Lékařská fakulta, Masarykova Univerzita

I. Stavba jaterních metastáz CRC a Kmenové buňky

Cévní zásobení:

Pro pochopení možností léčby metastáz kolorektálního karcinomu je důležité znát jejich specifika, která mohou vést k selhání některých metod nebo naopak vývoji nových. Primární i sekundární nádory jater jsou až z 95% zásobeny převážně arteriální krví arteria hepatica (Meyers 2000). Do normálních jater se dostává asi 50% kyslíku portální krví, ale arteriální nutritivní zásobení tumoru jater je více než dvojnásobné proti zásobení portální krví. Selektivní arteriální ischemizace nádoru tedy může vést k jeho nekrotizaci (Dionigi 1997).

Aktivací celé kaskády angiogeneze dochází nejen k vytvoření nových kapilár a sítě v oblasti tumoru, ale působení chemotaxe a stimulace rozvíjí kolaterály a jakoby přitahuje cévy z okolí. Metastáza tak sice má hlavní tzv. feeding vessel, ale při jejím uzavření její funkci převezmou ostatní větve kolaterál (Obr.I-1).

Obr.I-1: DSA při embolizaci metastázy CRC do jater.

Efekt úplného uzavření, embolizace, kmene feeding vessel tak nevede k ischemizaci nádoru, ale k uzavření přístupové cesty k jeho následné léčbě. Proto se embolizační techniky zaměřují na embolizaci kapilár. Vyplnění sinusoid embolizačním materiálem vede navíc také ke snížení portálního prokrvení nádoru a tím k posílení efektu ischemizace. Dočasné uzavření hlavní tepny, například pomocí VesCoag (viz níže), může být dostatečné k zabránění wash-out fenoménu cytostatika při i.a. léčbě, nebo k zabránění krvácení při resekci.

Typy buněk a struktura metastázy:

Nádor, nebo i metastáza má charakter samostatné autonomní tkáně či orgánu. I kdyby jen rostl, byl by nejspíše schopen indukovat apoptózu zdravých buněk ve svém okolí. Vzhledem ke své postupně narůstající velikosti a vysokým energetickým nárokům vyžaduje větší průtok krve a své vlastní cévy (viz neoangiogeneze výše). Pouze asi 1-2mm slupka se obejde bez vlastních cév (Carmeliet 2000). K mechanické podpoře své struktury pak potřebuje vazivové stroma. Mechanismy řízení nejsou zcela jasné, může jít o over-expresi indukčních a růstových působků jako vedlejší produkt se zvýšenou expresí CDC genů. Může jít také o indukci ischémií – kyselým pH (v této souvislosti se zmiňuje také efekt laparoskopické chirurgie při insuflaci CO₂. Nicméně vzhledem k době působení a dosažených lokálních hodnot pH je tento efekt nejspíše přeceňován). Mezi jednotlivými faktory řídícími angiogenezi, migraci a diferenciaci stromatu není rovnováha. Nesouhra mezi VEGF a FGF, Angiopoetiny Ang1,2, a ostatními působky vede k insuficienci stromatu, s upřednostněním angiogeneze a migrace před vyzráváním elementů, dochází k produkci netypických kolegenů (Příloha I). Stěna novotvořených cév je prostupnější pro vodu – čehož se dá využít v diagnostice pomocí MRI difůze. Přílišná stimulace humorálními působky vede k indukci genetických změn v endoteliálních buňkách. Novotvořené cévy tak mohou být mozaikami v genetickém smyslu, a dokonce mohou obsahovat včleněné buňky nádoru, což dále může usnadňovat metastazování.

Zdá se, že metastáza obsahuje minimálně dvě skupiny privilegovaných buněk, které ale mohou splynout v jednu – jednak buňky privilegované svou polohou v periferii, jednak buňky privilegované svými biologickými vlastnostmi – nádorové kmenové buňky.

Periferně umístěné buňky zodpovídají za růst metastázy. Nejsou závislé na nově tvořené vaskulatuře – lze očekávat 1-2mm lem buněk živených difůzí z okolí. Mají vysokou aktivitu metaloproteináz, umožňují rozpouštět extracelulární matrix se zlepšením difůze kyslíku z okolí, vytvářejí cytokiny stimulující neoangiogenezi. Takto mohou tyto buňky zcela obejít efekt embolizace a ischemizace nádoru. Navíc čím nižší dodávka kyslíku krví k těmto buňkám, tím nižší také dodávka cytostatika. Je dokonce možné, že se tyto buňky vyhnou toxickým dávkám cytostatika úplně.

Kmenové Buňky:

Na základě dlouholetých klinických zkušeností, které jsou nyní podpořeny i nejnovějšími výzkumy v biologii nádoru, a dokonce částečně zpětně ověřenými v klinice, lze předpokládat existenci biologicky privilegovaných buněk, které jsou odpovědny za základní vlastnosti nádoru včetně růstu, odpovědi na léčbu a metastazování. Původně byly objeveny u myeloproliferativních onemocnění, kde je známo, že se jedná o klony buněk, a u nervových nádorů v souvislosti s výzkumem regenerace nervové tkáně. Nemusí se vůbec jednat o zcela homogenní skupinu. Biologicky jsou tyto kmenové buňky charakterizovány jako buňky, které jsou schopny autoreprodukce a produkce buněk, které se dále diferencují – dceřiných buněk nádoru. Podobně jako embryonální buňky mají nejspíše neomezenu dobu života. Po morfologické stránce je charakterizují podobné antigeny jako jiné fyziologické kmenové buňky organismu – CD 133, CD 117, CD 271 nebo CD 44. CD 133+ kmenové buňky tak již byly objeveny u nádorů mozku (Singh 2003,2004, Taylor 2005), karcinomu prostaty (Collins 2005), renálního tumoru (Florek 2005), ale také karcinomu tlustého střeva (O´Brien 2007, Ricci-Vittiani 2007). Mohou tvořit asi 2% buněčné populace nádoru a jsou charakterizované i nižší proliferační aktivitou (Ricci-Vittiani 2007). Typickým antigenem nádorových kmenových buněk kolorektálního karcinomu je CD 133. Tyto buňky neexprimují cytokeratin 20. Tuto schopnost získávají až diferencované buňky nádoru. Ne všechny CD 133+ buňky však jsou kmenové buňky nádoru. Zdá se, že i v nádoru existuje hierarchie kmenových buněk od pluripotentních s neomezenou schopností sebeobnovy, přes progenitorové buňky, které již neomezenou schopnost nemají, až po „obyčejné“ nádorové buňky.

Ve vývoji nádoru může dojít k transformaci v nádorovou kmenovou buňku jednak přímo z pluripotentní kmenové buňky, jednak i mutací progenitorových buněk. Progenitorové buňky již nemají na rozdíl od pluripotentních kmenových buněk potenciál sebeobnovy. Jejich mutace tak musí vézt k opětovnému získání této schopnosti (Obr.I-2 )(Al-Hajj 2004, Guo 2006, Kondo 2006, Nakano 2006, Oliver 2004, Wicha 2006).
Obr.I-2: Možné cesty vzniku nádorové kmenové buňky.


Nádorové kmenové buňky mohou dát vznik všem ostatním nádorovým buňkám, mohou tvořit subpopulaci nádorových buněk rezistentní vůči léčbě a mohou být nositelkami metastatického potenciálu. Tyto 3 skupiny buněk nemusí být identické (Jordan 2006). Zdá se, že terapie namířená jak proti kmenovým buňkám nádoru tak proti ostatním nádorovým buňkám by mohla mít větší šanci na léčebnou odpověď než současná terapie. A dokonce je možné, že při léčbě zaměřené jen proti kmenovým buňkám nebude ostatní nádor neomezeně růst a může dokonce spontánně regredovat. Problematické je identifikovat kmenové buňky nádoru tak, aby mohly být izolovány a mohly být zkoumány jejich vlastnosti. Musí být jasné, jak se nádorové kmenové buňky liší od ostatních kmenových buněk, jak je řízena jejich proliferace a jak odpovídají na inzulty. V ideálním případě pak bude možné využít tohoto specifika k cílené léčbě tak, aby nedošlo k poškození normálních kmenových buněk. Je nutné vědět, jakým mechanismem se kmenové buňky nádoru vyhnou účinkům terapie mířené na ostatní nádor. Kmenové buňky se nacházejí převážně v klidovém stavu stejně jako normální kmenové buňky a jejich metabolické nároky jsou tak výrazně nižší, než nároky ostatních nádorových buněk. To může vést k selhání léčby ischemizační nebo pomocí antimetabolitů. Také veškerá léčba zaměřená na rychle proliferující buňky může u kmenových buněk selhávat. Nádorové kmenové buňky také exprimují mnoho proteinů odpovědných za rezistenci k toxinům. Evoluční význam tohoto opatření je nejspíše v ochraně kmenových buněk před možným poškozením jednorázovými vnějšími vlivy, aby mohly následně regenerovat poškozené tkáně (Lowenberg 1998, Dean 2005, Gottesman 2002, Donnenberg 2005). Další odlišností nádorových kmenových buněk oproti norrnálním kmenovým buňkám může být v rozdílné reakci na poškození DNA. Zatímco zdravé kmenové buňky reagují na poškození DNA apoptózou, tato reakce může být u nádorových kmenových buněk potlačena (Cairns 2002, Wang 2006, Meng 2003). Při léčbě některými cytostatiky (alkylační činidla) tak může dojít k potlačení populace zdravých kmenových buněk, ale nikoli nádorových kmenových buněk.

Produkce cytokinů, Metabolické zvláštnosti:

Není jasné, zda produkce cytokinů je nějakým způsobem řízena, nebo jestli se jedná o vedlejší produkt over-exprese cdc genů. Není ani jasné, zda produkují cytokiny všechny buňky daného nádoru, nebo například jen buňky kmenové, či jiná specifická subpopulace buněk.

K udržení růstu samotného nádoru a k zajištění podpůrných tkání je potřeba, aby buňky nádorové exprimovaly faktory popsané výše v kapitole o růstu, metastazování a neo-angiogenezi – tedy VEGF, FGF, DLL4. Nově vytvořené cévy nádoru zvýšeně exprimují integriny _v₃.

Kromě růstově aktivních látek se však dostávají do okolí nebo i do systémové cirkulace antigeny, které nemusejí být přímo účastníky nádorového růstu, ale jsou známkou určitého stupně dediferenciace, tedy spuštění exprese u normálních buněk již uspaných genů. Sem patří i produkce onkomarkerů. Při overexpresi některých molekul typicky vázaných na membránu (ICAM, CEA) může docházet k jejich uvolňování do oběhu a tím je lze využít k diagnostice (onkomarkery – CEA, Ca 19-9). CEA jako fetální membránový antigen, který je po narození exprimován prakticky pouze nádorovými buňkami, může být užit k cílení léčby pomocí protilátek, popřípadě k zobrazení všech nádorových buněk v těle protilátkami buď s navázanými zářiči (pro scintigrafii) nebo např. s nanočásticemi obsahující oxidy železa k MRI vizualizaci (viz např. nanotechnologie níže). Velmi podobný je antigen 5T4 – který je také fyziologicky exprimován pouze fetálním trofoblastem. V dospělosti jej exprimují pouze nekteré solidní nádory. Toho se již dnes využívá ve vývoji vakcín (viz TroVax v pokrocích farmakoterapie níže). Přehled exprimovaných antigenů z nichž některé jsou detekovány jen v nádoru, některé jsou uvolňovány i do séra viz. tabulky v Dodatku 2.

Nádorové buňky mají vyšší intenzitu aerobní glykolýzy, jak bylo prokázáno již Warburgem před 70 lety. Mimo to je nádorovými buňkami ve zvýšené míře exprimován glukózový transportér GLUT1 (SLC2A1). Toto zvýšené vychytávání glukózy nádorovou tkání je využíváno v diagnostice FDG-PET. Po léčbě EGFR inhibitorem gefitinibem dochází k translokaci GLUT3 transportéru (SLC2A3) pro glukózu z buněčné membrány (Su 2006) do nitra buňky. Zvýšená glykolýza vede také ke zvýšené hladině laktátu uvnitř buněk, což může být detekováno například MRI spektroskopií.

Vysoká aktivita dělení buněk se odráží ve zvýšeném metabolismu nukleotidů a jejich vychytávání z okolí. Toho se využívá v PET diagnostice pomocí 2-¹¹C-tymidinu nebo 3´-deoxy-3´-¹⁸F- fluorotymidinu, které jsou nádorovou tymidinkinázou-1 fosforylovány a tak zachyceny v buňce, aniž by dále vstupovaly do syntézy nukleových kyselin. Na rozdíl od FDG není vychytávání tymidinu zvýšeno u zánětu (Gambhir 2002).

Nádorové buňky mají také rozdílný metabolismus aminokyselin a lipidů. Zvýšeně exprimují transportéry pro L-aminokyseliny (Jager 2001), čehož lze využít v PET diagnostice prokázáním zvýšeného uptake značených aminokyselin. V normální tkáni bývá acetát rychle oxidován až na CO2. V mnoha nádorových buňkách včetně kolorektálního karcinomu je volný acetát využit k syntéze mastných kyselin. Při dodávce acetátu značeného ¹¹C lze následně zářič identifikovat v nádorových buňkách (Yoshimoto 2001). Pro nádorové buňky je také typická zvýšená hladina syntézy fosfolipidů, především fosfatidylcholinu. Aktivita cholinkinázy, enzymu fosforylujícímu cholin, je v nádorových buňkách významně zvýšená. Také mutace ras genu zvyšují tuto aktivitu (Glunde 2006). Tyto metabolické rozdíly mohou být monitorovány MRI spektroskopií.
Morfologie po chemoterapii:

Chemoterapie mění morfologii zdravého jaterního parenchymu i metastáz. Je dobře známá toxicita oxaliplatiny (Rubbia-Brandt 2004) , která vede až k portální hypertenzi a ascitu (Tisman 2004). Po prodělané chemoterapii lze na základě histologického vyšetření rozeznat tyto možné obrazy (Obr.I-3) (Rubbia-Brandt 2007). Typ I odpovídá progresi, typ II obvykle stabilní chorobě. Typ III lze na základě zobrazovacích metod zařadit do skupiny částečné léčebné odpovědi. Typy IV a V se zobrazovacím metodám jeví často stejně – jako úplná odpověď na léčbu. Skutečná odpověď na léčbu (typ V) je však dosažena zřídka.

Obr.I-3: Typy odpovědi metastázy na chemoterapii. Šedá elipsa znamená původní ložisko, černé tečky označují oblasti s vitálními buňkami po chemoterapii.