce sont des Azoarcus/Thauera qui ont été caractérisés par la technique. C'est essentiellement les accepteurs d'électrons disponibles qui conditionnent la flore microbienne.

Dans le cas des hydrocarbures aromatiques polycycliques on retrouve les Burkholderia, Sphingomonas et Mycobacterium classiques. La flore dépend de la structure du sol et de la présence de surfactants.

On peut en conclure que si on connait un peu mieux la flore microbienne, on est loin d'une utilisation fiable in situ, soit avec la flore autochtone spontanée, aidée ou pas par l'addition d'engrais, soit par bioaugmentation (addition de souches spécialisées).

167 Phanerochaete chrysosporium, surtout mentionné à propos de la dégradation de la lignine, décompose également le TNT (Tri NitroToluène). Des chercheurs du National Research Council (NRC) du Canada et de National Defense Canada (D Rho et al.; Biotechnology & Bioengineering 73 (MAY01) 271 281) utilisent le champignon immobilisé sur un film non tissé de polyester en fed-batch et en continu dans un réacteur avec un tube central où l'air est injecté. Ils en sont cependant au stade 5 litres seulement. Le problème à résoudre est celui d'empêcher l'effet toxique du TNT et de ses métabolites. En fed-batch il faut injecter le TNT à très faibles doses, ce qui est rédhibitoire, en continu c'est encore pire, mais il doit y avoir des solutions. Si le Tween 80 améliore un peu l'efficacité, l'agitation orbitale la déprime.

168 On a souvent préconisé, dans des brevets, de mélanger les amidons, plus ou moins traités, avec d'autres polymères pour améliorer la qualité des biopolymères biodégradables. L'amidon, extrudé seul, doit contenir pas mal d'eau pour être déstructuré avant traitement, ce qui n'est pas souhaitable ultérieurement. On a donc cherché à remplacer l'eau par du glycérol. Mais les plastiques ainsi obtenus ne sont pas satisfaisants sur le plan mécanique et la résistance à l'eau est douteuse. On a donc mélangé l'amidon traité avec du polyéthylène et d'autres polymères thermoplastiques.

Bio-tec Biologische Naturverpackungen a obtenu deux brevets américains sur des combinaisons d'amidons thermoplastiques et des plastiques hydrophobes (ce qui permet une bonne résistance à l'eau) biodégradables comme des celluloses substituées, des polyesters et des protéines hydrophobes. Cela permet d'abaisser le prix de revient du plastique combiné et valorise à moindre coût des polymères biodégradables trop coûteux actuellement. Il s'agit des US Patents 6 214  907 (10APR01), déposé en septembre 98 sur le mélange et sa réalisation et 6 218 321 (17APR01), déposé en avril 2000, sur la filature du mélange. On trouvera dans ces deux brevets une analyse claire des autres procédés et les brevets correspondants.

169 Contrairement à une croyance générale, certains plastiques de synthèse sont biodégradables. C'est le cas des polycaprolactones (PCL) qui sont dégradés par une flore microbienne largement répandue. Ce sont des lipases et estérases bactériennes qui interviennent. Certains champignons phytopathogènes font intervenir leurs cutinases. C'est le cas de Fusarium solani dont les mutants de cutinase ne savent pas dépolymériser les PCLs. Ces enzymes sont inductibles par les produits d'hydrolyse de la cutine et des PCLs. Si on voulait les utiliser, il faudrait élargir leur spectre de substrat et les rendre exprimables en permanence.

Les polyuréthanes sont synthétisés par polyaddition de diisocyanate et sont des polymères complexes où le groupe uréthane n'est, en réalité, que peu présent. Il relie des polyesters ou des polyether polyalkylènes. Il est d'ailleurs inassimilable ou même dégradable par les bactéries. Ce sont les polyesters qui, attaqués par les lipases et estérases, peuvent être dégradés. Comamonas acidovorans TB 35 est même capable de s'en servir comme seule source de carbone mais laisse de côté les parties polyether et ne consomme que le polydiéthylèneglycol adipate, ce qui libère diéthylène glycol et acide adipique dans le milieu. Le gène de la lipase correspondante a été séquencé. La protéine possède trois domaines hydrophobes permettant l'adhérence sur le polymère et la triade classique du site catalytique des lipases.

Les polyvinylalcools (PVA) sont des polymères vinyliques dont le squelette est basé sur des liaisons carbone-carbone. Leur structure resemble à celle des polyéthylène, polypropylène et polystyrène ainsi que des polyacrylamides et acides polyacryliques. Ils sont solubles dans l'eau et servent de substituant d'amidon dans certains procédés industriels où leur thermoplasticité est utile. On le retrouve comme excipient dans des formulations de pesticides divers, ainsi que dans des engrais. Les PVAs sont cependant les seuls biodégradables. On connaît depuis 1973 une bactérie capable d'utiliser les PVAs, Pseudomonas 0 3, mais les bactéries de ce type sont rares dans l'environnement et ce sont toutes des Pseudomonas. La plupart ont besoin de pyrroloquinoline quinone (PQQ) pour officier. En réalité parmi celles qui ont été étudiées on constate qu'il s'agit de deux souches associées, inefficaces à l'état isolé. Pseudomonas sp. VM15C métabolise les PVAs, tandis que Pseudomonas putida VM15A fournit la pyrroloquinoline quinone. Le squelette carboné est clivé, soit par des déshydrogénases, soit par des oxydases, suivies d'hydrolases ou aldolases. La PQQ est nécessaire à la PVA déshydrogénase de VM15C. C'est également vrai pour Alcaligenes faecalis KK314.

Le nylon 66 et les fibres de nylon 6 sont attaquables par des champignons dégradant la lignine, comme Phanerochaete chrysosporium. Ce sont des observations qui n'ont pas été approfondies jusqu'à présent. M Shimao; Current Opinion in Biotechnology 12 (JUN01) 242 247.

170 Des chercheurs de Kansas State University étudient, eux, les mélanges plastiques à base d'amidon et d'acide polylactique obtenu par fermentation [US Patent 6 211 325 (03APR01)].

On mélange l'acide polylactique et l'amidon avec des composés diisocyanates comme diphénylméthylène diisocyanate, hexaméthylène diisocyanate, isophorone diisocyanate. On chauffe à 175 pendant au moins 2 minutes. La teneur en amidon peut varier de 1% à 70%.La taille des polylactides peut varier de 70 kDa à 140 kDa. La licence du procédé est libre pour l'instant, mais la seule source d'acide polylactique est Cargill Dow, Cargill fournissant l'acide lactique fermentaire. La commercialisation de l'acide polylactique pour des emballages a commencé au Japon.

171 Fortum Oil et Gas Oy, d'Espoo en Finlande ont breveté un procédé de polymérisation de polylactides qui évite les ennuis de mélange et l'évaporation du lactide. US Patent 6 214 967 (10APR01).

172 Metabolix, qui exploite les acquis de Monsanto sur les polyhydroxyalcanoates décrit dans l'US Patent 6 214 920 (10APR01) leur utilisation comme liants dans des poudres destinées au moulage.

174 Pseudomonas putida GPo1 (le Pseudomonas oleovorans GPo1, alias TF4-1L, ATCC 29347) fait intervenir les opérons alkBFGHJKL et alkST, qui permettent la conversion des alcanes en acides gras. Ils sont exprimés de façon convergente sur le plasmide OCT (car permettant de dégrader l'octane). Le groupe de Witholt à l'ETH de Zürich s'est intéressé depuis toujours à ce système

Le contenu G+C des gènes alk, plus bas que celui de souche porteuse, la présence de nombreuses cicatrices d’insertion indique qu'ils arrivent d'ailleurs. Tout indique qu'un élément mobile de 55 kb a été intégré dans le plasmide OCT et il est maintenant encadré par plusieurs séquences d'insertion complètes et incomplètes. C'est souvent le cas pour les plasmides cataboliques. JB van Beilen et al.; Microbiology 147 (JUN01) 1621-1630###.

176 L'enrichissement rapide d'un consortium de dégradation du pentachlorophénol (PCP) a été mis au point par des chercheurs canadiens. Ils ont couplé l'injection de PCP au dégagement de méthane. On arrive à augmenter de 30 fois la charge en PCP en 140 jours. Ce sont essentiellement des Clostridium et des Syntrophobacter/Syntrophomonas qui interviennent. On voit apparaître successivement 3,4,5-chlorophénol, 3,5-chlorophénol et 3-chlorophénol dans l'effluent. B Tartakovsky et al.; Biotechnology & Bioengineering 74 (20JUN01) 476-483.

177 AgTech Products a breveté sous l'US Patent 6 221 650 (24APR01) le traitement de lisiers pour en éliminer les nitrates et les mauvaises odeurs avec une association Propionibacterium acidipropionici dénitrifiant et des Bacillus sécrétant des protéases.

178 Maintenant que les considérations environnementales ont conduit à une pollution assez considérable aux Etats-Unis par l'additif méthyl tert-butyl ether (MTBE) des carburants, on se préoccupe vivement de l'éliminer. Une souche efficace, appelée PM1, minéralisant rapidement ce polluant, a été isolée d'un biofiltre. C'est un membre de la famille des Leptothrix. MA Bruns et al.; Environmental Microbiology 3 (MAR01) 220-225.

179 La première étude au champ de l'efficacité d'une Escherichia coli surexprimant l'atrazine chlorohydrolase AtzA vient d'être réalisée aux Etats-Unis pour décontaminer un champ pollué par cet herbicide. Par sécurité les bactéries étaient tuées chimiquement (ce qui revient à encapsuler l'enzyme par la paroi bactérienne). L'enzyme convertit l'atrazine en hydroxyatrazine (donc simplement déchlorée) non toxique pour les animaux et les plantes. L'efficacité a été mesurée avec la bactérie seule, avec un enrichissement en phosphates (300 ppm), et les deux combinés, face à un témoin. L'effet a été mesuré après 8 semaines de traitement, et il est significatif. La présence de substrats carbonés plus comestibles inhibe la dégradation LC Strong et al.; Environmental Microbiology 3 (FEB01) 91-98.

180 L'US Army finance des recherches à Engineering Technology d'Orlando en Floride.pour développer un produit à base de cyanobactéries destiné à renforcer les sols. Ceci est dû au fait qu'on lui fait reproche de détériorer les sols dans ses camps d'entraînement, avec lses tanks et autres véhicules lourds. L'US Patent 6 228 136 (08MAY01) couvre une partie de la technologie. Le procédé utilise des cyanobactéries cultivées (selon un procédé non dévoilé mais utilisant des films minces ou fixées sur des supports très divers (au lieu d'étangs profonds). Parmi les cyanobactéries le brevet cite comme exemple préférentiel Microcoleus vaginatus (mais celà ne signifie souvent pas grand chose). Industrial BioProcessing 23 (JUN01).